2006年11月November 2006
谱
Chi nese J our nal of Chromatogra phy
Vol.24No.6
555～559
收稿日期:2006207210
第一作者：杨新磊，男，硕士研究生,E 2mail :yangxinlei16@163.
通讯联系人：罗明标，男，博士，教授，从事环境分析研究,Tel :(0794)8258320,E 2mail :mbluo @126.基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.20505003)和江西省自然科学基金资助项目(No.0520002). 三相中空纤维式液相微萃取用于快速富集血浆中的尼古丁 杨新磊, 罗明标, 唐毓萍
(东华理工学院核资源与环境教育部重点实验室，江西南昌330013) 摘要：建立了一种以三相中空纤维式液相微萃取(TP 2HF 2L PM E )进行样品前处理，采用高效液相谱快速、准确测 定血浆中尼古丁含量的方法。研究表明该方法集萃取、富集、净化为一步，极大地简化了传统血浆成分测定的前处理过程，是一种快速、有效、绿的前处理方法。方法的线性范围为011～50mg/L ，相关系数(r 2)为019996，检测限为0105mg/L (信噪比为3)，相对标准偏差小于5%。
关键词：液相微萃取；样品前处理；高效液相谱；尼古丁；血浆中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2006)0620555205 栏目类别：研究论文
E nrichment of Nicotine in Plasma with Three 2Phase H ollow Fiber
B ased Liquid Phase Microextraction
YAN G Xinlei ,L UO Mingbiao ,TAN G Yuping
(Key Laboratory of Nuclear Resources and Environment of Ministry of Education ,East
China Institute of Technology ,Nanchang 330013,China )
Abstract :A novel met hod for fast determination of nicotine in plasma was established by using high performance liquid chromatograp hy (H PL C )coupled wit h a t hree 2p hase hollow fiber based liquid p hase microextraction (TP 2H F 2L PM E )technique for sample preparation.The microex 2t ractio n was mediated by t he p H difference between t he environment inside and out side of an or 2ganic p hase immobilized in t he pores formed in t he wall of a polypropylene hollow fiber.The p H value of t he medium out side t he organic p hase was adjusted by adding a dilute KO H solution to form a basic donor p hase while t he p H value of t he inner media was set to p H 3to form an accep 2tor p hase using a 10mmol/L KH 2PO 4solution.On working conditions ,neut ral nicotine mole 2cules were firstly ext racted f rom t he original sample solution to t he organic p hase ,and t hen t he analyte was ext racted f rom t he organic p hase to t he acceptor p hase.After described extraction time ,4μL of acceptor p hase was wit hdrawn and directly injected into HPL C system for analysis.Parameters related to TP 2HF 2L PM E (organic solvent ,p H of acceptor and donor p hase ,stirring rate ,salt effect ,met hanol co ntent in acceptor p hase and ext raction time )were also optimized ex 2perimentally.The p ropo sed met hod integrates extraction ,enrichment and clean 2up into a single step ,dramatically simplifying t he t raditional p rocedure to p repare a liquid sample wit h complex mat rices such as plasma.It has been demonstrated to be a very fast ,effective and virt ually
