一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体QKMA-9A10及应用的制作方法

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一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10及应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10及应用。

背景技术：

2.枯草芽孢杆菌纤溶酶是一种分子量在27kd左右纤溶蛋白酶，口服和注射给药可用于人体内血栓疾病的。其中包括枯草芽孢杆菌纳豆菌bacillus subtilisnatto发酵产生的纳豆激酶。枯草芽孢杆菌bacillus subtilis qk02发酵可产生一种与纳豆激酶高度同源的蛋白酶，subtilisin qk，命名为纤溶酶qk。试验证明与已有的临床溶栓药物相比，纤溶酶qk具有更强的溶栓特异性，更高的溶栓活性，更低的出血风险低。开发溶栓药物具有巨大的应用前景。但是，开发溶栓药物需要做系统而全面的药代动力学和毒代动力学。而药物代谢动力学试验的前提是要建立稳定可靠检测方法。对于蛋白药物的检测，首当其冲的是基于单克隆抗体抗体的elisa检测方法。枯草芽孢杆菌纤溶酶qk单克隆抗体不仅可应用于枯草芽孢杆菌纤溶酶的特异性定量检测，还可用于药物开发的鉴定试验。同时还可与枯草芽孢杆菌纤溶酶进行融合表，开发靶向溶栓药物。此外，纳豆激酶作为一种枯草芽孢杆菌纤溶酶，可口服发挥溶栓功效。起源于与日本的功能食品纳豆中含有纳豆激酶成分。我国也是纳豆相关产品的消费大国。但是，目前纳豆市场鱼龙混杂，真假难辨。主要原因之一便是没有统一的且特异性的检测鉴定方法。只是依靠纤维蛋白平板的方法通过纤溶圈的大小评估溶栓活性。此方法不仅误差很大，而且不具备特异性和专属性。单克隆抗体的应用可以特意鉴别枯草芽孢杆菌纤溶酶，且可以可靠的定量检测蛋白含量。因此，本领域迫切需要研制一种单克隆抗体，用于枯草芽孢杆菌纤溶酶的鉴别和检测。

