一种靶向结直肠癌癌胚抗原特异性荧光示踪剂及制备方法与流程

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1.本发明属于生物医药技术领域，涉及靶向探针特异性结合结直肠癌癌胚抗原的荧光示踪剂及制备方法。

背景技术：

2.结直肠癌无论是发病率还是死亡率，都常位于前五的癌症，2014年中国肿瘤登记地区结直肠癌新发病例为79180例, 发病率约每十万人患病27人，占全部恶性肿瘤新发病例的9.60%，且发病率逐年上升。在美国结直肠癌是美国第三大最常见的癌症和主要死因。大约15％的大肠癌患者在诊断时已经存在腹膜癌变，估计有40％的患者在初步诊断后会发展为腹膜转移。
3.结直肠癌的手术难以彻底清除肿瘤细胞的原因众多，例如多发肿瘤灶、肿瘤边界不明确或不正确导致切缘阳性、复发患者的骨盆由于前期手术导致变形、新辅助后，术中难以区分纤维化与肿瘤组织、结直肠癌存在腹膜转移、微小肿瘤灶等，并且当前诊断工具（ct，mri）检测小肿瘤结节的敏感性和特异性低，通常会低估腹膜疾病的程度。
4.近年来，随着荧光成像技术的成熟，可以为外科医生提供改善肿瘤切除的解决方案。荧光成像技术具有非侵入、无创伤、高灵敏度、实时成像等优点，例如在结直肠癌荧光成像中突出微小肿瘤病灶，在局部和转移性结直肠癌手术中具有应用价值、区分纤维化和恶性组织，可用于接受放化疗的直肠癌患者。但当前已批准的染料（荧光素、亚甲蓝、icg、ird800cw）不具有靶向性，或发射光谱不在近红外范围内。因此需要高性能的近红外荧光靶向制剂为外科医生提供指导。传统荧光染料由于不具靶向肿瘤和非特异性的缺点，不能够精确地对肿瘤边界进行精确的显影。
5.现有研究表明，结直肠癌中可与靶向探针（sgm-ch511 mab）结合的肿瘤标志物是癌胚抗原（cea）。cea在90%的结直肠癌中高表达、肿瘤组织中cea表达量比正常组织高60倍、癌细胞表面cea数量高达每细胞10万~100万个。因此利用cea在结直肠癌中高含量、肿瘤组织中高cea表达量等特性，合成一种靶向结直肠癌中cea的医药实现精准医疗和是荧光导航手术中亟待解决的问题。

