一种槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法及其指纹图谱和应用与流程

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1.本发明涉及一种槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法及采用该方法构建的指纹图谱和利用该指纹图谱甄别不同炮制品及对槟榔及其炮制品进行质量进行评价，属于药物分析技术领域。

背景技术：

2.槟榔为一味传统中药，中国药典收载槟榔为棕榈科植物槟榔areca catechu l. 的干燥成熟种子，其炮制品有炒槟榔、焦槟榔。现代研究表明，槟榔的主要化学成分有生物碱类成分，具有驱虫、抗氧化、抗过敏等药理作用，对于神经系统、消化系统、心血管系统和神经系统有着多种药理作用，参见杨雅蛟，孔维军，孙兰，等。槟榔化学成分和药理作用及临床应用研究进展[j].世界科学技术-中医药现代化，2019，21(12):2583-2591和yuchen xiao，yang yang, jianping yong，et al.chemical components and biological activities of arecacatechu l.[j].biomedical research and reviews，2019，3:1-4。
[0003]
中国药典中槟榔及其炮制品以槟榔碱作为含量测定指标。丁野(丁野，姚蓉，龙海燕等.槟榔药材高效液相谱指纹图谱研究[j].中国药业，2011， 20(19):22-23)、黄云(黄云,欧阳黎明，黄世超.槟榔药材c18柱化学特征图谱的研究[j].中国药师,2012,15(2):202-204)等建立了槟榔药材的指纹图谱，仅有 3个共有峰；马智玲等(马智玲,万莹莹,张志强,等。基于标准汤剂的槟榔、焦槟榔配方颗粒特征图谱研究[j].亚太传统医药,2022,18(2):86-91)建立了槟榔、焦槟榔标准汤剂及配方颗粒的特征图谱，仅有4个共有峰；李水清等(李水清，孙萌，梁生旺等.焦槟榔标准饮片均匀化方法及质量控制研究[j].中药材，2018， 41(7):1698-1701)学者建立了焦槟榔饮片特征图谱，仅有5个共有峰。以上研究对于谱条件的优化不到位，因此能够分离得到谱峰数目较少，最终建立的共有峰较少。彭伟(彭伟.焦槟榔“长于消食导滞”的炮制机制及其槟榔碱适宜含量的研究[d].成都：成都中医药大学，2017)建立了焦槟榔饮片指纹图谱，共 14个共有峰，但缺少生物碱类成分，而且分析时间需要60分钟，分离效率较低。综上所述，单一指标显然不能全面反映槟榔及其炮制品的质量，目前所建立的槟榔及其炮制品的指纹图谱中谱峰分离度较差，共有峰较少，反映化学成分较为有限，无法在短时间内快速、全面地反映槟榔及其炮制品化学成分信息。

技术实现要素：

[0004]
发明目的：本发明的第一目的是针对现有槟榔及其炮制品质量控制方法存在的谱法分离较差，质控成分有限、检测效率低等不足，提供一种槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法。本发明的第二目的是提供利用该方法得到的槟榔及其炮制品指纹图谱；本发明的第三目的是该指纹图谱在槟榔及其炮制品的经典名方的基准样品、制剂中间产品或成品质量评价中的应用。
[0005]
技术方案：本发明所述一种槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，包含以下步骤：
[0006]
(1)配制供试品溶液和参照物溶液：所述供试品溶液为槟榔或其炮制品提取得到的溶液，所述参照物为对照品，包括原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱；
[0007]
(2)采用超高效液相谱仪分别对供试品溶液和参照物溶液进行检测；
[0008]
(3)对照参照物确认共有峰，构建指纹图谱。
[0009]
进一步地，所述炮制品为炒槟榔、焦槟榔。对照品是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质。
[0010]
进一步地，步骤(1)中，所述供试品包括槟榔及其炮制品的药材、饮片、提取物、标准汤剂、配方颗粒或者含有槟榔及其炮制品的经典名方的基准样品、制剂中间产品或成品。
[0011]
具体地，上述供试品为槟榔、炒槟榔和焦槟榔的药材、饮片、提取物、标准汤剂、配方颗粒或者含有槟榔、炒槟榔和焦槟榔的经典名方的基准样品、制剂中间产品或成品。其中，“药材”或“生药”是指未经加工或未制成成品的中药原料。“饮片”是指中药根据需要，经过炮制处理而形成的供配方用的中药，或可直接用于中医临床的中药。“提取物”是指按规范化的生产工艺制得的符合一定质量标准的提取物，例如，醇(如甲醇、乙醇等)提物、水提物等。“标准汤剂”是指以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂。“配方颗粒”是由单味中药饮片按传统标准炮制后经提取浓缩制成的、供中医临床配方用的颗粒。“经典名方物质基准”是指以古代医籍中记载古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质，除成型工艺外，其余制备方法应与古代医籍记载基本一致。“经典名方成品颗粒”或“经典名方标准颗粒”是指由古代医籍中记载的古代经典名方经提取浓缩制成的、供中医临床配方用的颗粒。
