修饰碳纳米材料、纳米簇、物质递送载体及药物组合物的制作方法

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1.本发明涉及修饰碳纳米材料、纳米簇、物质递送载体及药物组合物。
2.在本说明书中使用以下的符号：
3.ndc：羧基化纳米金刚石(carboxylated nano diamond)
4.nd：纳米金刚石(nano diamond)
5.ndc
‑
ori：未修饰的羧基化纳米金刚石原料
6.sp：超粒子(super particle)
7.ndc
‑
sp：用烷基修饰的羧基化纳米金刚石的纳米簇
8.peg：聚乙二醇
9.pegmem：聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯
10.dspe：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
11.f127：pluronic f127
12.cpt：喜树碱
13.ptx：紫杉醇

背景技术：

14.碳纳米金刚石(以下，称为“cnd”)除了具有金刚石固有的性质以外，还具有平均粒径小、比表面积大的表征，而且具有较为廉价、容易获取的优点。cnd可以通过爆炸法、高温高压法等来制造(专利文献1)。cnd由于毒性低、且具有优异的生物相容性及稳定的荧光特性，因此已广泛研究了其在生物医学领域的应用。另外，专利文献2、3公开了经修饰的cnd及其制造方法。
15.作为cnd在生物医学领域中的应用的例子，非专利文献1中报道了下述内容：通过在cnd上担载作为抗癌剂的顺铂而制作了顺铂
‑
cnd复合体；在ph为酸性范围的情况下，可以使顺铂从复合体游离出来；从复合体游离出的药剂保持了与游离的顺铂同等程度的细胞毒性。另外，非专利文献2中报道了通过利用疏水性相互作用使抗癌剂表阿霉素吸附于cnd表面、并进一步利用脂质囊泡包裹该表阿霉素
‑
cnd复合体，会提高溶解性，并报道了对于癌细胞的药物蓄积作用及效能，所述脂质囊泡结合了对大肠癌的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor；egfr)具有特异性的抗体(anti
‑
egfr
‑
peg)。
16.使药物担载于cnd而成的现有的复合体基本上存在药物担载量少、形成复合体后的水中分散性显著降低的问题。
17.为了提高cnd在水、极性有机溶剂中的溶解性、分散性及分散稳定性，已提出了利用高分子修饰cnd的表面。例如，专利文献4中报道了通过用包含聚甘油链的特定基团修饰纳米金刚石的表面，从而大幅提高在水、极性有机溶剂中的溶解性、分散性及分散稳定性。然而，在现有技术中，基本上都是主要着眼于提高cnd的分散性，而完全没有与利用了表面化学修饰后的cnd的自组装能力相关的评价、与以担载药物为目的的纳米结构控制相关的研究。
18.现有技术文献
19.专利文献
20.专利文献1：日本特开2010
‑
202458号公报
21.专利文献2：日本特开2017
‑
186234号公报
22.专利文献3：日本特开2017
‑
186235号公报
23.专利文献4：日本特开2010
‑
248023号公报
24.非专利文献
25.非专利文献1：bo guan et al.,small 2010,6,1514
‑
1519
26.非专利文献2：laura moore et al.,adv.mater.2013,25,3532
‑
3541

技术实现要素：

27.发明要解决的课题
28.本发明的主要目的在于提供能够有效地担载医药品、香料等生理活性物质、且在生理环境下显示出优异的溶解性的材料。
29.解决课题的方法
30.本发明提供以下的修饰碳纳米材料、纳米簇、物质递送载体及药物组合物。
31.项1.一种纳米簇，其是碳纳米材料自组装而成的纳米簇，所述碳纳米材料用高级烷基或高级烯基进行了修饰。
32.项2.根据项1所述的纳米簇，其中，碳纳米材料进一步用聚亚烷基二醇进行了修饰。
33.项3.根据项2所述的纳米簇，其用聚乙二醇进行了修饰。
34.项4.根据项1～3中任一项所述的纳米簇，其中，高级烷基或高级烯基、聚亚烷基二醇通过选自
‑
nh
‑
、
‑
o
‑
、
‑
co
‑
o
‑
、
‑
o
‑
co
‑
、
‑
co
‑
nh
‑
、
‑
nh
‑
co
‑
、
‑
nh
‑
co
‑
o
‑
、
‑
o
‑
co
‑
nh
‑
、
‑
o
‑
co
‑
o
‑
、及
‑
nh
‑
co
‑
nh
‑
中的任意连接基团连接于碳纳米材料。
35.项5.根据项1～4中任一项所述的纳米簇，其中，所述碳纳米材料具有选自oh、cooh及nh2中的至少1种表面基团，高级烷基或高级烯基经由所述表面基团键合于碳纳米材料。
36.项6.根据项2所述的纳米簇，其中，所述碳纳米材料具有选自oh、cooh及nh2中的至少1种表面基团，聚亚烷基二醇经由所述表面基团键合于碳纳米材料。
37.项7.根据项1～5中任一项所述的纳米簇，其与有效成分进行了复合。
38.项8.根据项7所述的纳米簇，其中，有效成分为生理活性物质、标记物质、香料、精油或有机素。
39.项9.根据项1～8中任一项所述的纳米簇，其中，碳纳米材料为碳纳米金刚石或碳纳米点。
40.项10.一种有效成分的递送载体，其包含项1～9中任一项所述的纳米簇。
41.项11.一种碳纳米材料，其用高级烷基和/或高级烯基进行了修饰、并且用聚亚烷基二醇进行了修饰。
42.项12.根据项11所述的碳纳米材料，其中，高级烷基或高级烯基、以及聚亚烷基二醇是通过选自
‑
nh
‑
、
‑
o
‑
、
‑
co
‑
o
‑
、
‑
o
‑
co
‑
、
‑
co
‑
nh
‑
、
‑
nh
‑
co
‑
、
‑
nh
‑
co
‑
o
‑
、
‑
o
‑
co
‑
nh
‑
、
‑
o
‑
co
‑
o
‑
、及
‑
nh
‑
co
‑
nh
‑
中的连接基团连接的。
43.项13.根据项11或12所述的碳纳米材料，其中，碳纳米材料为碳纳米金刚石。
44.项14.一种药物组合物，其包含项1所述的自组装而成的纳米簇，该纳米簇与药物进行了复合。
45.发明的效果
46.根据本发明，可以提供能够有效地担载生理活性物质、香料、有机素等有效成分、且在生理环境下显示出优异的溶解性的表面化学修饰碳纳米材料团簇、以及包含该纳米簇的药物组合物等复合材料。
附图说明
47.图1是利用了具有羧基的纳米金刚石(ndc)的超粒子(sp)(ndc
‑
sp)的合成方法。可以通过使ndc
‑
ori(由ndc形成的原料)的羧基和氨基封端烷基分子的氨基通过缩合反应而形成共价键、并进行超声波照射，从而制备自组装ndc
‑
sp纳米簇。
48.图2的a)是导入了烷基链长度不同的氨基封端烷基分子(c8
‑
nh2、c12
‑
nh2、c18
‑
nh2)的各种ndc
‑
sp水溶液的照片。nd浓度均为5.6mg ml
‑1。b)是各种ndc
‑
sp通过dls测定得到的粒径的结果。这些结果表明粒径依赖于烷基链的链长度而增大。这可以认为，在链长度增长时，ndc表面的疏水性增高，结果是ndc粒子间的相互作用增强，结果成为大粒径。c)是各种ndc
‑
sp的tem图像。在各图像的左上显示高倍率图像。这些图像表明，与dls(动态光散射)的结果同样，烷基链长度增大时，实际的粒径也增大。oct(c8)及oct(c8)
‑
ndc
‑
sp表示用辛基进行了修饰的ndc自组装而成的纳米簇，dod(c12)及dod(c12)
‑
ndc
‑
sp表示用十二烷基进行了修饰的ndc自组装而成的纳米簇，ole(c18)及ole(c18)
‑
ndc
‑
sp表示用油基进行了修饰的ndc自组装而成的纳米簇。
