一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列及其制备方法和应用与流程

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1.本发明属于微纳加工与制造技术领域，涉及一种微针阵列，尤其涉及一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列及其制备方法和应用。

背景技术：

2.微针阵列是指长度在100-1500微米之间的针状微结构有序排列所形成的阵列，其能够以无痛非侵入式的方式穿透组织，从而构建外界与组织之间的通道。随着微纳制造加工工艺的进步，具有不同形貌的微针阵列(如圆锥形、方锥形以及空心结构)都可以借助激光刻蚀、光刻、3d打印等手段被制备出来。大体上来讲，微针阵列可分成四类，即固体微针、涂层微针、可溶性微针和水凝胶微针，分别用于满足不同的应用需求。通过在微针阵列上装载药物分子、抗菌活性物质以及细胞等性功能分子，微针阵列可以通过经皮给药的方式进行。基于上述特性，微针阵列已经在美容、药物递送、疾病、及干细胞疗法等诸多传统或前沿领域得到了应用推广。近些年来，通过结合先进的检测手段，微针阵列在生物标记物检测领域也展现出巨大的应用潜力。
3.作为生化分析与检测领域中迅速发展起来的一项高新技术，微阵列型生物芯片主要通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析单元，以实现对生物组分的准确、快速、大信息量的检测。它能高效并行检测数以万计的生物分子相互作用，在临床诊断分析中占据着极其重要的地位。微阵列芯片的制备方法是将不同的探针分子固定到同一基片的不同位置上，并排列成有序的点阵。这样，每一种探针分子都拥有一个特定的坐标编码。检测时先将固定有探针分子的基片与临床待测样本接触，然后通过荧光检测方法确定靶分子存在与否，靶分子的种类通过坐标确定。微阵列芯片的特点是可以在几厘米的基片上固定数以万计的探针分子对生物分子进行并行检测，使巨大数目的生物分子信息获取成为可能。此外，生物芯片技术还极大地减少了多元分析中样本和试剂的用量，降低了检测成本。该技术已成功地被美国affymax等公司商业化。总体而言，微阵列型生物芯片技术由于其高通量、微型化及自动化等优点已经成为当代临床诊断分析最有效的手段之一。但是，目前现有的微针阵列存在吸附性能有限，从而导致在应用中稳定性差、实用性差等问题。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列及其制备方法和应用，其主要特征为该制备方法综合了自组装、光刻膜及模板复制等微纳加工技术，所得到的微针阵列的针尖和基底具有不同的浸润性，且针尖包裹有石墨烯气凝胶。这种制备方法具有高集成性和均一性，适合推广化生产；所制备的微针阵列具有优良的吸附特性，有利于核酸、蛋白等生物标记物的捕获和检测分析，具有良好的稳定性和实用性，前景广阔。
5.为实现上述目的，本发明提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方
法，具有这样的特征：包括以下步骤：
6.步骤一、将石墨烯溶液滴加在微针模板孔洞的下部，再滴加氯化钙溶液，使石墨烯成胶；
7.步骤二、对成胶的石墨烯进行冷冻干燥，得到石墨烯气凝胶；
8.步骤三、加入水凝胶预凝胶覆盖在微针模板孔洞内石墨烯气凝胶的上方，固化得到水凝胶；
9.步骤四、将疏水处理过的二氧化硅纳米粒子分散在基底材料预聚物中，得到疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液；
10.步骤五、将疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液添加到微针模板中，使其覆盖水凝胶针尖，固化形成基底，脱模后即得到异相浸润性微针阵列。
11.进一步，本发明提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，所述石墨烯溶液的浓度为20mg/ml；氯化钙溶液的质量分数为10％；石墨烯溶液与氯化钙溶液的体积比为1∶1。
12.进一步，本发明提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，冷冻干燥方法为先在-80℃过夜冷冻或者液氮速冻，随后于-40℃以下进行冷冻干燥过夜。
13.进一步，本发明提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中，所述水凝胶预凝胶为甲基丙烯酸酯明胶、聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基化透明质酸、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、甲基化海藻酸中的一种或多种；水凝胶预凝胶的固化方式为紫外光诱发固化，且水凝胶预凝胶中混有体积分数为1％的光交联剂。
14.进一步，本发明提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤四中，所述二氧化硅纳米粒子疏水处理的方式为：十八烷基三甲氧基硅烷或十七氟癸基三甲氧基硅烷修饰。
15.具体的为：将二氧化硅纳米粒子的乙醇溶液与十八烷基三甲氧基硅烷或十七氟癸基三甲氧基硅烷共同搅拌4小时，二氧化硅纳米粒子与十八烷基三甲氧基硅烷或十七氟癸基三甲氧基硅烷的用量比为40mg∶2μl。