技术实现要素：

3.本发明的目的在于提出一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体 qkma-9a10及应用，本发明抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10 可以用于组织化学法，酶联免疫法和免疫印迹法在枯草芽孢杆菌纤溶酶的鉴别和检测以及融合表达以及靶向药物的制备中。
4.本发明的技术方案是这样实现的：
5.本发明提供一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，所述抗体包括重链和轻链，其重链的编码氨基酸序列如seq id no：1所示；其轻链的编码氨基酸序列如seq id no：2所示。
6.作为本发明的进一步改进，所述重链包含重链可变区vh，轻链包含轻链可变区vl；其中，重链可变区vh氨基酸序列为seq id no：1中的第1-120位，轻链可变区vl氨基酸序列为seq id no：2中的第1-106位。
7.作为本发明的进一步改进，所述vh和vl抗原决定簇互补决定区cdr由 cdr1、cdr2、cdr3组成，其中：
no:c2021306，分类命名为“大鼠单克隆杂交瘤细胞株qkma-9a10”，保藏日期为2021年12月13日。
25.本发明提供一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，所述抗体包括重链和轻链，其重链的编码氨基酸序列如seq id no：1所示；其轻链的编码氨基酸序列如seq id no：2所示，所述重链包含重链可变区vh，轻链包含轻链可变区vl；其中，重链可变区vh氨基酸序列为seq id no：1中的第1-120位，轻链可变区vl氨基酸序列为seq id no：2中的第1-106位。
26.所述vh和vl抗原决定簇互补决定区cdr由cdr1、cdr2、cdr3组成，其中：
27.vh-cdr1的氨基酸序列为seq id no:3中的第27-34位，序列为glypheserleuthrthrtyrhis；
28.vh-cdr2的氨基酸序列为seq id no:3中的第51-57位，序列为mettrpasnasnglyaspthr；
29.vh-cdr3的氨基酸序列为seq id no:3中的第96-109位，序列为alaargglμglyphelysseraspserhisvalmetaspala；
30.vl-cdr1的氨基酸序列为seq id no:4中的第26-31位，序列为glnasnileasnlystyr；
31.vl-cdr2的氨基酸序列为seq id no:4中的第50-52位，序列为histhrasn；
32.vl-cdr3的氨基酸序列为seq id no:4中的第89-96位，序列为 leμglnhisasnserleutrpthr。
33.实施例1：抗枯草芽孢杆菌纤溶酶qk单克隆抗体制备和纯化
34.1、抗原制备
35.枯草芽孢杆菌纤溶酶qk抗原为本公司生产纯化，4℃包被过夜，纯度大于 95％。
36.2、动物免疫
37.5-8周龄balb/c小鼠6只，8周龄wistar大鼠4只。第一次主注射使用弗氏完全佐剂，以后加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后注射。背部多点注射。主注射100μg抗原/只实验鼠，加强注射50μg抗原/只实验鼠。
38.3、细胞融合与杂交瘤细胞克隆
39.融合前一周，复苏sp2/0细胞，正常培养至对数期。选定要融合的大鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数。按1:5的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用hat dmem完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2hat完全培养基，第8天换1/2ht培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。细胞融合结果：融合后用hat选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。吸取细胞上清100μl/孔进行间接elisa检测。根据elisa 结果，判断阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加ht dmem培养基培养，7天左右在显微镜下观察，间接elisa检测有克隆生长的孔，取od值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细
胞，并扩大培养。
40.4、单克隆抗体制备与纯化
41.将上述阳性细胞扩大培养并注射至免疫缺陷的balb/c小鼠裸鼠(经弗氏不完全佐剂至敏)的腹腔，7-10日可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水。将上述细胞的腹水，进行纯化，纯化后抗体纯度大于90％。proteina/g柱亲和纯化(igg1，igg2a，igg2b，igg3亚型抗体鉴定)。腹水离心，吸出淡黄液体计算体积。将proteina/g填料装入重力纯化柱内，用pbs洗涤三次，每次用10x柱体积的pbs。将腹水装入柱子内，4℃温和混匀3 小时。放出流穿液，备用。用pbs洗涤proteina/g填料三次，用预冷的ph3.0 hcl-glycine洗脱液洗脱抗体，收集下的抗体立即用10
×
pbs中和液中和。检测抗体浓度，合并高浓度收集管。装洗脱下的浓度较高的抗体。对pbs透析，4℃透析过夜。检测浓度纯度后，调整浓度至2mg/ml。
42.实施例2：单克隆抗体对抗原枯草芽孢杆菌纤溶酶qk的免疫特异性检测
43.1、聚丙烯酰胺凝胶的制备
44.1)配制浓度为15％的分离胶溶液：依次加入去离子水2.3ml、30％丙烯酰胺 5ml、ph8.8的tris 2.5ml、10％过硫酸铵100μl、10％sds 100μl、temed 6μl (加入temed后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀)；
45.2)迅速在两玻璃板的间隙中加入分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间，小心地在分离胶溶液上覆盖—层异丙醇；