“green ”sample p reparation technique ,which p rovided a good linear range (0.1-50mg/L )wit h r 2
of 019996,a low detection limit (0.05mg/L ,S/N =3)and a satisfactory relative standard
deviation (<5%
).K ey w ords :liquid p hase microextraction ;sample p reparation ;high performance liquid chroma 2tograp hy (H PL C );nicotine ;plasma
快速、简单、成本低廉、环境友好的样品前处理技术一直是分析化学领域研究的焦点[1]，微型化的液液萃取方法一经提出，立刻受到广大分析工作者
的普遍关注。液相微萃取(liquid p hase microex 2t raction ,L PM E )[2-3]技术就是这种微型化液液萃取方法的典型代表。它通过一根微量进样器针尖来悬
谱第24卷
挂萃取剂[4]或一根内径600μm、壁厚200μm、孔径012μm聚丙烯中空纤维的壁孔和空腔固定有机溶剂[5]完成萃取，不仅提高了富集倍数，还减少了有机溶剂的使用。尤其是中空纤维式的液相微萃取方法不仅可以很好地保证有机溶剂在萃取过程中不会脱落，而且012μm的微孔直径可以阻止复杂基体中大
分子的进入，起到很好的净化作用。这些优点使得中空纤维式液相微萃取模型成功地用于唾液、血浆、尿样[6-10]以及土壤溶液[11]和环境水样[12-14]中不同组分的萃取、浓缩，极大地简化了传统的样品前处理过程。
生物样品中不同组分的测定不仅可以直接反映这些组分与生物体的关系，还可直观地反映周边环境对生物体的影响；但是生物样品基体的复杂性以及很多组分在生物样品中的含量很低且易发生变化，这些一直困扰分析工作者的测定。人体血浆中尼古丁含量的测定便是困扰分析工作者的问题之一。虽然现代谱仪器可以在短时间内完成对尼古丁及其代谢物的分离和定量[15-17]，但是传统的样品前处理过程需要先用合适的有机溶剂萃取，分层后取有机相在惰性气体保护下吹干，再用合适的溶剂溶解残渣后才能进样分析[15-16,18-21]。前处理过程繁琐、耗时、成本高，且处理时间往往超过尼古丁在血浆中的半衰期(1～2h)[16]而导致无法准确测定。本文将L PM E技术用于人体血浆中尼古丁的萃取浓缩，大大缩短了样品前处理的时间，克服了传统样品前处理过程中的诸多弊端，效果令人满意。
1 萃取原理及萃取程序
1.1 萃取原理
三相液相微萃取是一种集萃取2反萃取于一步的萃取方法，主要适用于液相谱[5,10,22-23]。样品(给出相)中的目标分析物首先被萃取到中空纤维壁孔固定的有机薄膜中，再被反萃取到空腔内的水溶
液(接收相)中，抽回接收相直接进样分析，无须进一步的处理。萃取效率与目标分析物在给出相和接收相中的溶解度、有机溶剂的萃取能力以及萃取条件有关。
1.2 萃取程序
首先将中空纤维切成213～215cm的小段，放入丙酮中超声清洗15s以除去杂质；晾干后取一段放入待用的有机萃取剂中超声浸泡10s，以使中空纤维壁孔中注满有机溶剂，再将其套在25μL微量进样器(已吸入20μL接收相)的针尖上，推出接收相，另一端用热钳子封住，使中空纤维的有效长度保持2cm(约盛5μL接收相)；按图1固定,
萃取一定
图1 液相微萃取装置图
Fig.1 S ch em atic diagram of liquid ph ase microextraction
时间后取出，剪开封住的一端，抽回接收相，取4μL 直接进行高效液相谱(HPL C)测定。
2 实验部分
2.1 主要仪器及试剂
高效液相谱仪(Waters600，配有UV2487检测器)，超越2000谱工作站(浙江省科学器材进出口有限责任公司),Accurel Q3/2聚丙烯中空纤维(Membrana Gmb H,Wuppertal，德国；壁厚200μm，孔径012μm，内径600μm)，尼古丁(气相谱纯，纯度大于98%M ER K2Schuchardt),H PL C级甲醇和丙酮(天津科密欧化学试剂开发中心)，其他试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。
2.2 谱条件
谱柱:Atlantis dC18(5μm,416mm i.d.×250mm)；流动相:10mmol/L KH2PO42甲醇2三乙胺(体积比
为90∶10∶011)，以H3PO4调p H至215；流速:016mL/min；检测波长:254nm；柱温：室温(25℃)；进样量:4μL。
2.3 尼古丁标准储备液和标准溶液的配制
1g/L尼古丁标准储备液：准确称取10010mg 尼古丁样品用甲醇定容至100mL容量瓶中，于4℃保存待用。
