一种用于检测EGFR靶向药物适用性的试剂盒

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一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，属于生物医药技术领域。

背景技术：

2.肺腺癌作为最为常见、死亡率最高的肿瘤之一，发病率和死亡率均排名所有肿瘤前列。egfr(epidermal growth factor receptor)是肺腺癌中最常见和最重要的肿瘤驱动因素。目前临床上有着大量的靶向egfr的肺腺癌方案，包含奥希替尼、吉非替尼、阿法替尼等可以抑制egfr胞内区酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂；以及尼妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗等可以与egfr胞外区结合，阻断依赖于配体的egfr活化的单克隆抗体药物。但是，不同患者对egfr靶向药物敏感程度不同，中经常出现继发性的耐药现象，并非所有肺腺癌患者都可以从该种方式中获益。因此，在肺腺癌前和中准确判断患者对egfr靶向药物的敏感程度，对于提高患者的效果、减轻社会的负担具有极为重要的意义。

技术实现要素：

3.本发明的目的在于解决如何在肺腺癌前和中准确判断患者对egfr靶向药物的敏感程度的技术问题。
4.为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，包括检测znf263基因表达量的试剂，试剂通过检测znf263基因表达量的高低判断患者对egfr靶向药物的敏感性。
5.优选地，所述试剂用于检测患者肿瘤组织中znf263 mrna表达量。
6.优选地，所述试剂为qpcr试剂。
7.优选地，所述试剂通过检测患者肿瘤组织中znf263和actb的mrna表达量分别获得qpcr.ct.znf263和qpcr.ct.actb值；通过公式qpcr.ct＝qpcr.ct.znf263-qpcr.ct.actb计算差值；当差值大于等于12.0，则提示患者对egfr靶向药物敏感。
8.优选地，所述患者包括肺腺癌患者。
9.本发明提供一种用于检测egfr靶向药物适用性的方法，通过检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量判断患者对egfr靶向药物敏感性。
10.优选地，所述检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量为检测患者肿瘤组织中znf263 mrna表达量。
11.优选地，所述检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量通过qpcr的方法。
12.优选地，所述判断患者对egfr靶向药物敏感性是通过检测患者肿瘤组织中znf263和actb的mrna表达量，分别获得qpcr.ct.znf263和qpcr.ct.actb值；通过公式qpcr.ct＝qpcr.ct.znf263-qpcr.ct.actb计算差值；当差值大于等于12.0，则提示患者对egfr靶向药物敏感。
13.优选地，所述患者包括肺腺癌患者。
14.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
15.本发明提供了一种在肺腺癌患者中用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，通过检测肺腺癌患者肿瘤组织中znf263表达量的高低判断患者对egfr靶向药物敏感性；用于在前和中判断肺腺癌患者是否适合采用egfr靶向药物方案，从而实现精准医疗。本发明首次提出了通过检测znf263表达来判断患者是否对egfr靶向药物耐药，可以有效指导肺腺癌患者的个体化，提高临床获益，同时避免不必要的医疗资源的浪费。
16.本发明具有操作简单，经济实惠，准确性高、灵敏度和特异性好的优点。
附图说明
17.图1为pc-9和h1975细胞中过表达znf263之后egfr的mrna表达水平图；
18.图2为pc-9和h1975细胞中过表达znf263之后western blot实验检测egfr的蛋白表达水平图；
19.图3为pc-9细胞中过表达znf263之后，细胞在奥希替尼、吉非替尼和尼妥珠单抗三种药物处理后细胞存活率图。
20.图4为h1975细胞中过表达znf263之后，细胞在奥希替尼和尼妥珠单抗两种药物处理后细胞存活率图。
具体实施方式
21.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例作详细说明如下：
