刘夫国;马翠翠;王迪;高彦祥
【摘 要】植物多酚因其独特的化学结构而具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌、抗病毒等多种生理功能,在农业、食品、医药等领域得到了广泛应用.多酚可以与蛋白质形成复合物从而导致2种化合物的结构、功能和营养特性的变化.影响蛋白质与多酚非共价相互作用的因素包括温度、pH、蛋白质的类型和浓度,以及酚类化合物的类型和结构.与非共价相互作用相比,蛋白质与多酚共价相互作用将不可逆地改变2种分子的理化性质和功能特性.文中介绍了蛋白质和多酚之间相互作用的生化机制,讨论了用于研究蛋白质与多酚相互作用的方法及所面临的主要挑战.同时,指出了分析蛋白质-多酚产物应考虑的主要问题.长效连续捕鼠器
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2016(042)002
【总页数】7页(P282-288)
【关键词】蛋白质;多酚;相互作用;机理;功能特性
【作 者】刘夫国;马翠翠;王迪;高彦祥
【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083
【正文语种】三板模中 文
led工矿灯melenled酚类化合物是植物体内一类最重要的次生代谢产物，具有较强的抗氧化作用，以及明显的抑菌、抗癌、抗衰老和抑制胆固醇升高等功效。摄取一定量的植物多酚能够有效地预防和抑制疾病的发生。随着现代分离提取技术的迅猛发展，大量植物多酚已从植物中分离鉴定出来。科学研究表明，多元酚结构具有独特的理化性质，如能与蛋白质、多糖、生物碱等结合，能与金属离子络合，具有还原性，能清除羟自由基等[1]。在食品加工及人体消化过程中，多酚能与多种化合物发生相互作用，其中蛋白质是最主要的化合物。 蛋白质与多酚通过可逆和不可逆的方式发生相互作用。可逆的复合过程通常涉及非共价相互作用，而大分子和多酚之间形成共价键的过程是不可逆的。共价复合物的形成主要源于
多酚的氧化和亲核加成过程。但是，在多数情况下，共价和非共价相互作用可能同时发生，例如绿原酸与蛋白质的结合[2-3]。本文将重点介绍蛋白质与多酚的相互作用、蛋白质与多酚相互作用的潜在机制及相互作用对蛋白质和多酚性质的影响。
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蛋白质是生命存在和运动的物质基础，是高度复杂的聚合物。自然界中，生物体内的蛋白质由20种结构不同的氨基酸组成。蛋白质的结构和功能的不同主要取决于氨基酸的种类、数量、排列顺序和肽链的空间结构。在食品体系中，蛋白质能够与其他食品组分复合，例如多糖和多酚等，复合方式包括共价与非共价相互作用，如图1所示。研究表明，蛋白质与多酚相互作用会引起蛋白质的二级和三级结构发生改变，溶解性降低而热稳定性可能会提高[4]。
多酚类化合物是植物中一组化学物质统称，通常含有羟基基团连接苯环的结构，常见的多酚化合物如图2所示。多酚可分为两大类：一类是多酚单体，即非聚合物，包括各种黄酮类化合物、绿原酸类、没食子酸和鞣花酸，也包括一些接有糖苷基的复合类多酚化合物(如芸香苷等)；另一类则是由单体聚合而成的低聚体或多聚体，统称单宁类物质，包括缩合型单宁中原花青素和水解型单宁中没食子单宁和鞣花单宁等。