[0012]
进一步地，步骤(1)中，所述供试品溶液用提取溶剂提取供试品得到，提取溶剂与供试品的液固比为50～250ml/g，所述参照物溶液为用溶剂溶解对照品得到。
[0013]
进一步地，所述提取溶剂为水、醇或醇-水溶液，所述溶剂为水、醇或醇-水溶液。
[0014]
更进一步地，供试品溶液的制备方法如下：
[0015]
取槟榔或炒槟榔或焦槟榔样品粉末，精密称定，置容器中，精密加入提取溶剂，密塞，称定重量，提取处理后，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
[0016]
更进一步地，所述醇或醇-水溶液为甲醇或甲醇-水溶液，其中，甲醇-水溶液的甲醇体积分数不低于10％，具体可以为10％、15％、20％、25％、30％、35％、 40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％；为了进一步提高提取效率，并使谱峰的峰型更佳，优选所述提取溶剂的浓度以甲醇的体积分数计为30％～70％。
[0017]
槟榔及其炮制品的样品粉末与提取溶剂的质量体积比为1g:(50～250ml)，具体可以为1g:50ml、1g:60ml、1g:100ml、1g:125ml、1g:150ml、1g:200ml或 1g:250ml等；为了进一步优化提取效果和物料用量，药材与饮片的粉末与提取溶剂质量体积比优选为1g:50ml，标准汤剂及配方颗粒的粉末与提取溶剂体积质量比优选为1g:125ml。供试品浓度太小不利于谱峰的检出，浓度太大则谱柱超载导致谱峰峰形不佳。
[0018]
提取处理采用超声、加热回流或振摇的方式进行，为了使提取操作简便，优选采用超声处理的方式，超声的功率、频率对本发明影响不大。在一些优选的实施方式中，所述超声处理的功率为250w，频率为40khz。
[0019]
提取处理的时间为5～60min，具体可以为5min、10min、15min、30min、45min 或60min；为了进一步优化提取效果和处理周期，优选提取处理的时间为 10～45min。
[0020]
更进一步地，上述对照品参照物溶液的制备方法如下：
[0021]
取对照品适量，精密称定，加入溶剂(水、醇或醇-水溶液)，混匀至溶清，即得。
[0022]
更进一步地，上述醇或醇-水溶液为甲醇、甲醇-水溶液时，其中，甲醇-水溶液的甲醇体积分数不低于30％，具体可以为30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％；优选提取溶剂的浓度以甲醇的体积分数计为30％～100％。
[0023]
作为优选，在上构建方法中，谱柱选自cortecs t3(2.1
×
150mm,1.6μm)、 hss t3(2.1
×
100mm,1.8μm)、beh c18(2.1
×
100mm,1.7μm)的一种，流速： 0.15～0.25ml/min。
[0024]
进一步地，步骤(1)中，对照品溶液的浓度对发明影响不大，在一些优选的实施方式中，原花青素b1溶液的浓度为70μg/ml，儿茶素的浓度为80μg/ml，表儿茶素的浓度为90μg/ml，去甲槟榔次碱的浓度为60μg/ml，槟榔次碱的浓度为50μg/ml，去甲槟榔碱的浓度为100μg/ml，氢溴酸槟榔的浓度为80μg/ml。
[0025]
进一步地，步骤(2)中，所述超高效液相谱仪的谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，谱柱柱长为100～150mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.6～1.8μm。
[0026]
更进一步地，所述谱柱选自cortecs t3(2.1
×
150mm,1.6μm)、hsst3(2.1
×
100mm,1.8μm)或beh c18(2.1
×
100mm,1.7μm)。
[0027]
进一步地，步骤(2)中，所述超高效液相谱仪的流动相：a相为乙腈或甲醇，b相为用磷酸调ph值后的十二烷基硫酸钠水溶液，其质量浓度为 0.001～0.060mol/l，ph值为2～4；所述超高效液相谱仪的检测器为紫外检测器、蒸发光散射检测器或电雾式检测器。
[0028]
进一步地，步骤(2)中，检测时采用梯度洗脱程序：0min
→
14min
→
20min
ꢀ→
35min
→
40min，a相的体积百分比：10％
→
18％
→
25％
→
35％
→
35％；流速：0.10～0.30ml/min，柱温：20～40℃，检测波长：200nm～250nm。
[0029]
更进一步地，流动相：a相为乙腈，b相为用磷酸调ph值至3的0.002mol/l 十二烷基硫酸钠溶液；流速：0.15～0.25ml/min，柱温：25～35℃，检测器：紫外检测器，检测波长：215nm。
[0030]
进一步地，当所述供试品为槟榔时，槟榔药材的指纹峰为21个，槟榔标准汤剂的指纹峰为16个，槟榔配方颗粒的指纹峰为14个，其中均有7个峰与对照品一致。
[0031]
