彭亚会，高学军，刘营
东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨（150030）
E-mail：pyhui7856@sina
摘要：对直投式酸奶发酵剂的制备工艺中的关键技术进行研究，在超浓缩培养基的筛选中利用脱脂乳代替乳酸菌所需的氮源部分，可以大大降低生产成本，并通过正交试验筛选出三株菌的最优的冻干保护剂配方，本研究结果将为我国工厂化生产质地优良的直投式酸奶发酵剂提供最佳且廉价的培养基组合。 关键词：乳酸菌，直投式发酵剂，增菌培养基，冻干保护剂
中图分类号：Q933 文献标识码：A
直投式酸奶发酵剂（Direct Vat Set, DVS）是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻或冷冻干燥发酵剂菌种，每克活菌数在1011个以上，在生产酸奶或发酵乳制品时可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作[1]。直投式发酵剂使用方法快捷经济，使用量少，易于贮存，降低噬菌体的污染的可能，所发酵产品性质稳定、香味清新、口感爽滑、且货架期长，是生产优质酸奶的关键因素。它的生产和应用促使酸乳和其它发酵乳制品生产专业化、社会化、规范化和统一化。
本实验根据对实验室保存的乳酸菌菌株超浓缩培养基以及冻干保护剂进行优化，筛选出最佳的成本低廉的超浓缩培养基及冻干保护剂配方，制备出性能优良的且生产成本较低的新型直投式酸奶发酵剂，以期为我国进一步直投式酸奶发酵剂的产业化提供理论依据及技术参数。
1. 材料与方法
滚动转子式压缩机1.1材料
1.1.1实验材料
本实验室保藏的乳酸菌单菌株（嗜热链球菌1株，以下简称乳球菌；保加利亚乳酸杆菌2株，以下简称杆菌1和杆菌2）。麦芽汁（青岛啤酒集团）；番茄汁（本实验室自制）；脱脂乳粉。
1.1.2培养基
复壮培养基（乳球菌和乳杆菌分别采用液体M17培养基和液体MRS培养基）；乳球菌液体超浓缩培养基组；杆菌1液体超浓缩培养基；杆菌2液体超浓缩培养基见文献[2]。
1.1.3仪器设备
BIOF-2005型发酵罐，FD-1B-55型冷冻干燥机，高压灭菌器，超净工作台，恒温培养箱，恒温震荡器。
1.2方法
1本课题得到黑龙江省人事厅博士后基金项目(LRB00084)的资助。
1.2.1直投式发酵剂DVS超浓缩培养基的筛选
低噪音风机箱
ggtv5利用脱脂乳代替原培养基中的大豆蛋白胨、水解乳蛋白及蛋白胨等氮源极大的降低生产成本，易于产
业化。优化的直投式发酵剂乳球菌超浓缩培养基以实验室已筛选的乳球菌液体超浓缩培养基为基础进行单因素筛选，用脱脂乳同时取代大豆蛋白胨和水解乳蛋白两种成分，设五个处理S1、S2、S3、S4、S5和对照SCK；优化的直投式发酵剂杆菌1、杆菌2超浓缩培养基分别以实验室已筛选的杆菌1和杆菌2液体超浓缩培养基为基础进行单因素筛选，用脱脂乳取代蛋白胨，分别设五个处理，杆菌1的五个处理为LB11、LB12、LB13、 LB14、 LB15和杆菌1对照 LB1CK，杆菌2的五个处理为LB21、LB22、LB23、 LB24、 LB25和杆菌2对照LB2CK，其中乳球菌的对照组为原实验室已筛选的乳球菌液体超浓缩培养基，杆菌1和杆菌2的对照组为原实验室已筛选的杆菌1液体超浓缩培养基和杆菌2液体超浓缩培养基。
1.2.2冻干保护剂的筛选
乳酸菌若直接进行冷冻干燥，死亡率将达到90%以上，因此选择合适的冻干保护剂至关重要。保护剂能够取代水和蛋白质的结合，保证了蛋白质的稳定性，防止冻干时胞内胞外冰晶的形成。同时，保护剂还可将菌体包裹其中，减少菌体与氧接触，降低细胞代谢，选择保护剂是制备直投式酸奶发酵剂的一项关键技术[1]。
通过正交试验设计L9(34)筛选三株菌各自的最优冻干保护剂组分并进行冻干试验。将离心后的湿菌体和各自的冻干保护剂按1：2的比例混匀后装入冻干瓶中，先于—20℃预冻2h 后，再放入冷冻干燥机
中进行冷冻干燥18h，冻干后成粉末状态。将3种冻干粉分别溶解0.5h 后在光学显微镜下观察形态并测出三种菌株冻干粉的活菌数，从而计算三种菌株地存活率，每个菌株各做3个平行，取平均值作为数据结果。
2. 结果与分析
2.1直投式发酵剂超浓缩培养基的筛选
表2-1 脱脂乳代替三株乳酸菌超浓缩培养基中的氮源试验结果
Tab.2-1 The effect of skimmed milk replacing nitrogen source of three lactic acid bacteria super-concentration
culture medium
粽子机
处理脱脂乳
