纳米零价铁促进假单
胞菌jd37降解
多氯联苯的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于环境生物技术领域，尤其涉及一种纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法及其应用。
背景技术：
2.多氯联苯(polychlorinated biphenyls，pcbs)是一类合成有机氯化合物，化学通式为c
12h10-n
cln。根据联苯环上的氯原子取代数量和位置，共有209种同系物。pcbs化学性质十分稳定，在环境中很难被降解，是典型的持久性有机污染物。由于pcbs对鱼类、哺乳动物和人类具有潜在危害，国际癌症研究机构将其列为第一类人类致癌物。2001年5月22日颁布的《斯德哥尔摩公约》将pcbs列为持久性有机污染物。
3.为了解决多氯联苯污染问题，相关学者已提出许多修复方案，包括物理修复、化学修复和生物修复。物理修复方法(包括安全填埋法和热脱附法等)和化学修复方法(包括氧化技术和还原技术等)工艺简单、可操作性强，但会产生二次污染，严重破坏生态系统功能，不利于后续的环境恢复。生物修复的目的是通过植物、动物和微生物的直接作用来清除环境污染物，属于更经济友好的技术。然而，由于生物降解或生物积累的生理限制，生物修复的修复效率低、修复周期长。总的来说，缩短污染环境修复周期的同时保护自然环境的生态功能显得十分重要。
4.植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，pgpr)是自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。假单胞菌(pseudomonas)是其中的典型代表，其生物防治机理是通过分泌抗病物质(吩嗪类、硝吡咯菌素、喹诺酮类等)代谢产生胞外活性氧(reactive oxygen species,ros)抑制植物病原菌，控制植物病虫害。微生物代谢产生胞外ros，可加速难降解有机物的生物降解。目前，该过程对修复有机污染环境的作用较少被研究或报道。而且，铁是生物体必需的营养元素，参与植物及微生物的呼吸作用、光合作用、抗氧化应激、激素和代谢调节等生物化学活动。纳米零价铁(nanoscale zero-valent iron，nzvi)是环境修复中备受关注的纳米材料。相较于其他零价金属如锰(mn)、铜(cu)等，nzvi大规模生产成本较低且具有环境友好性。nzvi是由fe(0)内核和氧化壳层组成的核壳结构，该结构为污染物的初始吸附和随后在颗粒表面的还原和/或氧化过程提供了独特的反应界面。而且，纳米尺寸的铁氧化物具有强吸附能力和催化活性，可直接去除环境中的污染物。因此，有必要了解铁基纳米材料与根际功能菌对pcb28降解过程的影响。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法及其应用。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本发明提供了一种纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法，包括以下步骤：包括以下步骤：在存在多氯
联苯的环境中加入纳米零价铁和假单胞菌jd37，通过纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯；
7.
所述环境包括水体和土壤。
8.进一步地，所述纳米零价铁的尺寸为20～100nm。
9.进一步地，所述假单胞菌jd37是处于对数增长期中后期的假单胞菌jd37，其通过如下步骤制备得到：将假单胞菌jd37菌种接种至经除菌后的液体
培养基中，振荡培养至菌体处于对数增长期中后期。
10.进一步地，所述液体培养基的组成如下：5～10g/l胰蛋白胨，2～5g/l酵母提取物，5～10g/l氯化钠，溶剂为水，ph为6.5～7.5；
11.所述的振荡培养的条件为：于28～30℃、150～200rpm的转速培养12～18h。
12.进一步地，所述纳米零价铁的用量为：当所述的环境为水体时，按10～100mg/l的量添加纳米零价铁；
13.所述假单胞菌jd37的od
600
值为：当所述的环境为水体时，假单胞菌jd37的od
600
值为0.1～0.3；
14.所述的存在多氯联苯的环境中多氯联苯的含量为0.01～1.0mg/l。
15.进一步地，所述纳米零价铁的用量为：当所述的环境为土壤时，按10～1000mg/l的量添加纳米零价铁。
16.第二方面，本发明提供了纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法在环境修复中的应用。
17.本发明相对于现有技术，具有如下优点和有益效果：
18.本发明的研究成果表明，纳米零价铁在低剂量水平，对假单胞菌jd37既没有增殖也没有毒性作用，且纳米零价铁提高了假单胞菌jd37的胞外活性氧产量，明显缩短假单胞菌jd37降解多氯联苯的降解半衰期；对多氯联苯的进行快速降解。
附图说明
19.图1为不同尺寸的零价铁对假单胞菌jd37胞外羟基自由基的产生影响图；