进一步地，当所述供试品为炒槟榔时，炒槟榔饮片的指纹峰为20个，炒槟榔标准汤剂的指纹峰为18个，炒槟榔配方颗粒的指纹峰为22个，其中均有7 个峰与对照品一致。
[0032]
进一步地，当所述供试品为焦槟榔时，焦槟榔饮片的指纹峰为19个，焦槟榔标准汤剂的指纹峰为17个，焦槟榔配方颗粒的指纹峰为19个，其中均有7 个峰与对照品一致。
[0033]
本发明所述构建方法得到槟榔及其炮制品指纹图谱。
[0034]
进一步地，所述指纹图谱中包含原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱的指纹峰。
[0035]
本发明还包括利用得到的指纹图谱在槟榔及其炮制品的经典名方的基准样品、制剂中间产品或成品质量评价中的应用。
[0036]
本发明通过优化流动相组成、流动相梯度洗脱程序、优化谱柱等关键谱分离
条件使得样品中更多的谱峰获得较好分离，为指纹图谱中纳入更多的共有峰创造了条件，该方法通过多批次供试品溶液的检测，选择共有峰，参照对照品特征峰确认有效成分组成。通过对照品明确谱峰的化学成分，在此基础上比较了槟榔、炒槟榔和焦槟榔在药材饮片、标准汤剂和配方颗粒的指纹图谱差异，通过不同的谱峰能够区别槟榔、炒槟榔和焦槟榔，为槟榔及其炮制品地质量分析提供了一种共有峰较多，分析快速，反映化学成分较为丰富的指纹图谱构建方法。
[0037]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以显著优点：
[0038]
(1)本发明方法构建的指纹图谱，由于改进了谱分离条件，使得更多的谱峰获得了较好的分离，从而可以建立更多的共有指纹峰，如本方法建立的焦槟榔饮片指纹图谱中19个共有峰，多于现有技术14个共有峰；本方法建立的槟榔、焦槟榔标准汤剂中指纹图谱中分别有16、17个共有峰，远远多于现有技术的4个共有峰。有了更多地共有峰进行控制，才能更为全面地控制产品质量，因此本方法在质量控制方法具有显著优点。
[0039]
(2)本发明方法构建的指纹图谱，由于共有峰更多，因此反映产品中的化学成分信息更为丰富，通过对照品确认含有原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、槟榔碱等7种成分，分别为多酚类、黄酮类和生物碱类成分，与现有技术相比，能够更为全面地反映产品质量。
[0040]
(3)本发明方法构建的指纹图谱，优化了谱分离条件，与现有技术相比，在共有峰增多、化学成分信息增多的情况下，分析时间更短，分析效果更好，提升了分析效率。经过实施例的验证，该适用于槟榔、炒槟榔和焦槟榔的药材饮片、标准汤剂和成品，而且可以区别不同样品，用于检测的范围更广。
附图说明
[0041]
图1为对照品与槟榔标准汤剂的液相谱图；
[0042]
图2为16批槟榔标准汤剂指纹图谱的叠加图；
[0043]
图3为专属性试验的液相谱图；
[0044]
图4为15批炒槟榔标准汤剂指纹图谱的叠加图；
[0045]
图5为16批焦槟榔标准汤剂指纹图谱的叠加图；
[0046]
图6为16批槟榔药材指纹图谱的叠加图；
[0047]
图7为15批炒槟榔饮片指纹图谱的叠加图；
[0048]
图8为16批焦槟榔饮片指纹图谱的叠加图；
[0049]
图9为3批槟榔配方颗粒指纹图谱的叠加图；
[0050]
图10为3批炒槟榔配方颗粒指纹图谱的叠加图；
[0051]
图11为3批焦槟榔配方颗粒指纹图谱的叠加图。
具体实施方式
[0052]
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0053]
仪器、试剂与样品：
[0054]
waters acquity uplc h-class超高效液相谱仪系统；empower 3谱工作站；
[0055]
kq-250b超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；
[0056]
mettler toledo xp6百万分之一天平(梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司)；
[0057]
me204e/02型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；
[0058]
纯水系统(sartorius公司)；
[0059]
gkc114型控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；
[0060]
as165w型离心机(亚速旺(上海)商贸有限公司)；
[0061]
乙腈(谱纯，thermo fisher公司)；
[0062]
十二烷基硫酸钠(谱纯，aladdin公司)；
[0063]
磷酸(谱纯，aladdin公司)；
[0064]
其它试剂均为分析纯。
[0065]
儿茶素对照品、表儿茶素对照品、氢溴酸槟榔碱对照品均购自中国食品药品检定研究院，编号分别为110877-201604、110878-201703、111684-201602；
[0066]
原花青素b1对照品购自上海诗丹德标准技术服务有限公司，编号为7861；
[0067]
去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱对照品购自上海源叶生物科技有限公司，编号分别为a02gb143887、y13m11w113166、s02s11y123203。