多酚与蛋白质非共价和共价相互作用是2个影响富含多酚食品品质的根本因素。在加工食品中，多酚与大分子非共价相互作用主要源于弱结合，即氢键和疏水性相互作用的结果。同时，由于含酚羟基的化学结构，多酚具有高反应活性，它们很容易经过酶和非酶途径被氧化，形成邻醌或邻半醌，与蛋白质的氨基酸侧链基团发生反应。 蛋白质与多酚非共价键的作用包括疏水相互作用、氢键、范德华力等。虽然非共价相互作用很弱(一般小于10 kJ/mol，比通常的共价键键能小1～2个数量级)，作用范围为0.3～0.5 nm，但这些分子间弱相互作用力可在一定条件下起协同作用，形成具有一定方向性和选择性的强作用力[5]。 例如啤酒、葡萄酒、茶饮料、果蔬汁等在销售期间容易形成混浊，严重影响到产品的质量和货架期，而蛋白质与多酚非共价相互作用即是引起混浊或沉淀最常见、最重要的原因之一[6]。由于多酚分子结构的多样性及蛋白质分子中存在多种不同功能基团，原则上氢键、疏水键、共价键都可能发生于蛋白质与多酚的相互作用中。至于共价键的形成则是一个不可逆变化过程，而许多由冷却造成的混浊当重新加热后又会部分或全部溶解，这表明在蛋白质与多酚的相互作用中没有共价键合[6]。
2.1 分析方法
为了探究蛋白质-多酚的相互作用和形成复合物的性质，在分子水平上认知蛋白质与多酚体系是非常重要的。蛋白质与多酚的非共价相互作用主要通过3种方法来进行研究：直接研究溶液中蛋白质与多酚形成的复合物；通过多酚来沉淀蛋白质；间接研究蛋白质与多酚相互作用对蛋白质活性(主要是酶)造成的影响[4]。由于蛋白质-多酚的相互作用较为复杂，没有单一的技术能提供全面的信息，一般通过多种技术进行表征。这些技术包括荧光光谱、圆二光谱、傅立叶变换红外(FTIR)光谱、动态光散射(DLS)、等温滴定量热法(ITC)、核磁共振、平衡透析法、浊度测定法、蛋白质沉淀法、体积排阻谱和亲和谱等，表1描述了这些方法的优缺点。
2.2 非共价相互作用机理及影响因素
蛋白质与多酚的相互作用受到蛋白质和多酚的结构、相对浓度、溶剂组成以及溶液参数(pH、离子强度、温度等)的影响[7]。所有这些因素可以用来解释蛋白质与多酚相互作用的机理。溶剂组成对蛋白质和单宁相互作用的影响表明，复合物的形成主要源于氢键和疏水相互作用[8]。疏水相互作用被认为是蛋白质与多酚相互作用最主要的驱动力，氢键会进一步加强这种作用。疏水相互作用主要是由多酚的芳香环和蛋白质的疏水位点引起的，如脯
pst168氨酸残基的吡咯环。氢键主要发生在蛋白质的氢原子受体位点和多酚的羟基基团上；其他的相互作用比如离子键主要发生在蛋白质带正电的基团(如赖氨酸的ε-氨基基团)和多酚带负电的羟基基团上[4]。
氢键和疏水键都受温度的影响，因此，在蛋白质和多酚形成非共价复合物的过程中，温度是重要因素之一。SASTRY等[9]研究指出，温度显著影响葵花籽11S蛋白与绿原酸的结合。当温度从30 ℃增加到45 ℃，葵花籽11S蛋白与绿原酸的结合能力显著降低，在55℃下无相互作用力。Prigent等[10]研究了在5 、25和60 ℃条件下牛血清白蛋白(BSA)与绿原酸非共价相互作用，结果表明，随着温度的增加，两者结合能力降低。
pH也是影响蛋白质与多酚非共价相互作用的重要因素之一。在低于蛋白质等电点0.3～3.1时，蛋白质-多酚非共价复合物的溶解度最低[11]。低pH值时，蛋白质有更多的结合位点，蛋白质和多酚的结合程度较大。在pH≤7条件下，绿原酸能够与BSA、溶菌酶和α-乳清蛋白非共价结合，当pH值较低时，绿原酸与BSA结合量较多[2]。在较高pH值条件下，由于绿原酸被氧化形成自由基或醌类化合物，绿原酸和蛋白质的共价结合能力也较强[3]。
多酚和蛋白质的相对浓度也会影响两者的相互作用。当一种蛋白质和一种多酚以各种比例