标准溶液：分别从上述1g/L尼古丁标准储备液中移取0105,011,0125,015,110,210,510,1010, 2510mL，用二次蒸馏水定容至50mL，配成1,2,5, 10,20,40,100,200,500mg/L的标准溶液;011, 0105,0101mg/L的标准溶液用二次蒸馏水二次稀释10mg/L标准溶液而得。
3 结果与讨论
3.1 萃取条件的选择
3.1.1 有机溶剂
三相液相微萃取除了要求有机溶剂与中空纤维的兼容性好外，还要求有机溶剂对目标分析物有合适的溶解度[24-25]。溶解度太小，对给出相中目标分
・
6
5
5
・
第6期杨新磊，等：三相中空纤维式液相微萃取用于快速富集血浆中的尼古丁析物的萃取率低；溶解度太大，有机相中的目标分析物不易被反萃取到接收相中。另外,L PM E 所用有机溶剂必须难溶于水且不易挥发。综合考虑以上因素，本实验考察了12辛醇(n 2octanol )、磷酸三丁酯(t ributyl p ho sp hate ,TB P )和三正辛胺(trioctyl 2amine ,TOA )3种萃取剂对尼古丁的萃取效果(见图2)，结果表明TB P 的萃取效果最好
。
图2 有机溶剂对萃取效率的影响
Fig.2 E ffect of organic solvent on extraction eff iciency
3.1.2 给出相的酸碱性
尼古丁(又名烟碱)是一种二元有机弱碱[26-27],
在碱性溶液中主要以分子形式存在，溶解度相对较小。实验对比了以TB P 为萃取剂，用2mL 不同浓度的KO H 溶液调节2mL 20mg/L 尼古丁标准溶液p H 的萃取效果，如图3所示,KO H 浓度为0105mol/L 时的效果最好，浓度太高容易造成TBP 的分解，浓度太低不足以使尼古丁以分子形式存在，对萃取不利
。
图3 所用K OH 浓度对萃取效率的影响
Fig.3 E ffect of K OH concentration employed in donor
ph ase on extraction eff iciency
3.1.3 接收相的组成
三相L PM E 不仅要求接收相的p H 值能够完全质子化目标分析物，而且要求接收相要有足够的缓冲能力并且能适合谱仪器的要求。本实验在Pedersen 2Bjergaard 等[28]研究的基础上考察了10
mmol/L KH 2PO 4缓冲溶液在不同p H 条件下作为
接收相对给出相(2mL 0105mol/L KO H +2mL 20mg/L 尼古丁标准溶液)中尼古丁的萃取效率(见图4)，结果表明p H 3时效果最好，既能完全质子化尼古丁又不会对有机萃取剂产生影响
。
图4 接收相pH 对萃取效率的影响Fig.4 E ffect of pH of acceptor ph ase
on extraction eff iciency
Acceptor phase :10mmol/L KH 2PO 4adjusted by H 3PO 4to different p H ;donor phase :2mL of 0105mol/L KO H +2mL of 20mg/L nicotine standard solution.
www.67113.1.4 搅拌速率、盐效应和接收相中甲醇的含量
搅拌速率：增加搅拌速率可以提高目标分析物在给出相中的传质速率，有利于目标分析物通过有机相进入接收相，缩短萃取时间，但是速率太高会加速有机萃取剂溶解至给出相中，而且在萃取过程中容易产生气泡附着在中空纤维的外壁，影响传质。本实验所选速率为500r/min 。图5 给出相中盐浓度对萃取效率的影响Fig.5 E ffect of salt concentration in donor ph ase
on extraction eff iciency
盐效应：盐效应对萃取的影响是双向的，给出相中盐的加入一方面可增加溶液的离子强度，降低待测物的溶解度，但另一方面静电作用又会抵制有机溶剂的萃取，因此，盐效应对萃取效果的影响不定，可能促进萃取，也可能阻碍萃取[2,4]。本文以NaCl 溶液为代表，考察了不同浓度对尼古丁萃取效率的影响(如图5)，发现给出相中盐的加入对萃取不利。
・
755・
谱第24卷
甲醇含量:Schellin 等[29]、Pedersen 2Bjergaard 等[28]分别研究了接收相中不同甲醇含量对有机磷除草剂和酸性非甾类抗炎药物萃取效率的影响，效果不一，甲醇的加入对前者的萃取不利，对后者则可明显改善萃取效果。本实验在接收相中加入甲醇，萃取效率略有降低(见图6)
。
图6 接收相中甲醇含量对萃取效率的影响
Fig.6 E ffect of meth anol in acceptor ph ase
on extraction eff iciency
3.1.5 萃取时间
液相微萃取是基于传质和萃取平衡两方面因素
的一种萃取过程，受萃取时间因素影响大。萃取时间越长萃取越接近平衡，萃取率越高，但是随着时间的延长有机溶剂的溶解和挥发又会对萃取产生负效果。实验结果表明萃取时间为17min 时的萃取效率最高(见图7)
。
图7 萃取时间对萃取效率的影响
Fig.7 E ffect of extraction time on extraction eff iciency
家谱管理系统
3.2 方法的有效性3.2.1 精密度
在优化的L PM E 条件下，以2mL 20mg/L 尼