[0068]
槟榔药材、标准汤剂和配方颗粒，炒槟榔饮片、标准汤剂和配方颗粒，焦槟榔饮片、标准汤剂和配方颗粒均由江阴天江药业有限公司提供。
[0069]
实施例1：槟榔标准汤剂指纹图谱的构建
[0070]
1、参照物溶液的制备
[0071]
取原花青素b1对照品、儿茶素对照品、表儿茶素对照品适量，精密称定，置棕量瓶中，分别加30％甲醇制成每1ml含原花青素b1 70μg、儿茶素80μg、表儿茶素90μg的溶液，作为对照品参照物溶液。再取去甲槟榔次碱对照品、槟榔次碱对照品、去甲槟榔碱对照品、氢溴酸槟榔碱对照品适量，精密称定，置棕量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含去甲槟榔次碱60μg、槟榔次碱50μg、去甲槟榔碱100μg、氢溴酸槟榔碱80μg的溶液，作为对照品参照物溶液。。
[0072]
2、供试品溶液的制备
[0073]
取槟榔标准汤剂适量，研细。取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30 分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0074]
3、指纹图谱的构建
[0075]
(1)谱条件
[0076]
cortecs t3谱柱(2.1mm
×
150mm，1.6μm)，以乙腈为流动相a，以 0.002mol/l十二烷基硫酸钠水溶液(用磷酸调ph值至3)为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2ml；柱温为25℃；检测波长为215nm，理论板数按槟榔碱峰计算应不低于3000。
[0077]
表1
[0078]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～1410
→
1890
→
8214～2018
→
2582
→
7520～3525
→
3575
→
6535～403565
[0079]
(2)检测及结果
[0080]
分别精密吸取各参照物溶液及供试品溶液1μl，分别注入液相谱仪，结果见图1。由图1可知，检测基线平稳，目标成分分离度良好，35分钟内可完成分析。得到的供试品指纹图谱中出现16个指纹峰，其中峰5、峰7、峰10、峰13、峰14、峰15、峰16分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。
[0081]
实施例2：多批次槟榔标准汤剂特征图谱的考察
[0082]
1、参照物溶液的制备
[0083]
相关方法同实施例1。
[0084]
2、供试品溶液的制备
[0085]
相关方法同实施例1，制备槟榔标准汤剂供试品溶液共16批次，分别为s1 (16)～s16(16)。
[0086]
3、指纹图谱的构建
[0087]
(1)谱条件
[0088]
相关方法同实施例1。
[0089]
(2)检测及结果
[0090]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立槟榔标准汤剂指纹图谱，计算相似度，结果见表2和图2。
[0091]
表2不同批次槟榔标准汤剂相似度结果(相对保留时间)
[0092]
批次相似度批次相似度s1(16)0.995s9(16)0.999s2(16)0.996s10(16)0.998s3(16)0.997s11(16)0.997s4(16)1.000s12(16)0.989s5(16)0.998s13(16)0.995s6(16)0.998s14(16)0.993s7(16)0.997s15(16)0.993s8(16)0.987s16(16)0.992
[0093]
结论：不同批次槟榔标准汤剂中均能够稳定出现16个共有指纹峰，其中峰5、峰7、峰10、峰13、峰14、峰15、峰16分别对应原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰富了槟榔的质量评价内容。
[0094]
根据多批次槟榔标准汤剂的测定结果，相似度均大于0.95，说明多批次槟榔标准汤剂的内在质量较为一致。
[0095]
实施例3：供试品稳定性的考察
[0096]
1、参照物溶液的制备
[0097]
相关方法同实施例1。
[0098]
2、供试品溶液的制备
[0099]
相关方法同实施例1。
[0100]
3、指纹图谱的构建
[0101]
(1)谱条件
[0102]
相关方法同实施例1。
[0103]
(2)检测及结果
[0104]
分别在0、2、4、8、18、24小时精密吸取各参照物溶液及供试品溶液1μl，注入液相谱仪，记录谱图，计算相似度，结果见表3。
[0105]
表3稳定性实验结果
[0106]
时间(小时)02481824相似度0.9990.9991.0000.9991.0001.000
[0107]
结论：相似度大于0.99，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
[0108]
实施例4：专属性试验
[0109]
1、参照物溶液的制备
[0110]
相关方法同实施例1。
[0111]
2、供试品溶液的制备