49.图3的a)是各种ndc
‑
sp及作为制造原料的ndc
‑
ori的uv
‑
vis
‑
nir吸收光谱。nd浓度统一为56μg ml
‑1。b)是ndc
‑
ori及各种ndc
‑
sp的热重(tga)测定结果。通过本测定结果可知，ndc
‑
sp中oct(c8)、dod(c12)、ole(c18)的团簇的比例分别为约13％w/w、约17％w/w、约35％w/w。
50.图4的a)是各种ndc
‑
sp的细胞毒性评价。测定了使各种ndc
‑
sp暴露于人骨肉瘤细胞(u2os)24小时后的生存率。b)是喜树碱(cpt)封入dod(c12)
‑
ndc
‑
sp前后的uv
‑
vis
‑
nir吸收光谱。cpt封入后可以确认到来自于cpt的明确的峰，因此表明cpt已被良好地导入ndc
‑
sp。c)是cpt@ndc
‑
ori、cpt@oct(c8)
‑
ndc
‑
sp、cpt@dod(c12)
‑
ndc
‑
sp的抗癌活性。示出了使用人u2os细胞将各种纳米复合体暴露24小时后的细胞生存率。可知，cpt@dod(c12)
‑
ndc
‑
sp具有比其它的纳米复合体高10％的抗癌活性。可以认为，通过来自于dod(c12)的长烷基链，与癌细胞的亲和性进一步提高，显示出高抗癌活性。d)导入了cpt的一般的纳米药物(pegmem、f127、dspe
‑
peg)和cpt@dod(c12)
‑
ndc
‑
sp在u2os中暴露24小时后的抗癌活性的比较试验。在使用了cpt@dod(c12)
‑
ndc
‑
sp的情况下，约90％的癌细胞死亡。该结果与pegmem(约34％死亡)、f127(约33％死亡)、dspe
‑
peg(约46％死亡)相比，可观察到最大57％的药理活性的改善。以上的结果强烈地表明，ndc
‑
sp作为抗癌剂的纳米载体是有用的。
51.图5是利用了具有氨基官能团的纳米金刚石(nda)的纳米簇(nda
‑
sp)的合成方法。通过使nda
‑
ori的氨基与具有羧基封端烷基链的化合物(naoc(c8)、nala(c12)、naole(c18))的羧基经缩合反应而与官能团形成共价键、并进行超声波照射，由此可以制备自组
装nda
‑
sp纳米簇。
52.图6的a)是具有与原料nda
‑
ori不同的烷基链的各种nda
‑
sps(naoc(c8)、nala(c12)、naole(c18))水溶液的照片。各水溶液中的nd浓度为3mg ml
‑1。b)是nda
‑
ori及各种nda
‑
sps通过dls测定得到的粒径。可知，可以依赖于烷基链长度而控制粒径。c)是各种nda
‑
sps的tem图像。可知，粒径会依赖于烷基链长度而增大，而这是与dls的结果相互补充的。d)是nda
‑
ori及各种nda
‑
sp的高倍率tem图像。naoc(c8)
‑
nda
‑
sp表示用辛基进行了修饰的nda自组装而成的纳米簇，nala(c12)
‑
nda
‑
sp表示用十二烷基进行了修饰的nda自组装而成的纳米簇，naole(c18)
‑
nda
‑
sp表示用油基进行了修饰的nda自组装而成的纳米簇。
53.图7的a)是nda
‑
ori及各种nda
‑
sps(naoc(c8)
‑
nda
‑
sp、nala(c12)
‑
nda
‑
sp、naole(c18)
‑
nda
‑
sp)的uv
‑
vis
‑
nir吸收光谱。各水溶液中的nd浓度为30μg ml
‑1。b)是nda
‑
ori及各种nda
‑
sps(naoc(c8)
‑
nda
‑
sp、nala(c12)
‑
nda
‑
sp、naole(c18)
‑
nda
‑
sp)的tga测定。可知nda
‑
sps中的naoc(c8)、nala(c12)、naole(c18)分别为约8％w/w、约17％w/w、约24％w/w。c)是nda
‑
ori及各种nda
‑
sps的氨基量(nh2loading)和界面张力。氨基的定量使用kaiser检验，将nda
‑
ori设为100％，计算出各纳米粒子中的氨基量。表面张力测定了水温25℃、nd浓度为3mg ml
‑1的样品。可知，由于烷基链的导入，nda
‑
sps中的氨基减少。另外，与nda
‑
ori相比，nda
‑
sps均观察到了表面张力的降低。该结果表明，通过导入烷基链而使nda
‑
sp带有表面活性剂样的性质。d)是各种nda
‑
sps的细胞毒性评价。在本试验中，使用u2os细胞，通过wst
‑
8测定了将各种纳米粒子暴露24小时后的细胞生存率。该结果可知，nda
‑
sps(naoc(c8)
‑
nda
‑
sp、nala(c12)
‑
nda
‑
sp、naole(c18)
‑
nda
‑
sp)的细胞毒性均较低。
54.图8是用聚乙二醇(peg)包覆的nda
‑
sp(peg coated
‑
nda
‑
sp或peg
‑
nda
‑
sp)的合成和利用非共价键向peg
‑
nda
‑
sp内封入药物。本研究中的peg修饰没有使用粒径大的naole(c18)
‑
nda
‑
sp(平均粒径167nm)。其原因可以认为是由于，纳米粒子的epr效果的显现在100nm以下是最优的，100nm以上的naole(c18)
‑
nda
‑
sp不适合实验。
55.图9的a)是导入了紫杉醇(ptx)的050gs
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp在刚刚合成后和24小时后的照片。纳米复合体中的nd和ptx浓度分别为0.3、0.1mg ml
‑1。在24小时后，形成了沉淀，可以认为分散稳定性不高，因此以下的实验中没有使用050gs
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp。需要说明的是，050gs表示使用作为市售品的sunbright(注册商标)me
‑
050gs导入了peg。b)是8arm
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp和8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp在刚刚合成后和24小时后的照片。所有的纳米复合体均使用了nd浓度为3mg ml
‑1的nda
‑
sp。充分利用8arm时，可以提高nda
‑
sp的分散性。但是，最终产物的8arm
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp的分散性过度提高，因此能够通过离心分离而回收的纳米粒子的浓度低。根据以上的结果，在以下的试验中，在实验中使用了8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp。需要说明的是，8
‑
arm表示通过作为市售品的8
‑
armpeg
‑
scm将peg基导入了nda。
56.图10的a)是导入了ptx的peg修饰nda
‑
sps(050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp、8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp)、peg未修饰nda
‑
sps(naoc(c8)
‑
nda
‑
sp及nala(c12)
‑
nda
‑
sp)在24小时后的水中分散性。纳米复合体中的nda和ptx浓度分别为3mg ml
‑1、1mg ml
‑1。可知，用050gs和8arm包覆的nda
‑