(%)
活菌数
（×1010cfu/ml）
处理
脱脂乳
(%)
活菌数
（×1010cfu/ml）
处理
脱脂
乳
(%)
活菌数
（×1010cfu/ml）
S1 2.0 9.51d LB11 1.0 1.65e LB21 1.0 0.69d S2 2.5 9.89c LB12 1.5 1.75c LB22 1.5 0.79c S3 3.0 10.35a LB13 2.0 1.79b LB23 2.0 0.95b S4 3.5 9.25e LB14 2.5 1.88a LB24 2.5 1.14a S5 4.0 8.97f LB15 3.0 1.71d LB25 3.0 0.81c SCK 0 10.10b LB1CK0 1.61f
LB2CK0 0.81c 注：表中小写字母表示5%差异显著水平。
由表2-1可以看出用脱脂乳代替乳球菌超浓缩培养基中的氮源，乳球菌中各个处理之间达到显著水平，其中S3比其它四个处理及对照SCK的活菌数均高，镜检观察乳球菌的活力强，说明利用脱脂乳可以代替乳球菌所需的氮源，由试验可得出乳球菌液体超浓缩培养基组分为：乳糖1.5％、葡萄糖0.25％、脱脂乳3.0％、酵母浸粉1.5％、盐溶液3.5％、维生素C
0.15%、赖氨酸0.1％、谷氨酸0.05％、精氨酸0.05％、麦芽汁5％、番茄汁5%；用脱脂乳代替杆菌1超浓缩培养基中的氮源，杆菌1中各个处理之间达到显著水平，其中五个处理均比对照（LB1CK）的活菌数高，且处理LB14活菌数最高，比对照（LB1CK）提高了16.8%，由此可得出杆菌1液体超浓缩
培养基组分为脱脂乳2.5% 、牛肉粉1% 、酵母浸粉0.75% 、葡萄糖2.25%、柠檬酸二铵2.25‰ 、硫酸氢二钾1.5‰ 、乙酸钠6‰ 、MgSO4·7H2O 0.48‰ 、MnSO4·4H2O 0.35‰、0.05％的谷氨酸、5％的番茄汁、8％的麦芽汁；用脱脂乳代替杆菌2超浓缩培养基中的氮源，处理LB23、LB24与LB2CK、LB21、LB2差异显著，分别比对照活菌数提高了38.3%和17.3%，由此可得出LB24可作为杆菌2液体超浓缩培养基的最佳组分，该其培养基组成为脱脂乳2.5% 、牛肉粉1.25% 、酵母浸粉0.5% 、葡萄糖2.25%、柠檬酸二铵2.25‰ 、硫酸氢二钾1.5‰ 、乙酸钠6‰ 、MgSO4·7H2O 0.48‰ 、MnSO4·4H2O 0.35‰、0.05％的谷氨酸、4％的番茄汁、10％的麦芽汁。
2.2菌株的冻干保护剂的筛选
2.2.1 乳球菌冻干保护剂的筛选
表2 -2 乳球菌冻干保护剂的正交试验结果L9（34）
Tab.2-2 The effects of galactococcus freeze-dried protectant L9（34）
因素
试验号
脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖
活菌数
耐老化测试(×1010cfu/g)
活菌率
（%）
1 1(4%)
1(2%)
1(1.5%)1(0.5%)59.2 58.7
2 1(4%)
2(3%)
2(2.0%)2(1.0%)61.1 60.6
3 1(4%)
3(4%)
3(2.5%)3(1.5%)63.9 63.4
4 2(5%)
1(2%)
2(2.0%)3(1.5%)64.2 63.7
5 2(5%)
2(3%)
3(2.5%)1(0.5%)65.8 65.2
6 2(5%)
3(4%)
1(1.5%)2(1.0%)57.9 57.4
7 3(6%)
1(2%)
3(2.5%)2(1.0%)70.6 70.0
8 3(6%)
2(3%)
1(1.5%)3(1.5%)56.2 55.7
9 3(6%)
3(4%)
2(2.0%)1(0.5%)58.9 58.4
表2-3 乳球菌冻干保护剂的正交试验极差分析结果
Tab.2-3 The analytic results of range of galactococcus freeze-dried protectant
活菌数(×1010cfu/g) 活菌率（%）脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖
K1 61.4 64.7 57.8 61.3 60.9 64.157.3 60.8
K2 62.6 61 61.4 63.2 62.1 60.560.9 62.7
K3 61.9 60.2 66.8 61.4 61.4 59.766.2 60.9
R 1.23 4.43 9 1.9 1.2 4.4 8.93 1.9 由表2-2、表2-3可以看出，乳糖和蔗糖对乳球菌冻干粉的活菌数和活菌率影响大，其