[0112]
相关方法同实施例1。
[0113]
3、指纹图谱的构建
[0114]
(1)谱条件
[0115]
相关方法同实施例1。
[0116]
(2)检测及结果
[0117]
分别精密吸取、空白溶剂及供试品溶液1μl，注入液相谱仪，结果见图3。图3为专属性试验的液相谱图，其中，上面的图为空白溶剂的液相谱图，下面的图为槟榔标准汤剂的液相图谱；由图3可知，空白溶剂对槟榔标准汤剂特征图谱的测定无干扰，该方法专属性强。
[0118]
实施例5：多批次炒槟榔标准汤剂特征图谱的考察
[0119]
1、参照物溶液的制备
[0120]
相关方法同实施例1。
[0121]
2、供试品溶液的制备
[0122]
相关方法同实施例1，制备15批次炒槟榔标准汤剂供试品溶液，分别为s1 (18)～s15(18)。
[0123]
3、指纹图谱的构建
[0124]
(1)谱条件
[0125]
相关方法同实施例1。
[0126]
(2)检测及结果
[0127]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立炒槟榔标准汤剂指纹图谱，计算相似度，结果见表4和图4。
[0128]
表4不同批次炒槟榔标准汤剂相似度结果(相对保留时间)
[0129]
批次相似度批次相似度s1(18)0.995s9(18)0.996s2(18)0.995s10(18)0.995s3(18)0.998s11(18)0.995s4(18)0.996s12(18)0.989s5(18)0.999s13(18)0.995s6(18)0.998s14(18)0.989s7(18)0.998s15(18)0.989s8(18)0.988
ꢀꢀ
[0130]
结论：不同批次炒槟榔标准汤剂中均能够稳定出现18个共有指纹峰，其中峰 7、峰9、峰12、峰15、峰16、峰17、峰18分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰富了炒槟榔的质量评价内容。
[0131]
根据多批次炒槟榔标准汤剂的测定结果，相似度均大于0.95，说明多批次炒槟榔标准汤剂的内在质量较为一致。
[0132]
实施例6：多批次焦槟榔标准汤剂特征图谱的考察
[0133]
1、参照物溶液的制备
[0134]
相关方法同实施例1。
[0135]
2、供试品溶液的制备
[0136]
相关方法同实施例1，制备16批次焦槟榔标准汤剂供试品溶液，分别为s1(17) ～s15(17)。
[0137]
3、指纹图谱的构建
[0138]
(1)谱条件
[0139]
相关方法同实施例1。
[0140]
(2)检测及结果
[0141]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立焦槟榔标准汤剂指纹图谱，计算相似度，结果见表5和图5。
[0142]
表5不同批次焦槟榔标准汤剂相似度结果(相对保留时间)
[0143]
批次相似度批次相似度s1(17)0.991s9(17)0.999s2(17)0.993s10(17)0.997s3(17)0.989s11(17)0.998s4(17)0.994s12(17)0.999s5(17)0.995s13(17)0.984s6(17)0.997s14(17)0.999s7(17)0.998s15(17)0.996
s8(17)0.999s16(17)0.990
[0144]
结论：不同批次焦槟榔标准汤剂中均能够稳定出现17个共有指纹峰，其中峰 6、峰8、峰11、峰14、峰15、峰16、峰17分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰富了焦槟榔的质量评价内容。
[0145]
根据多批次焦槟榔标准汤剂的测定结果，相似度均大于0.95，说明多批次焦槟榔标准汤剂的内在质量较为一致。
[0146]
根据上述结果，槟榔标准汤剂中16个共有指纹峰、炒槟榔标准汤剂中18 个共有指纹峰、焦槟榔标准汤剂中17个共有指纹峰，该指纹图谱可以区别槟榔与炮制品。
[0147]
实施例7：多批次槟榔药材指纹图谱的考察
[0148]
1、参照物溶液的制备
[0149]
相关方法同实施例1。
[0150]
2、供试品溶液的制备
[0151]
取槟榔粉末(过三号筛，筛孔50目)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz) 30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照此方法共制备16批槟榔药材供试品溶液，分别为 s1(21)～s16(21)。
[0152]
3、指纹图谱的构建
[0153]
(1)谱条件
[0154]
相关方法同实施例1。
[0155]
(2)检测及结果
[0156]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立次槟榔药材指纹图谱，计算相似度，结果见表6和图6。
[0157]
表6不同批次槟榔药材相似度结果
[0158]
批次相似度批次相似度s1(21)0.995s9(21)0.990s2(21)0.998s10(21)0.997s3(21)0.998s11(21)0.997s4(21)0.998s12(21)0.998s5(21)0.997s13(21)1.000s6(21)0.998s14(21)0.999s7(21)0.994s15(21)0.999s8(21)0.993s16(21)1.000
