目的：制定和规范Vero细胞制备的程序，保证生产用细胞质量。 范围：人用狂犬病疫苗生产用细胞的制备。
责任：细胞组全体人员对本规程实施负责。
程序：
1．材料
名称 规格
1.1MEM 6L/瓶 400ml/瓶
1.2精制小牛血清 400ml/瓶
1.33%谷氨酰胺 100ml/瓶 50ml/瓶
1.4庆大霉素溶液（1万单位/ml） 200ml/瓶 50ml/瓶
鸟笼灯
1.57.5%碳酸氢钠溶液地铁人员定位 400ml/瓶 50ml/红薯清洗机瓶
1.60.02%EDTA溶液 400ml/瓶
1.775%乙醇溶液
1.83%甲酚皂溶液
1.90.1%新洁尔灭溶液
1.100.85%生理盐水溶液
1.11注射用水（本室自制）
1.12二甲基亚砜
以上液体配制方法各自液体配制标准操作程序编号：
2．设备
2.1转瓶机 45瓶/台
2.24℃冰箱 1台
2.3-20℃组合式冰库 1个
2.437纳米铂金℃孵箱 1台
2.537℃恒温室
2.6不锈钢止血钳子 规格：20cm 16cm
2.7液氮罐
2.8不锈钢工作台
2.9不锈钢边台
2.10不锈钢双层车
2.11喷灯及管道
2.12不锈钢盒子 大 小
2.13倒置显微镜 1台
2.14乙醇罐
2.15大不锈钢盒
2.16小不锈钢盒
2.17栓盒
2.18安瓶封口器
2.19不锈钢单层车
3．器具
3.2吸耳球 1ml 10ml
3.3250ml 瓶
3.4500ml 瓶
3.5100ml 瓶
3.6方瓶、 大方瓶
3.73L瓶
3.810L瓶
3.9安瓶
3.10分液管道
3.11中试管架
3.12青瓶 10ml
3.13废液缸
3.16方瓶不锈钢盒
4．辅助材料
4.1灭菌纱布
4.2硫酸纸
4.3绳
4.6无毛布
4.7胶布
4.8剪刀
4.9裁纸刀
4.10封口膜
4.11砂锯片
4.12二连管（球）
4.13记号笔
4.14方瓶架
4.15高压灭菌指示卡
4.16镊子
假牙加工4.17脱脂棉
4.18细胞计数板
5．操作步骤
5.1生物反应器用细胞的制备（以制备900ml细胞悬液为例）
5.1.1细胞的复苏
5.1.1.1物品准备
5.1.1.1.14号栓、翻帽栓的准备
从干燥室取出20个4号栓，装入铺好无毛布的饭盒内，从干燥室取出20个翻帽栓， 装入铺好无毛布的饭盒内放入高压灭菌指示卡，盖好无毛布及盒盖，绑好。使用前121℃60分钟高压灭菌处理。
5.1.1.1.21ml、5ml、10ml吸管的准备
从干燥室取出1ml吸管放入吸管筒，准备1筒；将5ml吸管放入吸管筒，准备2筒；将10ml吸管放入吸管筒，准备2筒。使用前180℃2小时干热灭菌处理。
5.1.1.1.3250ml盐水瓶、500ml盐水瓶、大方瓶的准备
取洁净干燥的10个250ml盐水瓶、10个500ml盐水瓶、10个大方瓶，用2层硫酸纸包住瓶口，用绳绑紧，放入铺好硫酸纸的不锈钢盒内，盖上硫酸纸及盒盖，绑好。使用前180℃2小时干热灭菌处理。 5.1.1.1.4细胞：为V134代细胞，数量1支由2人复核检查其名称，批号，代次，日期，检查合格后填写相关的领用记录方可使用。
5.1.1.2工作环境
5.1.1.2.1仪器、设备运行，物品准备情况、灭菌指示卡、生产区状态都符合规定.
5.1.1.2.2操作人员按《进出洁净区标准操作规程》进入万级洁净区，打开层流罩，净化30分钟。
5.1.1.3复苏液的配制
配方：MEM+20%小牛血清+1%谷氨酰胺+1%庆大霉素溶液+2.5%NaHCO3
配制方法：取已干热灭菌过的10ml吸管一筒，在百级操作台上将吸管筒的筒盖取下，取出10ml吸球在火上烧一下，套在10ml吸管头上，取已灭菌的250ml空瓶一个，以无菌方法将瓶口打开，将瓶口倾斜30度角放在以准备好的配液架上，然后取MEM 400ml一瓶，打开翻帽栓的外帽，将瓶口在火焰上转圈烧一下，取下翻帽栓弃入不锈钢桶中，再烧一下瓶口，一手把住MEM瓶的瓶底，瓶签朝上，瓶身倾斜30度角，另一只手拿出套有吸球的10ml吸管，注意管身不能碰到任何暴露在外的物品，在火焰的保护下以无菌操作方法吸取MEM75.5ml加入到配液架上的250ml空瓶中，然后用同样的无菌操作方法分别吸取小牛血清20ml、谷氨酰胺1ml、庆大霉素溶液1ml、NaHCO3 溶液2.5ml加入到装有75.5ml MEM瓶
中，配制成100ml细胞维持液，取出饭盒内的翻帽栓，注意不能碰到翻帽栓的下部，将装有配制好的细胞生长液瓶的瓶口盖好，摇匀、备用。
5.1.1.4复苏细胞的操作步骤
首先用搪瓷杯准备38℃-40℃水，然后在冰库液氮罐中取出要复苏的细胞，取细胞时需认真核对标签信息，立即放入38℃-40℃水中速溶（细胞必须在1-2分钟内完全溶解）从水中取出安瓶，用75%乙醇消毒表面，取出5ml、10ml吸管各一筒在百级工作台上，将吸管筒盖打开，取出吸球在火上烧一下，套在吸管上，取出装有翻帽栓的饭盒打开，在火焰上烧一下瓶口，放在液体架上，再取出干热灭菌的大方瓶1耐高温盘根个，放在液体架上.用10ml吸管向大方瓶中加入50ml液体，然后用翻帽栓将剩余液体盖好，留做换液用，用砂锯片在安瓶颈部划一下，并从划痕处掰开安瓶，用5ml吸管吸出全部细胞悬液，慢慢加入大方瓶中，同时取上清做检定，然后将大方瓶在火焰封闭下盖上栓，拧紧、摇匀。在大方瓶上写上代次，日期，及冻存细胞的批号，将大方瓶放置在37℃恒温室静止培养过夜。