20.图2为不同尺寸的零价铁对假单胞菌jd37胞外超氧自由基的产生影响图。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加明白清楚，结合附图和实施例，对本发明进一步的详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均在本发明保护范围。
22.下面未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照厂家所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
23.实施例1(nzvi
100
组)
24.(1)假单胞菌jd37的摇瓶培养
25.称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，加入1000ml水，混匀，调节ph为7.0，放入2000ml三角锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温，得到液体培养基；
用接种环将假单胞菌jd37(pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca jd37，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.1.10967)斜面菌种接入到液体培养基中，接种量为2环；将三角锥形瓶放入振荡培养箱，于30℃、180rpm的条件下培养18h，得到摇瓶培养液；随后对摇瓶培养液在4000rpm、4℃离心10min，得到假单胞菌jd37菌体。
26.(2)假单胞菌jd37对多氯联苯的降解
27.本实施例中所用的多氯联苯为2,4,4
’‑
三氯联苯(pcb28)。
28.取1.0mg pcb28溶于10ml的丙酮溶液中，作为实验所用的多氯联苯储备液，所述丙酮为谱纯级。向200ml三角锥形瓶中加入100μl所述储备液，待丙酮挥发后加入10mg尺寸为100nm的纳米零价铁(nzvi
100
)，随后加入100ml灭菌冷却后的基础盐培养基中，再加入0.4g葡萄糖，所述葡萄糖作为假单胞菌jd37的生长碳源，得到含pcb28的培养基；取步骤(1)制备的假单胞菌jd37菌体接入到装有含pcb28的培养基的三角锥形瓶中，调节od
600
＝0.1，将三角锥形瓶放入振荡培养箱中，于30℃、180rpm的条件下振荡培养，分别在1、4、8、18、24、48、72h提取培养液，对培养液进行pcb28浓度测定，计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为8.1h。
29.所述基础盐培养基的组成为：2.8g/l磷酸氢二钠，1.0g/l磷酸二氢钾，0.5g/l硫酸铵，0.1g/l六水氯化镁，0.05g/l四水钙盐，0.5mg/l edta二钠，0.01mg/l七水硫酸锌，0.003mg/l四水氯化锰，0.03mg/l硼酸，0.02mg/l六水氯化钴，0.001mg/l二水氯化铜，0.002mg/l六水氯化镍，0.003mg/l二水钼酸钠。
30.实施例2(nzvi
20
组)
31.(1)假单胞菌jd37的摇瓶培养
32.称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，加入1000ml水，混匀，调节ph为7.0，放入2000ml三角锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温，得到液体培养基；用接种环将假单胞菌jd37(pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca jd37，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.1.10967)斜面菌种接入到液体培养基中，接种量为2环；将三角锥形瓶放入振荡培养箱，于30℃、180rpm的条件下培养18h，得到摇瓶培养液；随后对摇瓶培养液在4000rpm、4℃离心10min，得到假单胞菌jd37菌体。
33.(2)假单胞菌jd37对多氯联苯的降解
34.本实施例中所用的多氯联苯为2,4,4
’‑
三氯联苯(pcb28)。
35.取1.0mg pcb28溶于10ml的丙酮溶液中，作为实验所用的多氯联苯储备液，所述丙酮为谱纯级。向200ml三角锥形瓶中加入100μl所述储备液，待丙酮挥发后加入10mg尺寸为20nm的纳米零价铁(nzvi
20
)，随后加入100ml灭菌冷却后的基础盐培养基中，再加入0.4g葡萄糖，所述葡萄糖作为假单胞菌jd37的生长碳源，得到含pcb28的培养基；取步骤(1)制备的假单胞菌jd37菌体接入到装有含pcb28的培养基的三角锥形瓶中，调节od
600
＝0.1，将三角锥形瓶放入振荡培养箱中，于30℃、180rpm的条件下振荡培养，分别在1、4、8、18、24、48、72h提取培养液，对培养液进行pcb28浓度测定，计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为13.2h。
36.所述基础盐培养基的组成为：2.8g/l磷酸氢二钠，1.0g/l磷酸二氢钾，0.5g/l硫酸铵，0.1g/l六水氯化镁，0.05g/l四水钙盐，0.5mg/l edta二钠，0.01mg/l七水硫酸锌，0.003mg/l四水氯化锰，0.03mg/l硼酸，0.02mg/l六水氯化钴，0.001mg/l二水氯化铜，