[0159]
结论：从结果来看，不同批次槟榔药材中均能够稳定出现21个共有指纹峰，其中峰2、峰4、峰13、峰18、峰19、峰20、峰21分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类
的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰富了槟榔的质量评价内容。
[0160]
根据多批次槟榔药材的测定结果，相似度均大于0.95，说明多批次槟榔药材内在质量较为一致。
[0161]
实施例8：多批次炒槟榔饮片指纹图谱的考察
[0162]
1、参照物溶液的制备
[0163]
相关方法同实施例1。
[0164]
2、供试品溶液的制备
[0165]
取炒槟榔饮片粉末(过三号筛，筛孔50目)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照此方法共制备15批炒槟榔饮片供试品溶液，分别为s1(20)～s15(20)。
[0166]
3、指纹图谱的构建
[0167]
(1)谱条件
[0168]
相关方法同实施例1。
[0169]
(2)检测及结果
[0170]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立炒槟榔饮片指纹图谱，计算相似度，结果见表7和图7。
[0171]
表7不同批次炒槟榔饮片相似度结果
[0172]
批次相似度批次相似度s1(20)0.997s9(20)0.998s2(20)0.995s10(20)0.998s3(20)0.992s11(20)0.996s4(20)0.988s12(20)0.963s5(20)0.997s13(20)0.969s6(20)0.994s14(20)0.976s7(20)0.979s15(20)0.964s8(20)0.995
ꢀꢀ
[0173]
结论：从结果来看，不同批次炒槟榔饮片中均能够稳定出现20个共有指纹峰，其中峰2、峰4、峰13、峰18、峰19、峰20、峰21分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰富了炒槟榔的质量评价内容。
[0174]
根据多批次炒槟榔饮片的测定结果，相似度均大于0.95，说明多批次炒槟榔饮片质量较为一致。
[0175]
实施例9：多批次焦槟榔饮片指纹图谱的考察
[0176]
1、参照物溶液的制备
[0177]
相关方法同实施例1。
[0178]
2、供试品溶液的制备
[0179]
取焦槟榔饮片粉末(过三号筛，筛孔50目)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照此方法共制备16批焦槟榔饮片供试品溶液，分别为s1(19)～s16(19)。
[0180]
3、指纹图谱的构建
[0181]
(1)谱条件
[0182]
相关方法同实施例1。
[0183]
(2)检测及结果
[0184]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立焦槟榔饮片指纹图谱，计算相似度，结果见表8和图8。
[0185]
表8不同批次焦槟榔饮片相似度结果
[0186]
批次相似度批次相似度s1(19)0.992s9(19)0.999s2(19)0.994s10(19)0.998s3(19)0.999s11(19)0.998s4(19)0.999s12(19)0.998s5(19)0.998s13(19)0.998s6(19)0.998s14(19)0.997s7(19)0.999s15(19)0.998s8(19)0.998s16(19)0.996
[0187]
结论：从结果来看，不同批次焦槟榔饮片中均能够稳定出现19个共有指纹峰，其中峰2、峰4、峰11、峰16、峰17、峰18、峰19分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰富了焦槟榔的质量评价内容。
[0188]
根据多批次焦槟榔饮片的测定结果，相似度均大于0.95，说明多批次焦槟榔饮片质量较为一致。
[0189]
根据上述结果，槟榔药材中21个共有指纹峰、炒槟榔饮片中20个共有指纹峰、焦槟榔饮片中19个共有指纹峰，该指纹图谱可以区别槟榔与炮制品。
[0190]
实施例10：多批次槟榔配方颗粒指纹图谱的考察
[0191]
1、参照物溶液的制备
[0192]
相关方法同实施例1。
[0193]
2、供试品溶液的制备
[0194]
取炒槟榔配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz) 30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照此方法共制备3批槟榔配方颗粒供试品溶液，分别为s1(14)～s3(14)。
[0195]
3、指纹图谱的构建
[0196]
(1)谱条件
[0197]
相关方法同实施例1。
[0198]
(2)检测及结果