sp在导入ptx后也具有高水中分散性。根据以上的导入药物后的水中分散性的结果，在本研究中，在以下的实验中使用了050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp和8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp作为药物载体。b)是peg
‑
nda
‑
sp在导入ptx前后的平均粒径的变化。c)是导入
了ptx的peg
‑
nda
‑
sps(050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp和8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp)的经过5天的水中分散稳定性的评价。数据表示ptx@050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp(左)和ptx@8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp水溶液(右)的经时的dls测定值(粒径)。内部的照片是刚刚合成后和5天后的情况。可知完全没有观察到凝聚物。
57.图11的a)是050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp和8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp的tem图像。b)是ptx@050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp、ptx@8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp、ptx的uv
‑
vis
‑
nir吸收光谱。由于在各纳米复合体中可以确认到来自于ptx的峰，因此能够确认ptx如示意图那样被成功地封入。
58.图12是导入了ptx的peg
‑
nda
‑
sp的抗癌活性评价。a)是050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp(左)和8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp(右)在skov3、u2os、tig3中暴露24小时后的细胞毒性评价。b)是ptx@050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp及ptx@8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp与fda批准的ptx制剂abraxane的抗癌活性比较试验。考察了利用skov3细胞将各种纳米复合体暴露24小时后(左)及48小时后(右)的情况。c)是将各种纳米复合体暴露24小时后的skov3细胞的相位差图像(phase)及结晶紫染图像(cv staining)。050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp和8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp中的nd浓度为30μg ml
‑1。ptx@050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp和ptx@8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp中的ptx及nd浓度分别为10ng ml
‑1、30ng ml
‑1。根据图像可知，ptx@050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp和ptx@8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp的抗癌活性显著高。
具体实施方式
59.在本说明书中，碳纳米材料包含碳纳米金刚石、碳纳米点。
60.纳米簇的制造所使用的碳纳米材料用高级烷基或高级烯基进行了修饰。有时将用这些官能团进行了修饰的碳纳米材料记载为“修饰碳纳米材料”。
61.本发明的修饰碳纳米材料包含0.0001～30质量％左右、优选包含0.001～20质量％左右、优选包含0.01～15质量％左右、优选包含0.05～10质量％左右的高级烷基或高级烯基。
62.高级烷基或高级烯基通过2价的连接基团连接于碳纳米材料。作为2价的连接基团，可以列举：
‑
nh
‑
、
‑
o
‑
、
‑
co
‑
o
‑
、
‑
o
‑
co
‑
、
‑
co
‑
nh
‑
、
‑
nh
‑
co
‑
、
‑
nh
‑
co
‑
o
‑
、
‑
o
‑
co
‑
nh
‑
、
‑
o
‑
co
‑
o
‑
、
‑
nh
‑
co
‑
nh
‑
。
63.作为高级烷基，可以列举：己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、异十六烷基、十七烷基、十八烷基、异十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基等直链或具有支链的c6‑
c
24
烷基，优选可以列举c8‑
c
18
烷基，更优选可以列举c8‑
c
14
烷基，进一步优选可以列举c
10
‑
c
14
烷基。
64.作为高级烯基，可以列举：己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基(棕榈油基)、异十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基(油烯基、ole)、异十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基等直链或具有支链的c6‑
c
24
烯基，优选可以列举c8‑
c
18
烯基，更优选可以列举c
12
‑
c
18
烯基，进一步优选可以列举c
14
‑
c
18
烯基。
65.本发明的纳米簇的制造所使用的碳纳米材料可以进一步用聚亚烷基二醇进行了
修饰。作为聚亚烷基二醇，可以列举：聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚乙二醇
‑
聚丙二醇嵌段共聚物等。
66.利用高级烷基和/或高级烯基和聚亚烷基二醇进行的修饰前的碳纳米材料的初级粒子的平均粒径优选为10nm以下，更优选为1～10nm。
67.利用高级烷基和/或高级烯基、和聚亚烷基二醇进行了的修饰的碳纳米材料的初级粒子的平均粒径优选为12nm以下，更优选为1～12nm，进一步优选为3～12nm。
68.修饰前或修饰后的碳纳米材料的初级粒子的平均粒径可以通过动态光散射法进行测定，可以使用x射线衍射装置(商品名“s mart lab”，rigaku公司制)通过小角x射线散射测定(saxs法)来确定。
69.本发明的纳米簇的制造所使用的碳纳米材料优选使用在表面具有大量oh、cooh、nh2等官能团的碳纳米材料(以下，有时记载为“cnm”)。在表面具有大量oh、cooh、nh2等基团的碳纳米材料是公知的，使用这样的材料、按照以下的路线图(1)～(10)，可以得到用高级烷基或高级烯基进行了修饰的碳纳米材料。
70.路线图
71.[化学式1]
[0072][0073]
[化学式2]
[0074][0075]
(式中，x表示cl、br或i。cnm表示碳纳米材料。n1表示1以上的整数。n2表示0以上的整数。r表示高级烷基或高级烯基。)
[0076]