技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的主要目的是为了解决现有荧光染料无法靶向结直肠癌细胞以及结直肠肿瘤边界划分性差的缺点，而提供了与结直肠癌靶向结合的近红外荧光染料sgm-cy705的制备方法。
7.为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种碳菁类染料cy-705，所述荧光染料激发峰值为685nm，发射峰值为705nm。
8.为了将cea特异性抗体sgm-ch511 mab与cy-705结合形成靶向cea的特异性荧光染料，本发明将cy-705与碘乙酸-n-羟基琥珀酰亚胺酯进行取代反应，生成一种带有活化酯的cy-705。
9.为实现上述目的，本发明结直肠癌靶向结合的近红外荧光染料的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将ph=8.5～9.3的磷酸盐/碳酸氢盐缓冲液、sgm-ch511 mab于在温室条件下搅拌混合。例如烧瓶中，在25℃下搅拌1～2min。
10.步骤2：往步骤1中加入将带有活化基团的cy-705，可直接与抗体分子上的氨基反应形成稳定的酰胺键，例如加入一定的剂量的cy-705，在黑暗温室条件下，以60rpm转速搅拌40min，即得到1个抗体分子偶联1～3个荧光染料分子的sgm-cy705与游离染料。
11.步骤3：将步骤2中混合物分散在洗脱缓冲液中，最终通过离心或透析或超滤的方法除去游离的染料。例如在脱盐柱中，将混合物用洗脱缓冲液冲洗，将sgm-cy705大分子与游离染料cy-705小分子分离。
12.作为优选，该制备方法还包括：上述反应中，可以通过改变sgm-ch511 mab与cy-705的比例来调节单个抗体表面带有荧光染料的个数以及单个抗体带有染料个数的成分。
13.基于上述技术方案可知，本发明的方法和由此制备的近红外荧光染料具有如下有益效果：本发明涉及的原料易获得，反应条件温和，具有较为简单的可操作性和可控性；sgm-cy705光漂白性低，荧光时间窗口与icg荧光窗口兼容，大约1h。连接抗体之后能够增加荧光染料的靶向性，增加其在含cea癌变部位的富集，增加癌变部位与正常组织之间的对比度。该产物吸收峰值为685nm，发射峰值为705nm波长，避开了组织吸收系数高的波段，能较好的穿透组织进行成像。通过多次控制荧光染料与抗体混合时摩尔比得到较优的产物成分。
附图说明
14.图1为带活化酯的cy-705荧光染料结构式。
15.图2为带活化酯的cy-705与抗体连接示意图。
16.图3为sgm-cy705与癌细胞癌胚抗原cea特异性结合示意图。
具体实施方式
17.为了更清楚的说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应当以此限制本发明的保护范围。
18.本发明为了解决现有荧光染料存在的稳定性差以及体内非特异性分布的缺点，而提供了一种抗癌胚抗原单抗（sgm-ch511 mab）的特定肿瘤靶向特性与荧光染料（cy-705）结合的抗体-染料偶联物（sgm-cy705）其制备方法及其应用。本发明是通过化学反应在sgm-ch511 mab单抗的表面通过酰胺键将带活化酯的cy-705连接到其表面制备得到sgm-cy705靶向荧光染料并将其应用于生物医学领域。本发明的sgm-cy705可以通过改变sgm-ch511 mab与cy-705混合比例，使得1个抗体分子表面带有1～3个cy-705分子；制备得到的sgm-cy705具有稳定性好、抗体染料比可控、低毒、低荧光漂泊，且sgm-cy705与cea的特异性结合高于90%，在病变组织荧光成像领域具有很好的临床应用价值。
19.更具体地，本发明公开了一种sgm-cy705特异性荧光染料的制备方法，包括以下步
骤：步骤1：将ph=9.3的磷酸盐/碳酸氢盐缓冲液、sgm-ch511 mab于在温室条件下搅拌混合。例如烧瓶中，在25℃下搅拌1～2min。
20.步骤2：往步骤1中加入将带有活化基团的cy-705，可直接与抗体分子上的氨基反应形成稳定的酰胺键，例如加入一定剂量的带活化酯cy-705，在黑暗温室条件下，以60rpm转速搅拌40min，即得到1个抗体偶联1～3个荧光染料的sgm-101与游离染料混合物。
21.步骤3：将步骤2中混合物分散在洗脱缓冲液中，最终通过离心或透析或超滤的方法除去游离的染料。例如脱盐柱中，将混合物用洗脱缓冲液冲洗，将sgm-cy705大分子与游离染料cy-705小分子分离。
22.上述反应中，可以通过改变sgm-ch511 mab与cy-705的混合比例来调节单个抗体表面带有荧光染料的个数以及单个抗体带有染料个数的成分。
23.上述反应中，洗脱缓冲液可以为8～12mm 磷酸氢二钾、8～12mm柠檬酸钠、300nm精氨酸、0.02% tween-20, ph 6.0混合物。