古丁标准溶液和2mL 0105mol/L KO H 溶液作为给出相，平行萃取5次进样分析，考察方法的精密度，得相对标准偏差(RSD )为314%。3.2.2 标准曲线线性范围及相关系数 分别取已过0145μm 滤膜的上述不同浓度的尼古丁标准溶液4μL 进样测定，得标准曲线线性范
围为1～200mg/L ，相关系数(r 2)为019997。3.2.3 工作曲线线性范围、相关系数及检测限
分别以不同浓度的尼古丁标准样品2mL 与2mL 0105mol/L KO H 溶液混合作为给出相，按优
化的L PM E 条件，液相微萃取后取4μL 接收相进样测定，得工作曲线的线性范围为011～50mg/L ,r 2
为019996。检测限为0105mg/L (S/N =3)。3.2.4 富集倍数
富集倍数定义为尼古丁标准溶液经L PM E 萃取后接收相中的尼古丁浓度相比于给出相中尼古丁的原始浓度。在优化的L PM E 条件下，该方法对尼古丁的富集倍数约为10倍。3.2.5 选择性
三相液相微萃取只适用于可离子化的酸性或碱性物质[1,24,28,30]。本实验的分析物尼古丁是一种二
元碱性物质，在碱性条件下给出相中的酸性物质、中性物质以及一些大分子物质不会被萃取到接收相中去，可以很好地消除干扰。3.3 样品的测定
血样来自一位有30年烟龄的男性志愿者，并且在抽血之前吸一支香烟。抽血后立即将血样离心10min (10000r/min )，取上层血浆待用。 取3份上述血浆样品各2mL ，分别加入含0,10,20mg/L 尼古丁的0105mol/L KO H 溶液2mL ，调
样品溶液为碱性，按优化的L PME 条件萃取后，进样测定。测得3份血浆样品在3个添加水平下的峰面积(μV ・s )分别为189712,1088982,2087987和197093,1115247,2112401以及206320,1109879,2110438，以标准加入法计算血浆样品中尼古丁的质量浓度为(1191±0109)mg/L (n =3)。
图8 某吸烟者血浆的HPLC 图Fig.8 Chrom atograms of a smoker ’s plasm a
a.plasma concentrated by LPME;氧空位
b.plasma without concentration.
图8为某吸烟者血浆的HPL C 图。从图8可以看出该血浆经过L PM E 萃取后(谱图a )，不仅有效地消除了直接进样(谱图b )时的一些干扰峰，而且对尼古丁的富集效果明显。机械钻孔桩
・855・
第6期杨新磊，等：三相中空纤维式液相微萃取用于快速富集血浆中的尼古丁
4 结论
以三相液相微萃取对样品进行前处理，采用高效液相谱检测，可在短时间(30min )内完成一次血浆样品中尼古丁的测定，缩短了样品前处理的时间，可直接、定量地反映血浆中尼古丁的含量。研究证明这种新型的样品前处理技术不仅减少了传统样品前处理过程中大量有机溶剂的使用对周围环境和分析工作者的影响，简化了实验操作步骤，降低了实验成本，而且更能适应现代分析仪器的发展需要，将会成为样品前处理技术中最具竞争力的一种方法。参考文献:
[1] Psillakis E ,Kalogerakis N.Trends Analyt Chem ,2003,22:
565
[2] J eannot M A ,Cantwell F F.Anal Chem ,1996,68:2236[3] Rasmussen K E ,Pedersen 2Bjergaard S.Trends Anal Chem ,
2004,23:1
[4] Zhang Zhaohui ,Kang Shaoying ,Xu Minjie ,Ma Ming ,Chen
Bo ,Yao Shouzhuo.Chinese Journal of Chromatography (张朝
辉，康绍英，许敏洁，马铭，陈波，姚守拙.谱),2005,23(4):358
[5] Pedersen 2Bjergaard S ,Rasmussen K E.Anal Chem ,1999,
71:2650
[6] Ho T S ,Reubsaet J L E ,Ant honsen H S ,Pedersen 2Bjergaard
S ,Rasmussen K E.J Chromatogr A ,2005,1072:29[7] Tan L ,Zhao X P ,Liu X Q ,J u H X ,Li J S.Chromatograph 2
ia ,2005,62:305
[8] Myung S W ,Y oon S H ,K im M.Analyst ,2003,128:1443[9] Leinonen A ,Vuorensola K ,Lepola L M ,Kuuranne T ,K otia 2
ho T ,Ketola R A ,K ostiainen R.Anal Chim Acta ,2006,559:166
[10] Ma M ,Kang S Y ,Zhao Q ,Chen B ,Yao S Z.J Pharm
Biomed Anal ,2006,40:128
[11] Shen G ,Lee H K.Anal Chem ,2003,75:98
[12] Wang J X ,Jiang D Q ,Yan X P.Talanta ,2006,68:945[13] Liu J F ,Chi Y G ,Jiang G B.J Sep Sci ,2005,28:87[14] Liu J F ,Jiang G B ,Chi Y G ,Cai Y Q ,Zhou Q X ,Hu J T.