16.进一步，本发明提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤四中，所述基底材料预聚物为三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或多种；疏水处理过的二氧化硅纳米粒子分散在基底材料预聚物中的方法为：对分散在乙醇中的二氧化硅纳米粒子进行疏水处理，然后置换到基底材料预聚物中，得到疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液；疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液中，二氧化硅纳米粒子的质量分数为40％。
17.进一步，本发明提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤五中，所述疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液的固化方式为紫外光照射，且疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液中混有体积分数为1％的光交联剂。
18.进一步，本发明提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，还可
以具有这样的特征：其中，步骤一中，滴加石墨烯溶液后，使其充分填充微针模板孔洞，然后吸走孔洞以外的石墨烯溶液；
19.步骤三中，加入水凝胶预凝胶后，使其充分填充微针模板孔洞并和石墨烯气凝胶充分接触，然后吸走孔洞以外的水凝胶预凝胶；
20.填充模板孔洞的方法为真空处理或离心。
21.本发明还提供上述制备方法制得的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列。异相浸润性微针阵列的针尖为圆锥形，针尖高度为300-1000微米，针尖底部直径为200-750微米，针与针间距为200-750微米。
22.本发明还提供上述具有吸附功能的异相浸润性微针阵列在生化分析与检测中的应用。
23.本发明的有益效果在于：
24.一、本发明开发的一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列，针尖具有亲水性，基底具有疏水性，有利于液体在针尖的富集并能有效消除基底背景的干扰，使每个针尖相当于一个独立的反应平台，从而有利于数字化分析与检测。
25.此外，针尖还包裹石墨烯气凝胶，进一步增强了该微针阵列对核酸、蛋白质等生物标记物分子的富集作用。具体的，石墨烯气凝胶同时继承了石墨烯的高吸附性能和气凝胶高比表面积、高孔隙率以及良好的机械强度等优点。与单纯使用石墨烯相比，在针尖填充石墨烯气凝胶增大了有效吸附面积，提高了生物标记物的富集效率；且针尖的力学性能更加稳定，有利于重复多次使用；更重要的是，石墨烯气凝胶仅填充在微针阵列的针尖部分，尤其是尖端部分，这可以进一步使得生物标记物主要富集在针尖部分而非整个微针阵列，从而更有利于消除基底的背景干扰。
26.该微针阵列的组成材料物理化学性质稳定，具有较好的机械强度，使用过程中稳定性好，不易变质。另外，该微针阵列既可用于在体的组织液分析，也可用于离体组织块或组织切片检测；既可以用于富集溶液中的生物标记物，又可以收集样本块中的靶标，实用性高，适用场景广泛，在生化分析与检测领域有广阔的应用前景。
27.二、本发明提供的一种异相浸润性微针阵列的制备方法，其综合集成了纳米粒子自组装、光诱导溶液-凝胶转变、基于互补模板的复制法等多种微纳加工技术。本制备方法基于不同加工技术的特点，充分发挥不同技术的优势，并将它们搭配起来形成有机的统一整体，具有高度的集成性。此外，本方法操作相对简单，制得的微针阵列均一性好，有望用于产业化批量生产，具有较高的市场和应用价值。另外，通过改变模板几何形状等外在条件，本方法可用于制造多种具有不同大小、形貌、材料组成的微针阵列，具有较好的通用性和推广性。
附图说明
28.图1是异相浸润性微针阵列的制备过程示意图，其中1为微针模板，2为石墨烯溶液，3为石墨烯气凝胶，4为水凝胶溶液，5为包含疏水二氧化硅纳米粒子的基底材料预聚物溶液，6为异相浸润性微针阵列；
29.图2是实施例2的异相浸润性微针阵列的形貌表征图；
30.图3是实施例2的异相浸润性微针阵列捕获溶液中荧光标记核酸分子的结果图；
31.图4是实施例2的异相浸润性微针阵列对裸鼠肿瘤组织游离dna进行捕获和检测的结果图。
具体实施方式
32.以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。实施例中未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
33.实施例1
34.本实施例提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列，其制备流程如图1所示，具体包括以下步骤：
35.步骤一、真空法填充石墨烯：先将20mg/ml浓度的石墨烯溶液滴加在微针模板孔洞的下部，然后开启真空泵，使石墨烯溶液充分填充微针模板的孔洞；吸走孔洞以外的石墨烯溶液，滴加等体积的质量分数为10％的氯化钙溶液，反应30分钟使石墨烯成胶；
36.步骤二、石墨烯气凝胶的制备：将孔洞内成胶的石墨烯置于-80℃冷冻过夜，再立刻放置于冻干机中，于-40℃以下进行冷冻干燥过夜，进而得到石墨烯气凝胶；
37.步骤三、聚乙二醇双丙烯酸酯针尖的固化：配置含体积分数60％的聚乙二醇双丙烯酸酯和体积分数1％的光交联剂的混合溶液(水凝胶预凝胶)，将其滴加在孔洞内的石墨烯气凝胶的上方，离心使其填充孔洞并和石墨烯气凝胶充分接触；吸走孔洞以外的混合溶液，365纳米波长的紫外光照射30秒，诱发固化得到水凝胶；