22.本发明所采取的技术方案是提供一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，包括检测znf263基因表达量的试剂，试剂通过检测znf263基因表达量的高低判断患者对egfr靶向药物的敏感性；所述试剂用于检测患者肿瘤组织中znf263 mrna表达量；所述试剂为qpcr试剂；所述试剂通过检测患者肿瘤组织中znf263和actb的mrna表达量分别获得qpcr.ct.znf263和qpcr.ct.actb值；通过公式qpcr.ct＝qpcr.ct.znf263-qpcr.ct.actb计算差值；当差值大于等于12.0，则提示患者对egfr靶向药物敏感；所述患者包括肺腺癌患者。
23.本发明提供一种用于检测egfr靶向药物适用性的方法，通过检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量判断患者对egfr靶向药物敏感性；所述检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量为检测患者肿瘤组织中znf263 mrna表达量；所述检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量通过qpcr的方法；所述判断患者对egfr靶向药物敏感性是通过检测患者肿瘤组织中znf263和actb的mrna表达量，分别获得qpcr.ct.znf263和qpcr.ct.actb值；通过公式qpcr.ct＝qpcr.ct.znf263-qpcr.ct.actb计算差值；当差值大于等于12.0，则提示患者对egfr靶向药物敏感；所述的患者包括肺腺癌患者。
24.实施例
25.1.本发明提供一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，其包括：znf263检测体系，用于检测肺腺癌患者肿瘤组织中znf263 mrna的表达量；记载用于确定znf263表达量高/低分界标准的数学模型的载体。当患者肺腺癌组织中znf263 mrna表达量低于标准
时，提示患者适合采用egfr靶向药物联合，即患者对egfr靶向药物敏感；反之，当肺腺癌患者肿瘤组织中znf263 mrna表达量高于标准时，提示患者不适合采用egfr靶向药物联合，即患者对egfr靶向药物不敏感。其中znf263的核苷酸序列编号为：nm_005741.5。
26.上述数学模型具体为：肺腺癌患者肿瘤组织中znf263 mrna表达量表示为qpcr.ct＝qpcr.ct.znf263-qpcr.ct.actb，即从肺腺癌患者肿瘤组织中提取的znf263进行定量pcr的ct值与内参的ct值之差，actb为内参基因；所述标准为：qpcr.ct取12.0为临界值，如果≥12.0，则认为znf263低表达，提示患者对egfr靶向药物敏感，不易出现耐药，适合采用egfr靶向药物联合；如果《12.0，则认为znf263高表达，提示患者对egfr靶向药物不敏感，易出现耐药，不适合采用egfr靶向药物联合。
27.上述egfr靶向药物包含奥希替尼、吉非替尼和尼妥珠单抗。上述内参可以是actb或者其它内参基因如gapdh、18srna等，更优选actb作为内参对照。当内参基因由actb换成其它的内参基因时，qpcr.ct临界值需要作出适当改变。
28.上述载体可以是纸质说明书；例如带有app下载窗口比如二维码的说明书，或者是计算机程序储存装置或系统比如u盘、网盘等。
29.在一种优选的实施方式中，上述试剂盒中还包括mrna提取分离体系，用于从肺腺癌患者肿瘤组织中提取分离mrna。例如，上述mrna提取分离体系可以是天根生化科技(北京)有限公司的trnzol universal总rna提取试剂(dp424)。同时，上述试剂盒中还包含mrna逆转录体系，用于将mrna逆转录成cdna。例如，上述mrna逆转录体系可以是翌圣生物科技(上海)股份有限公司的ⅱ1st strand cdna synthesis supermix for qpcr(gdna digester plus)试剂。同时，上述试剂盒中还包含qpcr试剂，用于进行qpcr实验检测znf263。例如，上述qpcr试剂可以是翌圣生物科技(上海)股份有限公司的qpcr sybr green master mix(low rox plus)。
30.上述znf263检测体系中znf263的qpcr扩增引物序列为：
31.正向引物：5
’–
cttgcgcttcagacggttc-3’；
32.反向引物：5
’‑
cccaagctctctctgcatatcc-3’。
33.上述作为内参的actb的qpcr引物序列为：
34.正向引物：5
’–
tgacgtggacatccgcaaag-3’；
35.反向引物：5
’–
ctggaaggtggacagcgagg-3’。
36.本发明的试剂盒可以检测患者样本中znf263的表达水平，判断肺腺癌患者是否对egfr靶向药物的敏感性，是否适合采用egfr靶向药物的方案，以免耽误患者的，实现精准医疗的目的。