Anal Chem ,2003,75:5870
[15] Mahoney G N ,Al 2Delaimy W.J Chromatogr B ,2001,753:
179
[16] Ghosheh O A ,Browne D ,Rogers T ,De Leon J ,Dwoskin L
P ,Crooks P A.J Pharm Biomed Anal ,2000,23:543
[17] Li Deliang ,Liu Meng.Journal of Instrumental Analysis (李
德亮，刘锰.分析测试学报),2003,22(4):108
[18] Chang Y L ,Tsai P L ,Chou Y C ,Tien J H ,Tsai T H.J
Chromatogr A ,2005,1088:152
[19] Page 2Sharp M ,Hale T W ,Hackett L P ,Kristensen J H ,
Ilett K F.J Chromatogr B ,2003,796:173
[20] Yang J ,Hu Y ,Cai J B ,Zhu X L ,Su Q D.Anal Bioanal
Chem ,2006,384:761
[21] J aakkola M S ,Ma J M ,Yang G H ,Chin M F ,Benowitz N
K ,Ceraso M ,Samet J M.Prev Med ,2003,36:282
[22] Hou L ,Lee H K.Anal Chem ,2003,75:2784
[23] Sarafraz 2Yazdi A ,Beiknejad D ,Es ′haghi Z.Chromatograph 2
ia ,2005,62:49
[24] Ho T S ,Pedersen 2Bjergaard S ,Rasmussen K E.J Chroma 2
togr A ,2002,963:3
[25] Pedersen 2Bjergaard S ,Rasmussen K E ,Brekke A ,Ho T S ,
Halvorsen T G.J Sep Sci ,2005,28:1195
冷轧酸洗[26] Sellergren B ,Zander !,Renner T ,Swietlow A.J Chroma 2
togr A ,1998,829:143
[27] Li Deliang ,Zhao Jin ,Ding Y ing ,Sun Xinqi.Chemistry (李
德亮，赵瑾，丁颖，孙心齐.化学通报),2002,65(3):174[28] Pedersen 2Bjergaard S ,Ho T S ,Rasmussen K E.J Sep Sci ,
2002,25:141
[29] Schellin M ,Hauser B ,Popp P.J Chromatogr A ,2004,
1040:251
[30] Ho T S ,Halvorsen T G ,Pedersen 2Bjergaard S ,Rasmussen
K E.J Chromatogr A ,2003,998:61
第三届全国实验室管理科学研讨会征文通知
由中国分析测试协会主办、《分析试验室》编辑部承办的“第三届全国实验室管理科学研讨会”定于2007年7月10～14日在青海省西宁市召开。
会议内容包括实验室管理科学、实验室认证认可、实验室比对、实验室信息管理系统(L IMS )、实验室仪器设备运行及考核、实验室技术人员培训等有关方面的学术研讨。会议将邀请有关专家做大会报告。欢迎全国各行业的实验室管理人员及实验室科研工作人员参加会议。
薄板焊接
会议征文请在2007年5月31日前通过邮局邮寄、发送到会议筹备组(三日内收到筹备组的回复邮件方为发送
成功)，并请注明联系人、详细通信地址、、传真号码及E 2mail 地址。经专家审稿后部分录用征文可在《分析试验室》期刊上正式发表。
欲参加会议的各界人士，也请于2007年5月31日前与会议筹备组联系，以便继续为您寄发下一轮通知。
联系人：孙臣良 田春霞 E 2mail :ana 2info @263 电 话:(010)82241919,82013328 传 真:(010)82013328
地 址：北京新外大街2号《分析试验室》编辑部实验室管理会议筹备组 邮 编:100088
中国分析测试协会
2006209230
・
955・