46.3)分离胶聚合完全后，尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体；
47.4)配制浓度为5％的浓缩胶溶液：依次加入去离子水2.7ml、30％丙烯酰胺 670μl、ph8.8的tris 500μl、10％过硫酸铵40μl、10％sds 40μl、temed 6μl (加入temed后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀)；
48.5)快速在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子(小心避免混入气泡)；
49.6)浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，向电泳槽内加入蛋白质电泳缓冲液。
50.2、样品的制备
51.1)细胞培养并收集细胞至15ml离心管，2000rpm离心5分钟，去上清；
52.2)培养基洗两遍，2000rpm离心5分钟，去上清；
53.3)收集细胞后加入1ml pbs，0.1％np40，冰上裂解10分钟；
54.4)10000rpm离心5分钟，取上清，加入等体积2
×
loading buffer，沸水煮5 分钟，分装后-20℃保存。
55.3、电泳
56.1)把需检测的样品(10μl)和2
×
(或者6
×
)loading buffer(10μl)混合，用移液慢慢将15μl混合物加至样品槽中，预染maker加10μl；
57.2)打开电源，采用200v的电压，电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部；
58.3)切断电源，取出凝胶，用r250考马斯亮蓝浸泡凝胶染，沸水煮5分钟；
59.4)取出染的凝胶，用自来水浸泡凝胶脱，沸水煮约20分钟，观察脱后的蛋白质条带。
60.4、转膜
61.1)取胶后讲胶剪成适当大小并浸入转膜buffer中；
62.2)将pvdf膜浸泡于甲醇1分钟后转入转膜buffer中，将滤纸也浸入转膜 buffer中(pvdf膜和滤纸均剪成与胶相同大小)；
63.3)用转膜buffer淋洗石墨电极，铺两张滤纸，滴少许转膜buffer；
64.4)铺上膜，滴少许转膜buffer；铺上胶，再滴少许转膜buffer；
65.5)最后铺两张滤纸，滴少许转膜buffer；
66.5)盖上电极，电压调至最大，以1.5ma/cm2凝胶体积转膜1.5小时(负载电压不宜超过1v/cm2)。
67.5、封闭
68.1)将膜取出，pbst洗三次，150rpm摇床振荡，每次5分钟；
69.2)将膜取出，浸没于封闭液中37℃，2小时或4℃过夜(封闭液为1％酪蛋白或2％ova)。
70.6、结合抗体
71.1)将膜取出，pbst洗三次，150rpm摇床振荡，每次5分钟；
72.2)将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的一抗稀释液中，37℃，1小时(一抗稀释1：1000)；
73.3)将膜取出，pbst洗三次，150rpm摇床振荡，每次5分钟；
74.4)将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的二抗抗稀释液中，37℃，1小时；
75.5)羊抗小鼠-hrp 1：3000-1：5000，羊抗兔-hrp 1:10000。
76.7、曝光
77.1)将a、b发光液等比例稀释混合(各500ml)，将膜至于保鲜膜上，ab 混合液均匀滴至膜上，盖上保鲜膜，静止1分钟；
78.2)打开保鲜膜，用滤纸吸干表面残留液体，至于保鲜膜内固定于暗盒中；
79.3)将暗盒至于暗室中，取出胶片迅速至于暗盒内膜上，关闭暗盒，根据所见荧光强度曝光(曝光时间为1分钟，若条带较弱可选择压片过夜)；
80.4)打开暗盒，取出胶片立即完全侵入显影液中1分钟。
81.实施例3：单克隆抗体对抗原枯草芽孢杆菌纤溶酶qk的双抗夹心elisa检测。
82.1、夹心elisa方法
83.1)包被抗体：取大鼠抗qkma-9a10(本公司另外一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶qk单克隆抗体)，qkma-9a10兔抗，用cbs缓冲液按1：100稀释成工作液，100μl/孔，37℃包被2小时；
84.2)封闭：5％nonfat milk，300μl/孔，37℃封闭1小时；
85.3)抗原稀释：取c1145天然蛋白(0.95mg/ml)，100μl/孔，37℃反应2小时；
86.4)检测抗体：取大鼠单抗qkma-9a10、qkma-9a10兔抗，均按1：100稀释，100μl/孔，37℃反应1小时；
87.5)二抗：取goat anti-rat/rabbit hrp，按1：5000稀释，100μl/孔，37℃反应30分钟；
88.6)显：取tmb a液和b液，等体积混合后，100μl/孔，室温反应20分钟；
89.7)终止：取终止液2m h2so4，50μl/孔，450nm读板。
90.2、夹心elisa标准曲线测定
91.1)包被抗体：取c1250-2#兔抗，用cbs缓冲液按1：50稀释成工作液，100μl/ 孔，37℃包被2小时；
92.2)封闭：5％nonfat milk，300μl/孔，37℃封闭1小时；
93.3)抗原稀释：取c1145天然蛋白(0.95mg/ml)，按1：1000起始稀释，后续做连续倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2小时；
94.4)检测抗体：取大鼠单抗1g4-1和9a10，均按1：50稀释，100μl/孔，37℃反应1小时；
95.5)二抗：取goat anti-rat hrp，按1：5000稀释，100μl/孔，37℃反应30 分钟；
96.6)显：取tmb a液和b液，等体积混合后，100μl/孔，室温反应20分钟；
97.7)终止：取终止液2m h2so4，50μl/孔加样，450nm读板。
98.3、试验结果
99.通过建立标准曲线，单抗qkma-1g41、qkma-9a10作为双抗夹心检测，线性和拟合曲线符合标准。
100.实施例4：单克隆抗体序列测定
101.1、培养杂交瘤细胞。复苏杂交瘤细胞株后培养，待细胞数扩增至约1
×
107时，1000rpm x 5分钟，离心收集细胞。
102.2、提取细胞rna。超净工作台环境下，将1ml trizol试剂加入离心细胞，静置5分钟，加入氯仿2ml，剧烈摇晃15秒，室温静置3分钟，12000rpm