中乳糖影响最大，而脱脂乳影响最小。综合以上指标可以得出脱脂乳2蔗糖1乳糖3葡萄糖2的
活菌数最大，活菌率最高，说明此组组合的冻干保护剂的保护效果最佳。以此组合做验证试验，验证试验结果活菌数为70.8×1010cfu/g，活菌率为70.2%。由此可以看出验证实验结
果高于试验7号组合，说明用正交试验优选出的最佳组合符合实际情况，因此确定乳球菌的
冻干保护剂的最优组合为5%脱脂乳、2%蔗糖、2.5%乳糖、1.0%葡萄糖。2.2.2杆菌1冻干保护剂的筛选
表2-4乳杆菌1冻干保护剂的正交试验结果L9（34）
Tab.2-4 The effects of Bacterium lacticum 1 freeze-dried protectant L9（34）
因素
试验号
脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖
活菌数
(×1010cfu/g)
活菌率
（%）
1 1(3%)
1(4%)
1(1.5%)
1(0.5%) 18.7 76.1
2 1(3%)
2(5%)
2(2.0%)
2(1.0%) 12.7 51.7
3 1(3%)
3(6%)
3(2.5%)
3(1.5%) 10.0 40.7
4 2(4%)
1(4%)
2(2.0%)
3(1.5%) 14.8 60.2
5 2(4%)
2(5%)
3(2.5%)
1(0.5%) 18.3 74.5
6 2(4%)
3(6%)
1(1.5%)
led镜前灯2(1.0%) 13.6 55.3
7 3(5%)
1(4%)
3(2.5%)
2(1.0%) 19.8 80.5
8 3(5%)
2(5%)
1(1.5%)
3(1.5%) 15.5 63.1
9 3(5%)
3(6%)
2(2.0%)
1(0.5%) 12.4 50.5
表2-5杆菌1冻干保护剂的正交实验极差分析结果
Tab.2-5 The analytic results of range of Bacterium lacticum 1freeze-dried protectant
菌数(×1010cfu/g) 活菌率（%）
脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖
K1 13.8 17.77 15.93 16.47 56.17 72.27 64.83 67.03
K2 15.57 15.5 13.3 15.37 63.33 63.1 54.13 62.5
K3 15.9 12 16.03 13.43 64.7 48.83 65.23 54.67
R 2.1 5.8 2.7 3 8.53 23.43 11.1 12.37 由表2-4、表2-5可以看出，蔗糖和葡萄糖对杆菌1冻干粉的活菌数和活菌率影响较大，
其中蔗糖影响最大，而脱脂乳影响最小。综合以上指标可以得出脱脂乳3蔗糖1乳糖3葡萄糖1的
活菌数最大，活菌率最高，说明此组组合的冻干保护剂的保护效果最佳。以此组合做验证试
验，验证试验结果活菌数为20.1×1010cfu/g，活菌率为81.7%，由此可以看出验证结果高
于试验7号组合，说明用正交试验优选出的最佳组合符合实际情况，因此确定杆菌1冻干保
护剂的最优组合为5%脱脂乳、4%蔗糖、2.5%乳糖、0.5%葡萄糖。
2.2.3杆菌2冻干保护剂的筛选
由表2-6、表2-7可以看出，脱脂乳和葡萄糖对冻干粉的活菌数和活菌率影响大，其中
脱脂乳影响最大，而蔗糖影响最小。综合以上指标可以得出脱脂乳1蔗糖1乳糖3葡萄糖3的活
菌数最大，活菌率最高，说明此组组合的冻干保护剂的保护效果最佳。以此组合做验证试验，
验证试验结果活菌数为24.3×1010cfu/g，活菌率为83.5%,，由此可以看出验证结果高于试验
3号组合，说明用正交试验优选出的最佳组合符合实际情况，因此确定杆菌2冻干保护剂的
最优组合为3%脱脂乳、2%蔗糖、1.5%乳糖、2.0%葡萄糖。
通过以上试验可得出，球菌最优保护剂配方为脱5%脱脂乳、2%蔗糖、2.5%乳糖、1.0%葡
萄糖；杆菌1最优保护剂配方为5%脱脂乳、4%蔗糖、2.5%乳糖、0.5%葡萄糖；杆菌2最
优冻干保护剂配方为3%脱脂乳、2%蔗糖、1.5%乳糖、2.0%葡萄糖。
表2-6 杆菌2冻干保护剂的正交试验结果L9（34）
Tab.2-6 The effects of Bacterium lacticum 2 freeze-dried protectant L9（34）
因素
试验号
脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖
活菌数
(×10P10cfu/g)
活菌率
（%）
1 1(3%) 1(2%)
1(0.5%)1（1.0%）19.2 66.1
2 1(3%) 2(3%)
2(1.0%)2(1.5%) 21.1 72.6
3 1(3%) 3(4%)
3(1.5%)3(2.0%) 24.0 82.6
4 2(4%) 1(2%)
2(1.0%)3(2.0%) 14.9 51.2
5 2(4%) 2(3%)
3(1.5%)1（1.0%）11.3 38.9
6 2(4%) 3(4%)
1(0.5%)2(1.5%) 11.5 39.6
7 3(5%) 1(2%)
3(1.5%)2(1.5%) 11.7 40.3
8 3(5%) 2(3%)
1(0.5%)3(2.0%) 9.9 34.1
9 3(5%) 3(4%)
2(1.0%)1（1.0%）10.1 34.8
表2-7 杆菌2冻干保护剂的正交实验极差分析结果
Tab.2-7 The analytic results of range of Bacterium lacticum 2 freeze-dried protectant
活菌数(×1010cfu/g) 活菌率（%）
脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖脱脂乳蔗糖乳糖葡萄糖
K1 21.4 15.3 13.5 13.5 73.8 52.5 46.6 46.6
K2 12.6 14.1 15.4 14.8 43.2 48.5 52.9 50.8
K3 10.6 15.2 15.7 16.3 36.4 52.3 53.9 56.0
R 10.9 1.2 2.1 2.7 37.4 4 7.3 9.4 3. 结论
通过对三株菌的超浓缩培养基进行优化，得出三株菌的最佳优化培养基组合，为直投式
酸奶发酵剂的工业化生产提高理论依据。对三株菌的冻干保护剂进行筛选，所获得的产品的
活菌数达到1011cfu以上，活菌率均达到70%以上，符合国外同类产品的标准。
参考文献
[1]吴荣荣, 张柏林．直投式酸奶发酵剂的商品化生产研究[J]．中国乳品工业，2005，33(12):8～12．
[2] 刘营，高学军，彭亚会．直投式酸奶发酵剂的制备[J]．中国科技论文在线www.paper.edu, 2005, 03-28．
[3]张建友, 赵培城 , 徐静波 , 霍贵成．真空冷冻干燥酸奶发酵剂的研究现状[J]．河南工业大学学报(自然科学版)， 2005，26(2):86～89．
Optimizing enrichment medium and bolting of freeze-dry
protectants in Direct Vat Set
Peng Yahui, Gao Xuejun, Liu Ying
Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural University,
Harbin, China (150030)
Abstract
With regard to study key technique of preparing DVS, skimmed milk replacing nitrogen source of lactic acid bacteria which sharply degraded cost during optimizing super-concentration culture medium. Prescription of optimalizing freeze-dried protectant of three lactic acid bacteria was selected by orthogonal experiment. The experiment results will provide optimizing and low-cost culture medium prescription for producing superordinary DVS in the factory of China.
Keywords: Lactic Acid Bacteria, Direct Vat Set(DVS), Enrichment Medium, Freeze-dried Protectant
作者简介：
彭亚会，女，1976年生，硕士研究生，从事生物化学与分子生物学方面的研究，E-mail：pyhui7856@sina；
高学军，通讯作者，男，1969年生，教授，从事生物化学与分子生物学方向的研究，E-mail：gaoxj5390@sina。