38.步骤四、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯基底材料的配置：将粒径为250纳米的二氧化硅纳米粒子的乙醇溶液和十七氟癸基三甲氧基硅烷(二氧化硅纳米粒子与十七氟癸基三甲氧基硅烷的用量比为40mg∶2μl)共同搅拌4小时进行疏水处理，随后向其中加入乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，震荡以充分混合；将混合溶液置于50℃烘箱过夜，蒸发乙醇；待乙醇完全蒸发后，加入体积分数1％的光交联剂，得到疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液；该疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液中，二氧化硅纳米粒子的最终质量分数为40％；
39.步骤五、微针阵列的获得：将上述疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液滴加到微针模板中，使其覆盖水凝胶针尖；静置5分钟后用365纳米波长的紫外光照射20秒，固化形成基底；脱模后即得到异相浸润性微针阵列。
40.该异相浸润性微针阵列的针尖高度为1000微米，针尖底部直径为750微米，针与针间距为750微米。
41.实施例2
42.本实施例提供一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列，其制备流程如图1所示，具体包括以下步骤：
43.步骤一、真空法填充石墨烯：先将20mg/ml浓度的石墨烯溶液滴加在微针模板孔洞的下部，然后开启真空泵，使石墨烯溶液充分填充微针模板的孔洞；吸走孔洞以外的石墨烯溶液，滴加等体积的质量分数为10％的氯化钙溶液，反应30分钟使石墨烯成胶；
44.步骤二、石墨烯气凝胶的制备：将孔洞内成胶的石墨烯置于液氮速冻，再立刻放置于冻干机中，于-40℃以下进行冷冻干燥过夜，进而得到石墨烯气凝胶；
45.步骤三、甲基丙烯酸酯明胶针尖的固化：配置含质量分数30％的甲基丙烯酸酯明胶和体积分数1％的光交联剂的混合溶液(水凝胶预凝胶)，将其滴加在孔洞内的石墨烯气凝胶的上方，真空处理使其填充孔洞并和石墨烯气凝胶充分接触；吸走孔洞以外的混合溶液，365纳米波长的紫外光照射1分钟，诱发固化得到水凝胶；
46.步骤四、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯基底材料的配置：将粒径为250纳米的二氧化硅纳米粒子的乙醇溶液和十八烷基三甲氧基硅烷(二氧化硅纳米粒子与十八烷基三甲氧基硅烷的用量比为40mg∶2μl)共同搅拌4小时进行疏水处理，随后向其中加入三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，震荡以充分混合；将混合溶液置于50℃烘箱过夜，蒸发乙醇；待乙醇完全蒸发后，加入体积分数1％的光交联剂，得到疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液；该疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液中，二氧化硅纳米粒子的最终质量分数为40％；
47.步骤五、微针阵列的获得：将上述疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液滴加到微针模板中，使其覆盖水凝胶针尖；静置5分钟后用365纳米波长的紫外光照射20秒，固化形成基底；脱模后即得到异相浸润性微针阵列，如图2所示。该异相浸润性微针阵列的针尖高度为300微米，针尖底部直径为200微米，针与针间距为200微米。
48.该异相浸润性微针阵列对荧光标记核酸分子的富集作用：将异相浸润性微针阵列浸泡在荧光标记核酸分子溶液中(荧光标记核酸分子的浓度为1000pm)，一起放置于37℃培养箱中共同孵育30分钟。之后，将微针阵列从荧光标记核酸分子溶液中取出，用吸水纸吸走微针阵列上残留的溶液。最后，用荧光显微镜观察并拍摄针尖的荧光图片，确定荧光标记核酸分子的捕获情况。荧光图片如图3所示。可以看出，异相浸润性微针阵列对荧光标记核酸分子具有富集作用。
49.该异相浸润性微针阵列对荧光标记核酸分子可用于生化分析与检测。
50.本实施例中，应用异相浸润性微针阵列对裸鼠肿瘤组织游离dna进行捕获和检测：
51.(1)裸鼠造模及肿瘤组织的获取：将200微升肿瘤细胞悬液(细胞密度为5
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107每毫升)注射到裸鼠腋窝附近的组织中。3天后裸鼠腋窝处生成肉眼可见的肿块，说明肿瘤模型的建立。将裸鼠生长3天的肿瘤组织与周围正常组织一起切除，用于检测。
52.(2)基于异相浸润性微针阵列和pcr技术的肿瘤检测：将获得的组织块按压在异相浸润性微针阵列上，一起放置于37℃培养箱中共同孵育30分钟。随后将组织块从微针阵列上取下，并将微针阵列倒扣在小皿中，皿中装有pcr引物和反应液。上机反应(pcr仪型号为：life technologies,2720thermal cycler)。待反应结束后，将微针阵列取出，用吸水纸吸走微针阵列上残留的溶液。最后，用荧光显微镜观察并拍摄针尖的荧光图片，确定检测结果。荧光图片如图4所示，针尖有明显荧光信号，说明了肿瘤组织中游离dna的成功捕获和检测。