×
15 分钟，移取上层水样层至新的ep管，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟。 12000rpm
×
10分钟。弃上清，加入1ml 75％乙醇，7500rpm
×
5分钟，干燥沉淀，加入50μl双蒸水。琼脂糖电泳鉴定纯度并定量，保存于-70℃备用。
103.3、反转录制备cdna。细胞总rna1μl，rnase free ddh2o 6μl，oligo dtprimer 0.5μl，prime script rt enzyme mix i 0.5μl，5x prime script buffer 2μl，混匀，37℃15分钟，85℃5秒。
104.4、扩增cdna。用设计的小鼠igg vh vl引物库，分别扩增上述cdna。 5x prime star buffer 10μl，dntp 4μl，cdna 1μl，上游引物1μl，下游引物1μl， primestar 0.5μl，补水至50μl。按以下反应条件进行pcr反应:94℃温育5分钟，94℃变性45秒，63℃退火45秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸 10分钟。
105.5、琼脂糖凝胶电泳及胶回收与测序。将上述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果，将扩增产物送交测序。得到其重链的核苷酸序列如seq id no： 3所示；其轻链的核苷酸序列如seq id no：4所示；其重链的编码氨基酸序列如seq id no：1所示；其轻链的编码氨基酸序列如seq id no：2所示。
106.上述经鉴定的杂交瘤细胞系于2021年12月13日保藏于国家典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏号为cctcc no:c2021306，命名为抗枯草芽孢杆菌纤溶酶单克隆抗体qkma-9a10细胞株。
107.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，所述抗体包括重链和轻链，其特征在于，其重链的编码氨基酸序列如seq id no：1所示；其轻链的编码氨基酸序列如seq id no：2所示。2.根据权利要求1所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，其特征在于，所述重链包含重链可变区vh，轻链包含轻链可变区vl；其中，重链可变区vh氨基酸序列为seq id no：1中的第1-120位，轻链可变区vl氨基酸序列为seq id no：2中的第1-106位。3.权利要求2所述所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，其特征在于，所述vh和vl抗原决定簇互补决定区cdr由cdr1、cdr2、cdr3组成，其中：vh-cdr1的氨基酸序列为seq id no:3中的第27-34位，序列为glypheserleuthrthrtyrhis；vh-cdr2的氨基酸序列为seq id no:3中的第51-57位，序列为mettrpasnasnglyaspthr；vh-cdr3的氨基酸序列为seq id no:3中的第96-109位，序列为alaargglμglyphelysseraspserhisvalmetaspala；vl-cdr1的氨基酸序列为seq id no:4中的第26-31位，序列为glnasnileasnlystyr；vl-cdr2的氨基酸序列为seq id no:4中的第50-52位，序列为histhrasn；vl-cdr3的氨基酸序列为seq id no:4中的第89-96位，序列为leμglnhisasnserleutrpthr。4.权利要求1所述所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，其特征在于，其重链的核苷酸序列如seq id no：3所示；其轻链的核苷酸序列如seq id no：4所示。5.根据权利要求1所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，其特征在于，所述抗体为小鼠igg1亚型单克隆抗体。6.根据权利要求1所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌纤溶酶由菌种bacillus subtilis qk02发酵制得，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no:m 203078。7.根据权利要求1所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌纤溶酶包括纤溶酶qk和纳豆激酶。8.一种如权利要求1-7任一项所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10在枯草芽孢杆菌纤溶酶的鉴别和检测中的应用。9.一种如权利要求1-7任一项所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10在枯草芽孢杆菌纤溶酶的融合表达以及靶向药物的制备中的应用。10.一种如权利要求1-7任一项所述抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体qkma-9a10杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no:c2021306。

技术总结

本发明提出了一种抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体QKMA-9A10及应用，属于基因工程技术领域。所述抗体包括重链和轻链，其重链的编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其轻链的编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明抗枯草芽孢杆菌纤溶酶的单克隆抗体QKMA-9A10可以用于组织化学法，酶联免疫法和免疫印迹法在枯草芽孢杆菌纤溶酶的鉴别和检测以及融合表达以及靶向药物的制备中。达以及靶向药物的制备中。