0.002mg/l六水氯化镍，0.003mg/l二水钼酸钠。
37.空白组(ck组)
38.(1)假单胞菌jd37的摇瓶培养
39.称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，加入1000ml水，混匀，调节ph为7.0，放入2000ml三角锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温，得到液体培养基；用接种环将假单胞菌jd37(pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca jd37，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.1.10967)斜面菌种接入到液体培养基中，接种量为2环；将三角锥形瓶放入振荡培养箱，于30℃、180rpm的条件下培养18h，得到摇瓶培养液；随后对摇瓶培养液在4000rpm、4℃离心10min，得到假单胞菌jd37菌体。
40.(2)假单胞菌jd37对多氯联苯的降解
41.本实施例中所用的多氯联苯为2,4,4
’‑
三氯联苯(pcb28)。
42.取1.0mg pcb28溶于10ml的丙酮溶液中，作为实验所用的多氯联苯储备液，所述丙酮为谱纯级。向200ml三角锥形瓶中加入100μl所述储备液，待丙酮挥发后加入100ml灭菌冷却后的基础盐培养基中，再加入0.4g葡萄糖，所述葡萄糖作为假单胞菌jd37的生长碳源，得到含pcb28的培养基；取步骤(1)制备的假单胞菌jd37菌体接入到装有含pcb28的培养基的三角锥形瓶中，调节od
600
＝0.1，将三角锥形瓶放入振荡培养箱中，于30℃、180rpm的条件下振荡培养，分别在1、4、8、18、24、48、72h提取培养液，对培养液进行pcb28浓度测定，计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为16.5h。
43.所述基础盐培养基的组成为：2.8g/l磷酸氢二钠，1.0g/l磷酸二氢钾，0.5g/l硫酸铵，0.1g/l六水氯化镁，0.05g/l四水钙盐，0.5mg/l edta二钠，0.01mg/l七水硫酸锌，0.003mg/l四水氯化锰，0.03mg/l硼酸，0.02mg/l六水氯化钴，0.001mg/l二水氯化铜，0.002mg/l六水氯化镍，0.003mg/l二水钼酸钠。
44.对比例1(mzvi组)
45.(1)假单胞菌jd37的摇瓶培养
46.称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，加入1000ml水，混匀，调节ph为7.0，放入2000ml三角锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温，得到液体培养基；用接种环将假单胞菌jd37(pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca jd37，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.1.10967)斜面菌种接入到液体培养基中，接种量为2环；将三角锥形瓶放入振荡培养箱，于30℃、180rpm的条件下培养18h，得到摇瓶培养液；随后对摇瓶培养液在4000rpm、4℃离心10min，得到假单胞菌jd37菌体。
47.(2)假单胞菌jd37对多氯联苯的降解
48.本实施例中所用的多氯联苯为2,4,4
’‑
三氯联苯(pcb28)。
49.取1.0mg pcb28溶于10ml的丙酮溶液中，作为实验所用的多氯联苯储备液，所述丙酮为谱纯级。向200ml三角锥形瓶中加入100μl所述储备液，待丙酮挥发后加入10mg尺寸为5μm的零价铁(mzvi)，随后加入100ml灭菌冷却后的基础盐培养基中，再加入0.4g葡萄糖，所述葡萄糖作为假单胞菌jd37的生长碳源，得到含pcb28的培养基；取步骤(1)制备的假单胞菌jd37菌体接入到装有含pcb28的培养基的三角锥形瓶中，调节od
600
＝0.1，将三角锥形瓶放入振荡培养箱中，于30℃、180rpm的条件下振荡培养，分别在1、4、8、18、24、48、72h提取培养液，对培养液进行pcb28浓度测定，计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为
16.1h。
50.所述基础盐培养基的组成为：2.8g/l磷酸氢二钠，1.0g/l磷酸二氢钾，0.5g/l硫酸铵，0.1g/l六水氯化镁，0.05g/l四水钙盐，0.5mg/l edta二钠，0.01mg/l七水硫酸锌，0.003mg/l四水氯化锰，0.03mg/l硼酸，0.02mg/l六水氯化钴，0.001mg/l二水氯化铜，0.002mg/l六水氯化镍，0.003mg/l二水钼酸钠。
51.对比例2(α-fe2o3组)