上述路线图(1)～(10)的反应可以按照通常方法进行，对于具有oh、nh2或cooh的表面基团的碳纳米材料1g，使用1mg～过量的r
‑
cox、r
‑
nh2、r
‑
oh、r
‑
x中的任意化合物，在0℃～溶剂沸腾的温度下反应1～24小时，由此可以得到目标产物。作为溶剂，可以列举：氯仿、二氯甲烷、1,2
‑
二氯乙烷等卤代烃、甲苯等芳香族烃、四氢呋喃、乙醚、二异丙醚等。
[0077]
经上述路线图(1)～(10)得到的化合物(ia)～(ij)可以进一步通过使未反应的各官能团(oh、cooh、nh2)与聚亚烷基二醇化试剂(r2‑
y2‑
x2；这里，r2表示包含聚亚烷基二醇部分的基团，y2表示单键或2价的间隔基团，x2表示nh2、oh、cooh、n
‑
羟基琥珀酰亚胺)反应而以聚亚烷基二醇进行修饰。作为2价的间隔基团，可以列举：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚苯基(1,2
‑
、1,3
‑
、1,4
‑
)、
‑
ch2ch2o
‑
、
‑
ch2ch2ch2o
‑
、
‑
ch2ch2ch2ch2o
‑
、
‑
ch2ch2nh
‑
、
‑
ch2ch2ch2nh
‑
、
‑
ch2ch2ch2ch2nh
‑
、
‑
ch2ch2conh
‑
、
‑
ch2ch2ch2conh
‑
、
‑
ch2ch2ch2ch2conh
‑
、
‑
ch2ch2nhco
‑
、
‑
ch2ch2ch2nhco
‑
、
‑
ch2ch2ch2ch2nhco
‑
、
‑
ch2ch2co
‑
、
‑
ch2ch2ch2co
‑
、
‑
ch2ch2ch2ch2co
‑
、
‑
ch2ch2coo
‑
、
‑
ch2ch2ch2coo
‑
、
‑
ch2ch2ch2ch2coo
‑
、
‑
ch2ch2oco
‑
、
‑
ch2ch2ch2oco
‑
、
‑
ch2ch2ch2ch2oco
‑
等，可列举这些间隔基团中的单独1种、或者将2种以上组合而成的基团。在导入聚亚烷基二醇的反应中，相对于化合物(ia)～(ij)1g，使用100mg～过量的聚亚烷基二醇化试剂，在0℃～溶剂沸腾的温度下反应1～24小时，由此可以得到目标的碳纳米材料，所述目标的碳纳米材料是用高级烷基和/或高级烯基进行了修饰、并且用聚亚烷基二醇进行了修饰的碳纳米材料。作为溶剂，可以列举：氯仿、二氯甲烷、1,2
‑
二氯乙烷等卤代烃、甲苯等芳香族烃、四氢呋喃、乙醚、二异丙醚等。
[0078]
本发明的纳米簇可以通过将用高级烷基和/或高级烯基、并根据需要进一步用聚亚烷基二醇基进行了修饰的碳纳米材料悬浮于水或缓冲液等适当的水性介质、并进行超声波照射，从而进行自组装而制作。在超声波照射后，可以通过离心分离等纯化操作去除未形成团簇的未反应的官能团修饰碳纳米材料，从而将自组装纳米簇分离。
[0079]
本发明的纳米簇可以通过悬浮于包含有效成分的适当溶剂中而与有效成分进行
复合。有效成分存在于纳米簇的表面或内部。作为有效成分，可以列举：生理活性物质、标记物质、精油、香料、有机素等。
[0080]
作为标记物质，可以列举：荧光素、俄勒冈绿(oregon green)、曙红、赤藓红等荧光素类；四甲基罗丹明衍生物、德克萨斯红衍生物、罗丹明b碱性、丽丝胺罗丹明b、罗丹明6g等罗丹明类；香豆素类；丹酰型(二甲基氨基萘磺酸型)荧光素；nbd型素；芘；r
‑
藻红蛋白、藻蓝蛋白(phlophycocyanin)、别藻蓝蛋白等藻胆蛋白；bodipy衍生物；cy3、cy3.5、cy5、cy5.5等cy(注册商标)素；alexa fluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、680、700、750等alexa(注册商标)fluor等。这些标记物质可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0081]
作为精油，可以列举：甜橙、苦橙、苦橙叶(petitgrain)、柠檬、葡萄柚、酸橙、佛手柑、橘、橙花、薄荷、留兰香、薰衣草、洋甘菊、迷迭香、桉树、鼠尾草、罗勒、玫瑰、天竺葵、茉莉花、依兰、茴芹、茴香、八角茴香、丁香、肉桂、姜、肉豆蔻、小豆蔻、蛇麻草、日本雪松、柏树、香根草、广藿香(patchouli)、赖百当(labdanum)等，这些精油可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0082]
作为香料的成分，可以列举：l
‑
薄荷醇、α
‑
蒎烯、β
‑
蒎烯、月桂烯、莰烯、柠檬烯等单萜烯、巴伦西亚橘烯、雪松烯、石竹烯、长叶烯等倍半萜烯、1,3,5
‑
十一碳三烯、丁醇、戊醇、异戊醇、己醇、异戊烯醇、(z)
‑3‑
己烯
‑1‑
醇、2,6
‑
壬二烯醇、芳樟醇、香叶醇、香茅醇、四氢月桂烯醇、法呢醇、橙花叔醇、雪松醇、苯甲醇、苯乙醇、糠醇、乙醛、异戊醛、己醛、辛酸、壬醛、癸醛、(e)
‑2‑
己烯醛、2,4
‑
辛二烯醛、香茅醛、柠檬醛、苯甲醛、肉桂醛、香草醛、乙基香草醛、糠醛、、2
‑
庚酮、2
‑
十一烷酮、1
‑
辛烯
‑3‑
酮、乙偶姻、二乙酰、2,3
‑
戊二酮、麦芽酚、乙基麦芽酚、2,5
‑
二甲基
‑4‑
羟基
‑
3(2h)
‑
呋喃酮、羟基酮、香芹酮、薄荷酮、诺卡酮等萜烯酮、α
‑
紫罗兰酮、β
‑
紫罗兰酮、β
‑
大马酮、树莓酮酮、玫瑰醚(rose oxide)、芳樟醇氧化物、薄荷呋喃、茶螺烷、甲基胡椒酚、茴香烯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、乙酸熏衣草酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸苄酯、水杨酸甲酯、γ
‑
癸内酯、γ
‑
十二内酯、δ
‑
癸内酯、δ
‑
十二内酯、7
‑
癸烯
‑4‑
内酯、2
‑
癸烯
‑5‑
内酯、丁酸、4
‑
甲基
‑3‑
戊烯酸、辛酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、吲哚、粪臭素、吡啶、烷基取代吡嗪、甲酯、甲硫醇、糠基硫醇、二甲基硫醚、二甲基二硫醚、二糠基二硫醚、异硫氰酸烯丙酯等，这些香料可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0083]
作为有机素，可以列举：胭脂树橙素、胭脂虫红素、红曲霉素、β
‑
胡萝卜素、木槿素、硫化黄、可可素、核黄素、叶绿素、焦糖、胭脂树橙、胭脂红、虫胶酸、巴西红木红、藏红花素、紫草素、紫苏素、芦丁等。
[0084]
与有效成分复合化后的本发明的纳米簇，在对哺乳动物(人、小鼠、大鼠、仓鼠、马、牛、猪、山羊、绵羊、兔、犬、猫等)的生物体内或皮肤给药或适用时，会缓慢地释放出有效成分。因此，与有效成分复合化后的本发明的纳米簇作为医药品或药物组合物、化妆品、口腔用组合物是有用的。作为化妆品，可以列举：粉底、扑面粉、润肤乳、乳液、口红、化妆水、美容液、按摩霜、保湿霜、面膜、洗面奶、洗发水、护发素、养发剂、身体粉等。作为口腔用组合物，可以列举：漱口药、漱口水、牙膏、牙粉、口香糖、饴糖、软糖、汽水糖等。作为医药品的剂型，可以列举：片剂、胶囊剂、含片剂、丸剂、咀嚼片、注射剂、栓剂、糖浆剂、软膏剂、硬膏剂等。另外，本发明的纳米簇会缓慢地释放出有效成分，因此作为有效成分的递送载体是有用的。
[0085]