技术特征：

1.一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、将石墨烯溶液滴加在微针模板孔洞的下部，再滴加氯化钙溶液，使石墨烯成胶；步骤二、对成胶的石墨烯进行冷冻干燥，得到石墨烯气凝胶；步骤三、加入水凝胶预凝胶覆盖在微针模板孔洞内石墨烯气凝胶的上方，固化得到水凝胶；步骤四、将疏水处理过的二氧化硅纳米粒子分散在基底材料预聚物中，得到疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液；步骤五、将疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液添加到微针模板中，使其覆盖水凝胶针尖，固化形成基底，脱模后即得到异相浸润性微针阵列。2.根据权利要求1所述的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，其特征在于：其中，步骤一中，所述石墨烯溶液的浓度为20mg/ml；氯化钙溶液的质量分数为10％；石墨烯溶液与氯化钙溶液的体积比为1∶1。3.根据权利要求1所述的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，其特征在于：其中，步骤二中，冷冻干燥方法为先在-80℃过夜冷冻或者液氮速冻，随后于-40℃以下进行冷冻干燥过夜。4.根据权利要求1所述的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，其特征在于：其中，步骤三中，所述水凝胶预凝胶为甲基丙烯酸酯明胶、聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基化透明质酸、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、甲基化海藻酸中的一种或多种；水凝胶预凝胶的固化方式为紫外光诱发固化，且水凝胶预凝胶中混有体积分数为1％的光交联剂。5.根据权利要求1所述的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，其特征在于：其中，步骤四中，所述二氧化硅纳米粒子疏水处理的方式为：十八烷基三甲氧基硅烷或十七氟癸基三甲氧基硅烷修饰。6.根据权利要求5所述的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，其特征在于：其中，步骤四中，所述基底材料预聚物为三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或多种；疏水处理过的二氧化硅纳米粒子分散在基底材料预聚物中的方法为：对分散在乙醇中的二氧化硅纳米粒子进行疏水处理，然后置换到基底材料预聚物中，得到疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液；疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液中，二氧化硅纳米粒子的质量分数为40％。7.根据权利要求6所述的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，其特征在
于：其中，步骤五中，所述疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液的固化方式为紫外光照射，且疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液中混有体积分数为1％的光交联剂。8.根据权利要求1所述的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列的制备方法，其特征在于：其中，步骤一中，滴加石墨烯溶液后，使其充分填充微针模板孔洞，然后吸走孔洞以外的石墨烯溶液；步骤三中，加入水凝胶预凝胶后，使其充分填充微针模板孔洞并和石墨烯气凝胶充分接触，然后吸走孔洞以外的水凝胶预凝胶；填充模板孔洞的方法为真空处理或离心。9.如权利要求1-8任意一项所述制备方法制得的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列。10.如权利要求9所述的具有吸附功能的异相浸润性微针阵列在生化分析与检测中的应用。

技术总结

本发明公开了一种具有吸附功能的异相浸润性微针阵列及其制备方法和应用，制备方法为：步骤一、将石墨烯溶液滴加在微针模板孔洞中，并使其成胶；步骤二、对成胶的石墨烯进行冷冻干燥，得到石墨烯气凝胶；步骤三、加入水凝胶预凝胶覆盖在微针模板孔洞内石墨烯气凝胶上，固化得到水凝胶；步骤四、将疏水处理过的二氧化硅纳米粒子分散在基底材料预聚物中；步骤五、将疏水二氧化硅纳米粒子基底材料预聚物溶液添加到微针模板中，覆盖水凝胶针尖，固化形成基底，脱模后即得到异相浸润性微针阵列。本发明提供的制备方法创新性强、集成性高、均一性好、适合工业化量产，所制备的微针阵列实用性强、功能性高、稳定性好、在生化检测和分析领域前景广阔。域前景广阔。域前景广阔。