37.znf263作为一种抑制性的转录因子，在肺腺癌发生发展中起着重要的作用。znf263一方面可以抑制肺腺癌中egfr表达，另一方面可以在细胞核内与egfr互作，从而阻断egfr与其它促瘤因子如stat3等的互作，从以上两个途径抑制肺腺癌细胞中egfr的作用。因此，znf263高表达的肺腺癌细胞中，egfr的作用显著降低，细胞对egfr的依赖性也显著下降，从而导致细胞对egfr药物的敏感性也显著下降。通过检测肺腺癌患者肿瘤组织中的znf263表达，可以有效地判断患者对egfr靶向药物的敏感程度，可以有效应用于肺腺癌患者个体化化疗方案的制定，实现针对患者的精准医疗。
38.实施例中所用的mrna提取分离体系是天根生化科技(北京)有限公司的trnzol universal总rna提取试剂(dp424)，mrna逆转录体系可以是翌圣生物科技(上海)股份有限公司的ⅱ1st strand cdna synthesis supermix for qpcr(gdna digester plus)试剂。qpcr试剂可以是翌圣生物科技(上海)股份有限公司的qpcr sybr green master mix(low rox plus)。按试剂盒说明书操作。引物由生工生物科技(上海)股份有限公司合成提供。
39.人肺腺癌细胞株pc-9和h1975由复旦大学附属中山医院提供，培养条件：在含10％fbs、1％双抗的dmem(高糖)培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)中，于37℃、5％co2培养箱(美国thermo fisher scientific公司)中培养。
40.2.肺腺癌细胞过表达znf263后对egfr靶向药物耐药性的改变：
41.采用慢病毒在pc-9和h1975肺腺癌细胞中过表达znf263后，分别用奥希替尼、吉非替尼和尼妥珠单抗等egfr靶向药物对过表达znf263的细胞和对照细胞进行处理。处理48h后采用阿尔玛蓝检测细胞活力。实验结果如图1-4所示。研究发现，与对照相比，过表达znf263的pc-9细胞对奥希替尼、吉非替尼和尼妥珠单抗的敏感性都显著下降。过表达znf263的h1975细胞对奥希替尼和尼妥珠单抗的敏感性同样显著下降。由此可推断，在znf263表达水平增高后，肺腺癌细胞对egfr靶向药物耐药能力增强，敏感程度减弱。
42.3.肺腺癌患者组织中znf263表达与吉非替尼效果
43.进一步收集了50例在术后接受吉非替尼的iiia期肺腺癌患者肿瘤组织，其中25例吉非替尼后存活大于5年，25例吉非替尼后存活小于3年(样本均来自复旦大学附属中山医院胸外科)。通过检测肿瘤样本中znf263的mrna表达水平，并与患者临床效果对比，来初步判断本试剂盒的检测效果。
44.定量pcr方法结果表明：存活大于5年的25位患者中有18位患者的qpcr.ct》12.0，表明znf263低表达。而存活小于3年的25位患者中仅有5位的qpcr.ct》12.0。因此综合判断本试剂盒灵敏度为72％，特异性为80％。
45.4.本发明使用过程：
46.用定量pcr检测肺腺癌患者组织中的znf263表达水平，与内参基因actb相比较。计算znf263进行定量pcr的ct值与内参的ct值之差；所述标准为：qpcr.ct取12.0为临界值，如果≥12.0，则znf263低表达，提示患者对egfr靶向药物敏感，不耐药，适合采用egfr靶向药物联合；如果《12.0，则znf263高表达，提示患者对egfr靶向药物不敏感，耐药，不适合采用egfr靶向药物联合。
47.如图1所示：pc-9和h1975细胞中，过表达znf263之后，实时定量pcr检测发现egfr的mrna表达水平显著降低。图中nc代表对照细胞，oe代表过表达znf263的细胞，fold change代表变化倍数，***代表p值显著(小于0.01)。
48.如图2所示：h1975和pc-9细胞中，过表达znf263之后，western blot实验检测发现egfr的蛋白表达水平显著降低。图中nc代表对照细胞，oe代表过表达znf263的细胞，tubulin为选取的内参蛋白。
49.如图3所示：在pc-9细胞中，过表达znf263之后，细胞在奥希替尼、吉非替尼和尼妥珠单抗三种药物处理后细胞存活率高，说明znf263高表达可以促进该种细胞对egfr靶向耐药。图中nc代表对照细胞，oe代表过表达znf263的细胞。
50.如图4所示：在h1975细胞中，过表达znf263之后，细胞在奥希替尼和尼妥珠单抗2种药物处理后细胞存活率高，说明znf263高表达可以促进该种细胞对egfr靶向耐药。由于h1975细胞对吉非替尼并不敏感，因此未检测其对吉非替尼的敏感性变化。图中nc代表对照细胞，oe代表过表达znf263的细胞。
51.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