24.上述反应中，可以根据手术选择，满足不同发射光波段荧光染料的要求。荧光染料也可以选自irdye800-cw、alexa-fluor 750（af750）等带有活化酯的荧光染料。可以通过添加不同ph磷酸盐缓冲液或催化剂在抗体与荧光染料之间形成上述抗体-染料偶联物。
25.上述反应中，反应条件温和，连接抗体之后能够增加荧光染料的靶向性，增加其在含cea癌变部位的富集，增加癌变部位与正常组织之间的对比度。下面结合具体优选实施例对本发明的技术方案和效果做进一步的说明。需要说明的是，以下的具体实施方式只是举例说明。
26.实施例1(1)量取ph=9.3，10ml磷酸盐缓冲液与5mg sgm-ch511 mab于试管中混合，在25℃条件下搅拌1～2min；(2)量取0.3mg的cy-705荧光染料(cy-705与sgm-ch511 mab摩尔比为3∶1～5∶1)迅速加入到步骤(1)中的混合溶液中，在黑暗温室条件下，以60rpm搅拌约40min。
27.(3)将步骤（2）中表面带有抗体-染料偶联物与游离染料的混合物分散在ph为6的洗脱缓冲液中，再将该溶液加入脱盐柱中平衡分离得到sgm-cy705产物，最后将得到的sgm-cy705溶液用去离子水洗涤三次。
28.实施例2(1)将af750溶解在二甲基甲酰胺溶液中形成大约1mm的af750溶液，在配好的溶液中取少量进行200倍稀释，测量确定750nm处的吸光值，用消光系数240000/m/cm准确计算制配溶液的摩尔浓度，在25℃条件下搅拌1～2min；（2）量取ph=9.3，10ml磷酸盐缓冲液与5mg sgm-ch511 mab于试管中溶解，形成大约3μm抗体溶液(af750与sgm-ch511 mab摩尔比为1∶1～2∶1)加入到步骤(1)中的混合溶液中，在黑暗温室条件下，以60rpm搅拌约40min。
29.(3)将步骤（2）中表面带有抗体-染料偶联物与游离染料的混合物分散在ph为6的洗脱缓冲液中，再将该溶液加入脱盐柱中平衡分离得到产物，最后将得到的抗体-染料偶联物溶液用去离子水洗涤三次。
30.实施例3(1)将irdye800-cw溶解在ph=8.5磷酸氢盐缓冲液中形成大约1mm的溶液；在配好的溶液中取少量进行200倍稀释，测试确定吸收峰774nm处的吸光值，用消光系数240000/m/cm准确计算制配溶液的摩尔浓度。
31.（2）量取ph=9.3，10ml磷酸盐缓冲液与5mg sgm-ch511 mab于试管中溶解，形成大约3μm抗体溶液(irdye800-cw与sgm-ch511 mab摩尔比为1∶1～2∶1)加入到步骤(1)中的混合溶液中，在黑暗温室条件下，以60rpm搅拌约40min。
32.(3)将步骤（2）中表面带有抗体-染料偶联物与游离染料的混合物分散在ph为6的洗脱缓冲液中，再将该溶液加入脱盐柱中平衡分离得到大分子产物，最后将得到的抗体-染料偶联物溶液用去离子水洗涤三次。
33.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种带活化酯的cy-705近红外染料结构式。2.一种近红外染料-抗体偶联荧光靶向示踪剂，其特征是，包括sgm-ch511mab单抗与带有活化酯的cy-705荧光染料，sgm-ch511mab单抗上的氨基与带活化酯的cy-705上的羧基反应生成酰胺键，一个sgm-ch511单抗分子与1~3个cy-705结合。3.一种近红外染料-抗体偶联荧光靶向示踪剂的制备方法，其特征是，将磷酸盐/磷酸氢盐缓冲液中的sgm-ch511mab与cy-705混合。4.如权利要求2所述的近红外染料-抗体偶联荧光靶向示踪剂的制备方法，其特征是，sgm-ch511 mab单抗与cy-705的摩尔比为1:3~1：5。5.如权利要求2所述的近红外染料-抗体偶联荧光靶向示踪剂的制备方法，其特征是，将sgm-ch511 mab与cy-705混合后，在黑暗环境中温室下，以60转速/分钟搅拌40分钟后，在洗脱缓冲液中平衡的脱盐柱上将sgm-cy705偶联物与游离染料分离。6.如权利要求2所述的近红外染料-抗体偶联荧光靶向示踪剂的制备方法，其特征是，优选地，磷酸盐/磷酸氢盐缓冲液的ph值为9.3。7.如权利要求4所述的洗脱缓冲液配方为8～12mm 磷酸氢二钾、8～12mm柠檬酸钠、300mm精氨酸、0.02% tween-20, ph6.0。

技术总结

一种靶向探针结合结直肠癌高表达靶点在体荧光示踪剂及制备方法。本发明包括荧光染料具有以705 nm为中心的吸收带的荧光染料（Cy-705）与针对癌胚抗原（CEA）的嵌合单克隆抗体（mAb）偶联，一个抗体分子与不大于3个Cy-705分子连接。作为肿瘤标志物癌胚抗原在结直肠癌细胞中具有高含量、高表达的特点，本发明制备的近红外荧光染料可精准结合癌细胞中的癌胚抗原。本发明的特异性荧光染料SGM-Cy705光漂白性低，荧光时间窗口与常规荧光染料ICG兼容，能在含CEA癌变部位中富集，增加癌变部位与正常组织之间的对比度。该产物发射峰值在705nm波长，避开了组织吸收系数高的波段，能较好的穿透组织进行成像。本发明生产条件易于获得，能够落地产业化生产且具有市场临床应用潜力。够落地产业化生产且具有市场临床应用潜力。