生理活性物质包含药物、核酸、蛋白质。作为药物，可以列举：抗肿瘤剂、抗高血压剂、抗低血压剂、抗精神病剂、镇痛剂、抗抑郁剂、抗躁狂剂、抗焦虑剂、镇静剂、催眠剂、抗癫痫剂、阿片激动剂(opioid agonist)、哮喘剂、麻醉剂、抗心律不齐剂、关节炎剂、抗痉挛剂、ace抑制剂、减充血剂、抗生素、抗心绞痛剂、利尿剂、抗帕金森氏病剂、支气管扩张剂、抗利尿剂、利尿剂、抗高血脂剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、止吐剂、抗感染剂、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗糖尿病剂、抗过敏剂、解热剂、抗痛风剂、抗组胺剂、止痒剂、骨调节剂、心血管剂、降胆固醇剂、抗疟疾剂、止咳剂、祛痰剂、粘液溶解剂、鼻塞用药剂、多巴胺激动剂、消化道用药剂、肌肉松弛剂、神经肌肉阻滞剂、副交感神经激动剂、前列腺素、兴奋剂、食欲抑制剂、甲状腺剂或抗甲状腺剂、激素、抗偏头痛剂、抗肥胖剂、抗炎剂等。优选的药物为抗肿瘤剂。作为抗肿瘤剂，可以列举：激素剂(例如，磷雌酚、己烯雌酚、氯烯雌醚(chlorotrianserine)、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、达那唑、烯丙雌醇、孕三烯酮、美帕曲星、雷洛昔芬、奥美昔芬、左美洛昔芬、抗雌激素(例如，枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬等)、口服制剂、美雄烷、二氢睾内酯、氨鲁米特、lh
‑
rh激动剂(例如，醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等)、屈洛昔芬、环硫雄醇、乙炔雌二醇磺酸酯、芳香化酶抑制剂(例如，盐酸法倔唑、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏罗唑、福美司坦等)、抗雄激素(例如，氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特等)、5α
‑
还原酶抑制剂(例如，非那雄胺、爱普列特等)、肾上腺皮质激素类药剂(例如，地塞米松、泼尼松龙、倍他米松、曲安西龙等)、雄激素合成抑制剂(例如，阿比特龙等)、类视黄醇及延缓类视黄醇代谢的药剂(例如，利阿唑等)等，其中，可以列举：lh
‑
rh激动剂(例如，醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等))、烷化剂(例如，氮芥、氮芥n
‑
氧化物盐酸盐(nitrogen mustard n
‑
oxide hydrochloride)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替哌、卡波醌、甲磺英丙舒凡、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、米尔法兰、达卡巴嗪、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、曲他胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、溴丙哌嗪、依托格鲁、卡铂、顺铂、米帕、奈达铂、奥沙利铂、六甲密胺、氨莫司汀、二溴螺氯铵(dibrospidium hydrochloride)、福莫司汀、泼尼莫司汀、嘌嘧替派、盐酸苯达莫司汀(ribomustin)、替莫唑胺、曲奥舒凡、曲磷胺、净司他丁苯马聚合物、卡波醌、阿多来新、半胱胺亚硝脲(cystemustine)、比折来新)、代谢拮抗剂(例如，巯基嘌呤、6
‑
巯基嘌呤核苷、硫代肌苷、甲氨蝶呤、依诺他滨、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytarabine ocfosphate)、盐酸环胞苷、5
‑
fu类药剂(例如，氟尿嘧啶、替加氟、uft、去氧氟尿苷、卡莫氟、加洛他滨、乙嘧替氟等)、氨基喋呤、亚叶酸钙(calcium leucovorin)、硫鸟嘌呤(tabloid)、甘氨硫嘌呤(butocin)、甲酰四氢叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、米托胍腙、噻唑羧胺核苷、氨莫司汀)、抗癌抗生素(例如，放线菌素d、放线菌素c、丝裂霉素c、霉素a3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸表阿霉素、新制癌菌素、光辉霉素、肉瘤霉素(sarkomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸伊达比星)、植物来源的抗癌剂(例如，依托泊苷、磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊甙、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、喜树碱、盐酸伊立替康)、免疫剂(brm)(例如，溶链菌(picibanil)、云芝多糖(krestin)、裂裥多糖、香菇多糖、乌苯美司、干扰素、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、淋巴毒素、bcg疫苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑、云芝多糖(polysaccharide)
k、丙考达唑)、抑制细胞生长因子及其受体的作用的药剂(例如，曲妥珠单抗(赫赛汀(herceptin)(商标)；抗her2抗体)、zd1839(易瑞沙)、格列卫(gleevec)等抗体药物)。作为成为抗肿瘤剂的对象的癌的种类，可以列举：结肠/直肠癌、肝癌、肾癌、头颈癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆囊/胆管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、骨骼/软组织肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、脑瘤等，优选可以列举：结肠/直肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胆道癌、肝癌。
[0086]
作为核酸，没有特别限制，可以是dna、rna、dna和rna的嵌合核酸、dna/rna的杂合体等中的任意核酸。另外，核酸可以使用1～3链中的任意核酸，优选为单链或双链。核酸可以是作为嘌呤碱或嘧啶碱的n
‑
糖苷的其它类型核苷酸、或者具有非核苷酸骨架的其它低聚物(例如，市售的肽核酸(pna)等)或含有特殊键的其它低聚物(其中，该低聚物含有核苷酸，所述核苷酸具有允许存在可在dna、rna中观察到的碱基对、碱基附着的配置)等。进一步，可以是被附加了公知的修饰的核酸，例如具有该领域已知的标记的核酸、加帽的核酸、甲基化的核酸、用类似物取代1个以上天然核苷酸而得到的核酸、进行了分子内核苷酸修饰的核酸、例如具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的核酸、具有带电荷的键或含硫键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核酸、例如蛋白质(核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽等)、糖(例如，单糖等)等具有侧链基团的核酸、具有插层化合物(例如，吖啶、补骨脂素等)的核酸、含有螯合物(例如，金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性的金属等)的核酸、含有烷化剂的核酸、具有经修饰的键的核酸(例如，α异头型的核酸等)。作为优选的核酸，可以举出sirna等rna。