混合时，可能会出现以下现象：如果蛋白质浓度保持恒定，随着多酚添加量的增加，混浊形成量先是增加，到达一个最大值后开始下降；同样，如果多酚添加量保持不变，改变蛋白质浓度，混浊形成量的变化具有类似的趋势。Siebert等[12]采用模型解释了这种现象。如图3所示，假设蛋白质含有固定数目的多酚结合位点，同时多酚含有2个能与蛋白质结合的末端，当末端数目与蛋白质的结合位点数相等时，此时就会形成很大的网状结构，产生较大的胶体粒子和最强的光散射。当蛋白质含量高于多酚含量，如啤酒体系，每个多酚可以桥连2个蛋白质分子，但是蛋白质不能连接到其他蛋白质上，因此形成蛋白质二聚体结构，产生少量混浊。当多酚含量超过蛋白质含量，如苹果汁体系，几乎所有的蛋白质的结合位点都被多酚所占据。因此，只被结合了一个末端的多酚分子很难在另一个蛋白质上到合适的位点而把2个蛋白质连起来，同样也只是形成很小的胶体粒子。该模型能够预测蛋白质与多酚浓度增加时溶液体系浊度的变化。例如，当单宁酸与BSA相互作用时，过度增加BSA的含量，不溶复合物出现溶解现象[13]。
此外，多酚和蛋白质结构也影响两者的结合[14]。多酚含有大量的酚羟基使其具有一定的亲水性，在水中以胶体形式存在。而低亲水性多酚能与蛋白质发生强烈的相互作用，同时多酚分子质量越高，越能有效地沉淀蛋白质。蛋白质与多酚结合取决于蛋白质的分子大小
、二级和三级结构、表面疏水性及氨基酸的组成。一般来说，具有高碱性残基含量、高脯氨酸含量、分子质量较大、疏水性较强，且结构展开的蛋白质更易与多酚发生非共价相互作用[4]。
酚类化合物具有较高的反应活性，许多多酚都能够被氧化成其相应的半醌和醌，它们能够与亲核试剂发生共价反应，如蛋白质的侧链赖氨酸或半胱氨酸基团[15]。在食品加工中(例如热处理)，醌的形成是一个重要因素，它可能成为分子相互反应的底物。例如阿魏酸或香豆酸被氧化形成半醌，然后通过自由基可参与非酶反应，包括聚合及分解反应等[16]。反应的先决条件是产生亲电物质，进行亲核(迈克尔型Michael-type)加成[15]。一般来讲，反应的酚类化合物结构越复杂，反应产物越复杂。
由于反应产物难以拆分，因此蛋白质-多酚共价复合物的分析具有一定的挑战性。目前，多采用理化方法和光谱特征相结合的方法来分析反应产物。
3.1 分析方法
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研究蛋白质与多酚反应产物时，可采用理化分析或质谱分析。理化分析方法集中于评价修
饰的氨基酸，分析酚类化合物结合程度或者评价2种化合物性质的变化。质谱分析常常用于鉴定蛋白质特定的结合位点。目前2种方法仍有一定的局限性，其主要原因在于：(1)反应产物结构复杂；(2)蛋白质以及酚类化合物在反应后仍然能保持一定的活性。
3.1.1 理化分析方法
评价蛋白质反应程度最简单的方法是分析反应前后氨基酸侧链的变化。因此可以通过分析氨基酸组成，或通过简单的比法来完成。例如采用三硝基苯磺酸测定游离氨基的变化。研究表明，与不同植物多酚共价结合后，乳清蛋白的游离氨基含量显著下降[17]。同时可以通过荧光法来分析巯基含量的变化。与游离氨基基团的分析类似，蛋白质与多酚共价反应会导致游离巯基基团下降[18]。荧光测量也可用于氨酸修饰的变化。在295 nm处激发的氨酸是唯一吸收荧光的芳香族氨基酸，通常可在320 nm和390 nm之间发射荧光。因此采用荧光测定可以表征氨酸基团的荧光淬灭。为了证实形成的键是共价键，常在含8 mol/L尿素的条件下测定氨酸荧光的变化(排除非共价相互作用)。
同时，可以通过测定多酚含量来分析多酚与蛋白质的共价结合，常用的方法有：(1)通过福林酚法测定结合的酚酸含量；(2)通过碱水解获得酚酸底物。另外可以利用紫外可见吸收光
谱表征蛋白质-多酚复合物来确定结合的多酚[19]。