[0199]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立槟榔配方颗粒指纹图谱，计算相似度，结果见表9和图9。
[0200]
表9不同批次槟榔配方颗粒相似度
[0201] s1(14)s2(14)s3(14)相似度1.0001.0001.000
[0202]
结论：从结果来看，3批槟榔配方颗粒相似度较高，均为1.000；指纹图谱中均能够稳定出现14个共有指纹峰，其中峰4、峰6、峰8、峰11、峰12、峰13、峰 14分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰富了槟榔配方颗粒的质量评价内容。
[0203]
实施例11：多批次炒槟榔配方颗粒指纹图谱的考察
[0204]
1、参照物溶液的制备
[0205]
相关方法同实施例1。
[0206]
2、供试品溶液的制备
[0207]
取炒槟榔配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz) 30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照此方法共制备3批炒槟榔配方颗粒供试品溶液，分别为s1(22) ～s3(22)。
[0208]
3、特征图谱的构建
[0209]
(1)谱条件
[0210]
相关方法同实施例1。
[0211]
(2)检测及结果
[0212]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立炒槟榔配方颗粒指纹图谱，计算相似度，结果见表10和图10。
[0213]
表10不同批次炒槟榔配方颗粒相似度
[0214] s1(22)s2(22)s3(22)相似度1.0001.0001.000
[0215]
结论：从结果来看，3批炒槟榔配方颗粒相似度较高，均为1.000；指纹图谱中均能够稳定出现22个共有指纹峰，其中峰7、峰10、峰13、峰19、峰20、峰21、峰22分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰
富了炒槟榔配方颗粒的质量评价内容。
[0216]
实施例12：多批次焦槟榔配方颗粒指纹图谱的考察
[0217]
1、参照物溶液的制备
[0218]
相关方法同实施例1。
[0219]
2、供试品溶液的制备
[0220]
取焦槟榔配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz) 30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照此方法共制备3批焦槟榔配方颗粒供试品溶液，分别为s1(19)～s3(19)。
[0221]
3、特征图谱的构建
[0222]
(1)谱条件
[0223]
相关方法同实施例1。
[0224]
(2)检测及结果
[0225]
分别精密吸取各供试品溶液及参照物溶液1μl，注入液相谱仪，再将谱图数据导入国家药典委员会推荐的“中药谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择多批次供试品中的共有峰，建立焦槟榔配方颗粒指纹图谱，计算相似度，结果见表11和图11。
[0226]
表11不同批次焦槟榔配方颗粒相似度
[0227] s1(19)s2(19)s3(19)相似度1.0001.0001.000
[0228] 结论：从结果来看，3批焦槟榔配方颗粒相似度较高，均为1.000；指纹图谱中均能够稳定出现19个共有指纹峰，其中峰8、峰10、峰12、峰16、峰17、峰18、峰19分别对应参照物原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱。该方法除了指认出常见的去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱等生物碱成分之外，还增加了多酚类成分——原花青素b1、黄酮类的成分——儿茶素、表儿茶素，说明该方法进一步丰富了焦槟榔配方颗粒的质量评价内容。
[0229]
根据上述结果，槟榔配方颗粒中14个共有指纹峰、炒槟榔配方颗粒中22 个共有指纹峰、焦槟榔配方颗粒中19个共有指纹峰，该指纹图谱可以区别槟榔与炮制品的配方颗粒。

技术特征：

1.一种槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)配制供试品溶液和参照物溶液：所述供试品溶液为槟榔或其炮制品提取得到的溶液，所述参照物为对照品，包括原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱；(2)利用超高效液相谱仪分别对供试品溶液和参照物溶液进行检测；(3)对照参照物确认共有峰，构建指纹图谱。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述炮制品为炒槟榔、焦槟榔。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述供试品包括槟榔及其炮制品的药材、饮片、提取物、标准汤剂、配方颗粒或者含有槟榔及其炮制品的经典名方的基准样品、制剂中间产品或成品。4.