[0087]
sirna是指由与靶基因的mrna、或初始转录产物的核苷酸序列或其部分序列(优选为编码区域内)(初始转录产物的情况下包含内含子部分)同源的核苷酸序列和其互补链形成的双链寡rna。sirna中包含的与靶核苷酸序列同源的部分的长度通常约为18个碱基以上、例如为约20个碱基左右(代表性地为约21～23个碱基长度)的长度，只要可以引起rna干扰则没有特别限定。另外，sirna的全长也通常约为18个碱基以上、例如为约20个碱基左右(代表性地为约21～23个碱基长度)的长度，只要可以引起rna干扰则没有特别限定。
[0088]
关于靶核苷酸序列与sirna中包含的与其同源的序列的关系，可以100％一致，也可以有碱基的突变(可以是至少70％、优选80％、更优选90％、最优选95％以上的同一性的范围内)。
[0089]
sirna可以在5’或3’末端具有由5个碱基以下、优选由2个碱基构成的、未形成碱基对的添加的碱基。该添加的碱基可以是dna也可以是rna，在使用dna时，可以提高sirna的稳定性。作为这样的添加的碱基的序列，可以列举例如：ug
‑3’
、uu
‑3’
、tg
‑3’
、tt
‑3’
、ggg
‑3’
、guuu
‑3’
、gttt
‑3’
、ttttt
‑3’
、uuuuu
‑3’
等序列，但并不限定于此。
[0090]
sirna可以是相对于任意的靶基因的sirna。sirna优选为其表达增加以与对象疾病的发病和/或恶化相关的基因作为标靶的sirna，更具体而言，可以举出相对于该基因的反义核酸以进行到了临床阶段或临床前阶段的基因、新发现的基因作为标靶的sirna等。
[0091]
sirna可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0092]
作为蛋白质，可以列举：酶、受体、抗体、抗原、干扰素、白细胞介素等细胞因子等。
[0093]
本发明的纳米簇的平均粒径为1～1000nm左右，优选为3～800nm左右，更优选为5～500nm左右，进一步优选为10～300nm左右，特别为30～250nm左右。
[0094]
作为纳米簇的ζ电位，优选为5～30mv左右，更优选为10～25mv左右。
[0095]
在本发明的纳米簇与有效成分进行了复合的情况下，相对于纳米簇100质量份，包含5～50质量份左右、优选包含10～20质量份左右的有效成分。
[0096]
实施例
[0097]
以下，基于实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[0098]
实施例1
[0099]
＜实验方法＞
[0100]
1.充分利用了羧基化纳米金刚石的超粒子复合体的合成
[0101]
羧基化纳米金刚石(ndc)(粒径：4
‑
5nm)按照日本特开2017
‑
202940或日本特开2016
‑
113333的记载、通过爆轰法而制备。合成的ndc通过硝酸进行纯化，在氢气氛围下进行烧制。利用有机元素分析装置(micro corder jm10；j
‑
science lab co.,ltd,kyoto,japan)进行了ndc的元素分析，结果可知c(86.92％)、h(0.44％)、n(2.29％)。利用珠磨机(sand grinder lsg
‑
4u；aimex co.,ltd,tokyo,japan)使纯化后的ndc分散在蒸馏水中。接着，将ndc分散水溶液进行离心分离，将不溶于水的nd除去。将得到的上清溶液(ndc
‑
ori)用于随后的实验。将1ml的ndc
‑
ori分散水溶液(nd浓度＝56mg ml
‑1)、任意的末端氨基化烷基分子(50μl的正辛胺(oct(c8))、50μl的油胺(ole(c18))、10mg的十二胺(dod(c12))(均从fujifilm wako pure chemical,osaka,japan购入))、10mg的1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(wsc)(fujifilm wako pure chemical)加入9ml的2
‑
(n
‑
吗啉代)乙烷磺酸(mes)缓冲液(ph6.0、100mm)，使用槽式超声波照射装置(输出功率＝80w、振荡频率＝40khz)(usd
‑
2r；as one,osaka,japan)照射了5分钟。在室温下利用搅拌器剧烈搅拌1.5小时后，对混合物进行离心分离，用milli
‑
q水清洗3次。将10ml的milli
‑
q水加入至通过离心分离得到的沉淀物，通过使用脉冲型超声波照射装置(vcx
‑
600；sonics,danbury,ct,usa)照射10分钟超声波，使其再分散。将该羧基化纳米金刚石超粒子(ndc
‑
sp)分散液用于随后的实验。得到的羧基化纳米金刚石超粒子(ndc
‑
sp)分散液为oct(c8)
‑
ndc
‑
sp、dod(c12)
‑
ndc
‑
sp、ole(c18)
‑
ndc
‑
sp这3种，它们均构成了纳米簇(图2(b)、图2(c))。通过紫外
‑
可见光
‑
近红外分光光度计(v
‑
730bio；jasco,tokyo,japan)确定了最终产物中的nd浓度为约5.6mg ml
‑1。另外，通过热重分析(q 500；ta instruments,new castle,de,usa)确定了ndc
‑
sp(团簇)中的oct(c8)、dod(c12)、ole(c18)分别为约13％w/w、约17％w/w、约35％w/w。
[0102]
cpt@oct(c8)
‑
ndc
‑
sp和cpt@dod(c12)
‑
ndc
‑
sp复合体通过以下的方法进行制备。将由通过离心分离进行了清洗的oct(c8)
‑
ndc
‑
sp或dod(c12)
‑
ndc
‑
sp构成的沉淀物与10mg的cpt(fujifilm wako pure chemical)在10ml的milli
‑
q水中混合，照射了10分钟脉冲超声波。cpt@ndc
‑
ori通过将10mg的cpt、1ml的ndc
‑
or水溶液、9ml的milli
‑
q水混合并照射10分钟脉冲超声波而制备。cpt@oct(c8)
‑
ndc
‑
sp和cpt@dod(c12)
‑
ndc
‑
sp复合体均构成了纳米簇(图4(b)、图4(c)、图4(d))。cpt@pegmem、cpt@f127、cpt@dspe
‑
peg是使用56mg的聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(pegmem)(sigma
‑
aldrich,st.louis,mo,usa)、56mg的pluronic f127(f127)(fujifilm wako pure chemical)、或56mg的n
‑
(氨丙基聚乙二醇)氨基甲酰基二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe
‑
peg)(sunbright dspe
‑
020pa；yuka sangyo,tokyo,japan)来代替nd沉淀物，通过同样的方法制备的。
[0103]
2.充分利用了氨基化纳米金刚石的超粒子复合体的合成
[0104]
氨基化纳米金刚石(nda)(粒径：4
‑