技术特征：

1.一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，其特征在于，包括检测znf263基因表达量的试剂，试剂通过检测znf263基因表达量的高低判断患者对egfr靶向药物的敏感性。2.根据权利要求1所述的一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，其特征在于，所述试剂用于检测患者肿瘤组织中znf263 mrna表达量。3.根据权利要求2所述的一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，其特征在于，所述试剂为qpcr试剂。4.根据权利要求3所述的一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，其特征在于，所述试剂通过检测患者肿瘤组织中znf263和actb的mrna表达量分别获得qpcr.ct.znf263和qpcr.ct.actb值；通过公式qpcr.ct＝qpcr.ct.znf263-qpcr.ct.actb计算差值；当差值大于等于12.0，则提示患者对egfr靶向药物敏感。5.根据权利要求4所述的一种用于检测egfr靶向药物适用性的试剂盒，其特征在于，所述患者包括肺腺癌患者。6.一种用于检测egfr靶向药物适用性的方法，其特征在于，通过检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量判断患者对egfr靶向药物敏感性。7.根据权利要求6所述的一种用于检测egfr靶向药物适用性的方法，其特征在于，所述检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量为检测患者肿瘤组织中znf263 mrna表达量。8.根据权利要求6所述的一种用于检测egfr靶向药物适用性的方法，其特征在于，所述检测患者肿瘤组织中znf263基因的表达量通过qpcr的方法。9.根据权利要求6所述的一种用于检测egfr靶向药物适用性的方法，其特征在于，所述判断患者对egfr靶向药物敏感性是通过检测患者肿瘤组织中znf263和actb的mrna表达量，分别获得qpcr.ct.znf263和qpcr.ct.actb值；通过公式qpcr.ct＝qpcr.ct.znf263-qpcr.ct.actb计算差值；当差值大于等于12.0，则提示患者对egfr靶向药物敏感。10.根据权利要求6所述的一种用于检测egfr靶向药物适用性的方法，其特征在于，所述患者包括肺腺癌患者。

技术总结

本发明涉及一种用于检测EGFR靶向药物适用性的试剂盒，属于生物医药技术领域。本发明提供一种用于检测EGFR靶向药物适用性的试剂盒，其中包括检测ZNF263基因表达量的试剂，试剂通过检测ZNF263基因表达量的高低判断患者对EGFR靶向药物的敏感性。本发明可用于在前和中判断肺腺癌患者是否适合采用EGFR靶向药物方案，从而实现精准医疗，有效指导肺腺癌患者的个体化，提高临床获益，同时避免不必要的医疗资源的浪费。本发明具有操作简单，经济实惠，准确性高、灵敏度和特异性好的优点。和特异性好的优点。和特异性好的优点。