根据权利要求1所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述供试品溶液用提取溶剂提取供试品得到，提取溶剂与供试品的液固比为50～250ml/g，所述参照物溶液为用溶剂溶解对照品得到。5.根据权利要求4所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述提取溶剂为水、醇或醇-水溶液，所述溶剂为水、醇或醇-水溶液。6.根据权利要求5所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述醇为甲醇，醇-水溶液为甲醇-水溶液；配置供试品溶液时，甲醇-水溶液中的甲醇体积分数不低于10％；配置参照物溶液时，甲醇-水溶液中的甲醇体积分数不低于30％。7.根据权利要求1所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，原花青素b1溶液的浓度为70μg/ml，儿茶素的浓度为80μg/ml，表儿茶素的浓度为90μg/ml，去甲槟榔次碱的浓度为60μg/ml，槟榔次碱的浓度为50μg/ml，去甲槟榔碱的浓度为100μg/ml，氢溴酸槟榔的浓度为80μg/ml。8.根据权利要求1所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超高效液相谱仪的谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，谱柱柱长为100～150mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.6～1.8μm。9.根据权利要求8所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述谱柱选自cortecs t3、hss t3或beh c18。10.根据权利要求1所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超高效液相谱仪的流动相：a相为乙腈或甲醇，b相为用磷酸调ph值后的十二烷基硫酸钠水溶液，其质量浓度为0.001～0.060mol/l，ph值为2～4；所述超高效液相谱仪的检测器为紫外检测器、蒸发光散射检测器或电雾式检测器。11.根据权利要求10所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，检测时采用梯度洗脱程序：0min
→
14min
→
20min
→
35min
→
40min，a相的体积百分比：10％
→
18％
→
25％
→
35％
→
35％；流速：0.10～0.30ml/min，柱温：20～40℃，检测波长：200nm～250nm。12.根据权利要求11所述基于标准汤剂的槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法，其特征在于，利用超高效液相谱仪进行检测时，流动相：a相为乙腈，b相为用磷酸调ph值至3的0.002mol/l十二烷基硫酸钠溶液；流速：0.15～0.25ml/min，柱温：25～35℃，检测器：紫外检测器，检测波长：215nm。
13.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，当所述供试品为槟榔时，槟榔药材的指纹峰为21个，槟榔标准汤剂的指纹峰为16个，槟榔配方颗粒的指纹峰为14个，其中均有7个峰与对照品一致。14.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，其特征在于，当所述供试品为炒槟榔时，炒槟榔饮片的指纹峰为20个，炒槟榔标准汤剂的指纹峰为18个，炒槟榔配方颗粒的指纹峰为22个，其中均有7个峰与对照品一致。15.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，当所述供试品为焦槟榔时，焦槟榔饮片的指纹峰为19个，焦槟榔标准汤剂的指纹峰为17个，焦槟榔配方颗粒的指纹峰为19个，其中均有7个峰与对照品一致。16.权利要求1～15任一项所述构建方法得到槟榔及其炮制品指纹图谱。17.根据权利要求16所述的指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱中包含原花青素b1、儿茶素、表儿茶素、去甲槟榔次碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和槟榔碱的指纹峰。18.权利要求16或17任一项所述的指纹图谱在槟榔及其炮制品的经典名方的基准样品、制剂中间产品或成品质量评价中的应用。

技术总结

本发明公开了一种槟榔及其炮制品指纹图谱的构建方法及其指纹图谱和应用，本方法通过谱条件优化提高了分析效率，在较短的分析时间内获得了较多的共有峰。经过对照品的指认，确认了共有峰中包括了生物碱、多酚类及黄酮类成分，专属性较高，有利于产品的质量控制，并且通过指纹图谱共有峰的个数不同能够区分槟榔、炒槟榔和焦槟榔的样品，适于对槟榔、炒槟榔和焦槟榔的药材、饮片、提取物、标准汤剂、配方颗粒以及含有槟榔及其炮制品的经典名方的基准样品、制剂中间产品、成品进行快速、全面地质量控制，方法高效，适于连续化生产的质量监控。适于连续化生产的质量监控。适于连续化生产的质量监控。