5nm)按照已知的制备方法合成(v.v.danilenko,combust.,explos.shock waves 2005,41,577；v.y.dolmatov,j.superhard mater.2008,30,233；v.y.dolmatov,v.myllymaki and a.vehanen,j.superhard mater.2013,35,143.)。将合成的nda用硝酸纯化，在氢气氛围下进行烧制。nda的元素分析[含量为c(92.20％)、h(0.74％)及n(2.30％)]通过有机元素分析装置(micro corder jm10；j
‑
science lab co.,ltd,kyoto,japan)进行了分析。利用珠磨机(sand grinder lsg
‑
4u；aimex co.,ltd,tokyo,japan)使纯化后的nda分散在蒸馏水中。接着，对该nda分散液进行离心，将不溶于水的nd除去。将得到的上清分散液(nda
‑
ori)用于随后的实验。使用槽式超声波照射装置(输出功率：80w、振荡频率：40khz)(usd
‑
2r；as one,osaka,japan)在9ml的mes缓冲液(ph6.0,100mm)中对1ml的nda
‑
ori分散液(nd浓度＝30mg ml
‑1)、10mg的羧基封端烷基链(辛酸钠(naoc(c8))、月桂酸钠(nala(c12))、或油酸钠(naole(c18))(均从fujifilm wako pure chemical购入)、10mg的wsc进行5分钟超声波照射，从而使其溶解。将该混合物在室温下用搅拌器进一步剧烈搅拌1.5小时后，使用离心分离用mill
‑
q水清洗3次，去除了未反应物质。通过使用脉冲型超声波照射装置对由离心分离得到的颗粒照射10分钟超声波，使其再分散于10ml的mill
‑
q水。得到的氨基化纳米金刚石超粒子(nda
‑
sp)分散液为naoc(c8)
‑
nda
‑
sp、nala(c12)
‑
nda
‑
sp、naole(c18)
‑
nda
‑
sp这3种，它们均构成了纳米簇(图6(c)、图6(d))。
[0105]
将该nda
‑
sp分散液用于后续的实验。另外，nda
‑
sp分散液中的nd浓度(～3mg ml
‑1)通过uv
‑
vis
‑
nir分光光度计进行了测定
した
(图7(a))。另外，nda
‑
sp中的naoc(c8)(～8％w/w)、nala(c12)(～17％w/w)、naole(c18)(～24％w/w)使用热重分析(tga)(q 500；ta instruments,new castle,de,usa)进行了估算。
[0106]
nd表面上的氨基使用kaiser test kit(60017
‑
1ea；sigma
‑
aldrich)、按照已知的方法(yue yu et al.nanoscale 10,8969
‑
8978(2018).)进行了定量(图7(c))。
[0107]
各种nda
‑
sp的表面张力通过mitsui chemical analysis&consulting service(tokyo,japan)、使用表面张力仪(cbvp
‑
z；kyowa interface science co.)进行了测定(图7(c))。
[0108]
peg修饰的nda
‑
sp(peg
‑
nda
‑
sp)通过以下方法合成(图8)。将1ml的mes缓冲液(ph 6.0、500mm)加入10ml的naoc(c8)
‑
nda
‑
sp水溶液或10ml的nala(c12)
‑
nda
‑
sp。进行离心分离(15000rpm、10分钟)，小心地去除透明的上清溶液。接着，向离心分离后的颗粒中加入包含20mg的α
‑
琥珀酰亚胺氧基戊二酰基
‑
ω
‑
甲氧基聚氧乙烯(α
‑
succinimidyloxyglutaryl
‑
ω
‑
methoxy,polyoxyethylene)(sunbright me
‑
050gs；yuka sangyo,tokyo,japan)(050gs)或20mg的六聚甘油八(琥珀酰亚胺氧基戊二酰基)聚氧乙烯(hexaglycerol octa(succinimidyloxyglutaryl)polyoxyethylene)(8
‑
armpeg
‑
scm；funakoshi,tokyo,japan)(8arm)的5ml的dmso(fujifilm wako pure chemical)。将混合物进行30分钟超声波照射后，在室温下剧烈搅拌过夜。最后，将1ml的mes缓冲液(ph6.0、100mm)加入反应液，通过milli
‑
q水和离心分离清洗3次。通过在10ml的milli
‑
q水中对得到的颗粒照射10分钟脉冲超声波，使其再分散。将合成的050gs包覆naoc(c8)
‑
nda
‑
sp(050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp)水溶液(nd浓度：～3mg ml
‑1)和8arm包覆nala(c12)
‑
nda
‑
sp(8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp)(nd浓度：～3mg ml
‑1)用于随后的实验。它们构成了纳米簇(图10(b)、图11(a)、图11(b))
[0109]
ptx@050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp和ptx@8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp复合体通过以下的方法制备。向通过离心分离进行了清洗的050gs
‑
naoc(c8)
‑
nda
‑
sp或8arm
‑
nala(c12)
‑
nda
‑
sp的颗粒中加入包含10mg紫杉醇(ptx)(fujifilm wako pure chemical)的10ml的milli
‑
q水，照射10分钟脉冲超声波。直到使用前，对得到的混合物在4℃下进行了保存。abraxane从taiho pharmaceutical公司购入，未实施化学修饰等处理而直接用于实验。它们构成了纳米簇(图10(b)、图11(a)、图11(b))。
[0110]
3.nd
‑
sp的物性分析
[0111]
合成的nd
‑
sp的结构及形态使用高分辨率透射电子显微镜(tem)(加速电压：120kv)(em
‑
002b；topcon,tokyo,japan)进行了分析(图2(c)、图6(c)、图6(d)、图11(a))。
[0112]
nd
‑
sp的粒径(流体力学直径)通过动态光散射法(dls)(photal fpar
‑
1000；otsuka electronics,osaka,japan)求出(图2(b)、图6(b)、图10(b))。
[0113]
nd
‑
sp的分光学分析及nd
‑
sp复合体中的nd、cpt、ptx浓度通过紫外
‑
可见光
‑
近红外分光光度计(v
‑
730bio；jasco,tokyo,japan)进行了估算(图2(a)、图3(a)、图4(b)、图6(a)、图7(a)、图7(b)、图9(a)、图9(b)、图10(a)、图10(c)、图11(b))。
[0114]
4.细胞培养和细胞毒性评价
[0115]
人骨肉瘤细胞(u2os)、人卵巢腺瘤细胞(skov3)、人正常二倍体成纤维细胞(tig3)由日本研究生物资源收藏细胞库(the japanese collection of researchbioresources cell bank(tokyo,japan))获得，在包含10％胎牛血清、2mml
‑
谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠、庆大霉素、青霉素
‑
链霉素(100iu ml