52.与对比例1相比，区别仅在采用尺寸为20nm的赤铁矿(α-fe2o3)取代尺寸为5μm的零价铁(mzvi)，最后计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为14.8h。
53.对比例3(γ-fe2o3组)
54.与对比例1相比，区别仅在采用尺寸为20nm的磁赤铁矿(γ-fe2o3)取代尺寸为5μm的零价铁(mzvi)，最后计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为19.1h。
55.对比例4(fe3o4组)
56.与对比例1相比，区别仅在采用尺寸为20nm的磁铁矿(fe3o4)取代尺寸为5μm的零价铁(mzvi)，最后计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为16.9h。
57.对比例5(feso4组)
58.与对比例1相比，区别仅在采用feso4取代尺寸为5μm的零价铁(mzvi)，最后计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为15.2h。
59.对比例6(fe2(so4)3组)
60.与对比例1相比，区别仅在采用fe2(so4)3取代尺寸为5μm的零价铁(mzvi)，最后计算得出假单胞菌jd37对pcb28的降解半衰期为18.3h。
61.分别测量实施例1、实施例2和空白组假单胞菌jd37降解多氯联苯过程中羟基自由基含量，测量结果如图1所示。测量实施例1、实施例2和空白组假单胞菌jd37降解多氯联苯过程中的超氧自由基吸收光谱图，如图2所示。从图1和图2中可以看出，纳米零价铁可以促进假单胞菌jd37胞外羟基自由基的产生，尤其是尺寸为100nm的纳米零价铁明显促进假单胞菌jd37胞外羟基自由基的产生；纳米零价铁也可以促进假单胞菌jd37胞外超氧自由基的产生，尤其是尺寸为100nm的纳米零价铁明显促进假单胞菌jd37胞外超氧自由基的产生。因此实施例1中假单胞菌jd37的降解半衰期最短，并且明显短于空白组的降解半衰期。综上所述，添加纳米零价铁可以促进假单胞菌jd37降解多氯联苯。
62.通过对比例1至对比例6对pcb28的降解半衰期，可以看出其他含铁材料无法促进假单胞菌jd37降解多氯联苯。
63.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
技术特征：
1.一种纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法，其特征在于，包括以下步骤：在存在多氯联苯的环境中加入纳米零价铁和假单胞菌jd37，通过纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯；所述环境包括水体和土壤。2.根据权利要求1所述的纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法，其特征在于，所述纳米零价铁的尺寸为20～100nm。3.根据权利要求1所述的纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法，其特征在于，所述假单胞菌jd37是处于对数增长期中后期的假单胞菌jd37，其通过如下步骤制备得到：将假单胞菌jd37菌种接种至经除菌后的液体培养基中，振荡培养至菌体处于对数增长期中后期。4.根据权利要求3所述的纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法，其特征在于，所述液体培养基的组成如下：5～10g/l胰蛋白胨，2～5g/l酵母提取物，5～10g/l氯化钠，溶剂为水，ph为6.5～7.5；所述的振荡培养的条件为：于28～30℃、150～200rpm的转速培养12～18h。5.根据权利要求1所述的纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法，其特征在于，所述纳米零价铁的用量为：当所述的环境为水体时，按10～100mg/l的量添加纳米零价铁；所述假单胞菌jd37的od
600
值为：当所述的环境为水体时，假单胞菌jd37的od
600
值为0.1～0.3；所述的存在多氯联苯的环境中多氯联苯的含量为0.01～1.0mg/l。6.根据权利要求1所述的纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法，其特征在于，所述纳米零价铁的用量为：当所述的环境为土壤时，按10～1000mg/l的量添加纳米零价铁。7.权利要求1-6任一项所述纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法在环境修复中的应用。
技术总结
本发明公开了一种纳米零价铁促进假单胞菌JD37降解多氯联苯的方法及其应用。本发明是在存在多氯联苯的环境中加入纳米零价铁和假单胞菌JD37，通过纳米零价铁促进假单胞菌JD37降解多氯联苯。通过纳米零价铁提高假单胞菌JD37胞外代谢产生的活性氧含量，促进多氯联苯降解。因此，本发明适合在水体和土壤中降解多氯联苯，进行环境修复。进行环境修复。
技术研发人员：
林道辉 吴婷 郑天颖 戴筠卜
受保护的技术使用者：
浙江大学
技术研发日：
2022.05.24
技术公布日：
2022/8/12