‑1)、hank’s平衡盐溶液(life technologies,carlsbad,ca,usa)的杜氏改良eagle培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium,dmem)(gibco,grand island,ny,usa)中进行了培养。细胞在37℃、5％的co2气体氛围下的加湿室中进行了培养。
[0116]
细胞生存率使用结晶紫染(fujifilm wako pure chemical)和cell counting kit(cck)
‑
8(dojindo laboratories,kumamoto,japan)并按照它们的手册进行了评价。将细胞接种于96孔板(5
×
103细胞孔
‑1)，温育过夜。接着，使细胞暴露于药物或纳米复合体分散溶液中，用新鲜的培养液进行清洗后，在cck
‑
8溶液中温育。最后，通过用酶标仪(infinite m200 pro；tecan,mannedorf,switzerland)测定450nm的吸光度，计算出细胞生存比例(图4(a)、图4(c)、图4(d)、图7(d)、图12(a)、图12(b)、图12(c))。
[0117]
5.血液检查
[0118]
全血细胞计数(cbc)及生化参数由japan slc和oriental yeast co.(tokyo,japan)测定。具体而言，从尾静脉对10周龄的雌的balb/cslc小鼠(n＝5；平均体重＝21g；japan slc)给药200μl的各种样品[包含nd
‑
sp的无菌水(ndc
‑
sp：1.12mg kg
‑1；nda
‑
sp：30mg kg
‑1)、pbs缓冲液或无菌水]。在给药纳米复合体后4周后采集了血液样品(表1～4)。
[0119]
6.数据的统计分析
[0120]
数据中的
±
表示标准偏差，n表示使用的样品数。数据的统计分析使用了student氏t检验(student’s t
‑
test)。*、**、***分别表示<0.05、<0.005、<0.001的p值。
[0121]
[表1]
[0122]
注射pbs或dod(c12)
‑
ndc
‑
sp四周后的小鼠的血液检查结果
[0123][0124]
[表2]
[0125]
注射pbs或dod(c12)
‑
ndc
‑
sp四周后的小鼠的生化检查结果
[0126][0127]
缩写符号：wbc，白细胞；rbc，红细胞；hgb，血红蛋白；hct，血细胞比容；mcv，平均细胞体积；mch，平均细胞血红蛋白量；mchc，平均细胞血红蛋白浓度；plt，血小板；crp，c
‑
反应蛋白；tp，总蛋白；alb，白蛋白；bun，血尿素氮；cre，肌酐；ast，天冬氨酸氨基转移酶；alt，丙氨酸氨基转移酶；ldh，乳酸脱氢酶；amy，淀粉酶；ck，肌酸激酶。
[0128]
在对小鼠的尾静脉给药dod(c12)
‑
ndc
‑
sp分散液或pbs后，考察了4周后的全血细胞计数(cbc)及生化参数，结果是没有在样品之间观察到有意义的差异。该结果表明dod
(c12)
‑
ndc
‑
sp具有很高的生物体适应性。
[0129]
[表3]
[0130]
注射pbs或peg
‑
nda
‑
sp四周后的小鼠的血液检查结果
[0131][0132]
[表4]
[0133]
注射pbs或peg
‑
nda
‑
sp四周后的小鼠的生化检查结果
[0134][0135][0136]
缩写符号：wbc，白细胞；rbc，红细胞；hgb，血红蛋白；hct，血细胞比容；mcv，平均细
胞体积；mch，平均细胞血红蛋白量；mchc，平均细胞血红蛋白浓度；plt，血小板；crp，c
‑
反应蛋白；tp，总蛋白；alb，白蛋白；bun，血尿素氮；cre，肌酐；ast，天冬氨酸氨基转移酶；alt，丙氨酸氨基转移酶；ldh，乳酸脱氢酶；amy，淀粉酶；ck，肌酸激酶。
[0137]
在对小鼠的尾静脉给药分散有peg
‑
ndc
‑
sp的无菌水或仅给药无菌水之后，考察了4周后的全血细胞计数(cbc)及生化参数，结果是没有在样品之间观察到有意义的差异。该结果表明peg
‑
ndc
‑
sp具有很高的生物体适应性。

技术特征：

1.一种纳米簇，其是碳纳米材料自组装而成的纳米簇，所述碳纳米材料用高级烷基或高级烯基进行了修饰。2.根据权利要求1所述的纳米簇，其中，碳纳米材料进一步用聚亚烷基二醇进行了修饰。3.根据权利要求2所述的纳米簇，其用聚乙二醇进行了修饰。4.根据权利要求1～3中任一项所述的纳米簇，其中，高级烷基或高级烯基、聚亚烷基二醇通过选自
‑
nh
‑
、
‑
o
‑
、
‑
co
‑
o
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、
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o
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co
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、
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、
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、
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、
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、
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o
‑
co
‑
o
‑
、及
‑
nh
‑
co
‑
nh
‑
中的任意连接基团连接于碳纳米材料。5.根据权利要求1～4中任一项所述的纳米簇，其中，所述碳纳米材料具有选自oh、cooh及nh2中的至少1种表面基团，高级烷基或高级烯基经由所述表面基团键合于碳纳米材料。6.根据权利要求2所述的纳米簇，其中，所述碳纳米材料具有选自oh、cooh及nh2中的至少1种表面基团，聚亚烷基二醇经由所述表面基团键合于碳纳米材料。7.根据权利要求1～5中任一项所述的纳米簇，其与有效成分进行了复合。8.根据权利要求7所述的纳米簇，其中，有效成分为生理活性物质、标记物质、香料、精油、或有机素。9.根据权利要求1～8中任一项所述的纳米簇，其中，碳纳米材料为碳纳米金刚石或碳纳米点。10.一种有效成分的递送载体，其包含权利要求1～9中任一项所述的纳米簇。11.一种碳纳米材料，其用高级烷基和/或高级烯基进行了修饰、并且用聚亚烷基二醇进行了修饰。12.根据权利要求11所述的碳纳米材料，其中，高级烷基或高级烯基、以及聚亚烷基二醇是通过选自
‑
nh
‑
、
‑
o
‑
、
‑
co
‑
o
‑
、
‑
o
‑
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‑
、
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、
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‑
co
‑
o
‑
、及
‑
nh
‑
co
‑
nh
‑
中的连接基团连接的。13.根据权利要求11或12所述的碳纳米材料，其中，碳纳米材料为碳纳米金刚石。14.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的自组装而成的纳米簇，该纳米簇与药物进行了复合。