用于由重组微生物生产有机产物的生物制造系统和方法与流程

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1.本发明涉及用于生产有机产物的生物制造系统。本发明涉及具有改进的有机底物生产能力的重组微生物，并且涉及具有改进的有机产物生产能力的重组微生物。本文公开的系统和重组微生物的益处可包括能够单独且安全地生产有机产物、以及在其生产期间产生培养杂质的有机底物。本发明涉及使用本文公开的生物制造系统和重组微生物来生产有机产物的方法。本文公开的方法的益处可包括增加来自微生物培养物的一种或多种有机产物的生产。本文方法的益处可以是能够生产含有减少量的副产物或培养杂质的有机产物。附加的益处可以是使用二氧化碳来生产生物乙烯，所述生物乙烯可用作生产塑料、纺织品和化学材料的原料，并且用于其它应用中。另一个益处是使用二氧化碳生产烯烃、烷烃、多烯和醇。所述方法的另一个益处包括避免共同产生氧气和挥发性有机化合物。
2.本文公开的方法和系统的另一个益处可包括减少来自环境的过量二氧化碳。

背景技术：

3.世界范围内对电力需求的增加已经导致来自燃烧化石燃料(诸如石油和天然气)的过量二氧化碳，这实质上促成了许多称为全球变暖危机的事件。工业上对于防止二氧化碳进入大气相当无能为力，以致它们已采取将二氧化碳从废气流和大气中隔离开来。然后它们将二氧化碳储存在地下环境中。然而，所有目前已知的方法只是通过将二氧化碳储存在地下而从大气中除去二氧化碳。它们实际上并未将二氧化碳转化回任何其它有用的材料。
4.石油的有限供应及其对环境的有害影响促使燃料和化学品的可再生来源的发展。将生物质和捕集的二氧化碳转化成新产物(诸如生物燃料)的技术可有助于减少石油进口和二氧化碳排放。人们日益关注使用生物过程由有机废物生产增值燃料和其它有用的有机产物。在这些有机产物中，乙烯是世界上最广泛生产的有机化合物，可用于广泛的工业，包括塑料、溶剂和纺织品。目前通过蒸汽裂化化石燃料或使乙烷脱氢来生产乙烯。然而，在每年生产数百万公吨乙烯的情况下，此类过程生产了过多的二氧化碳以致极大地助长了全球碳足迹。因此，通过可再生方法生产乙烯将有助于满足来自能源和化学工业的巨大需求，同时还有助于保护环境。
5.由于乙烯是潜在可再生的原料，因此人们大为关注开发由可再生来源(诸如二氧化碳和生物质)生产乙烯的技术。目前使用来源于玉米或甘蔗的乙醇来生产生物乙烯。多种微生物(包括细菌和真菌)天然产生少量乙烯。已经在几种微生物物种中证明了产乙烯酶的异源表达，其中宿主已经能够利用多种碳源，包括木质纤维素和二氧化碳。
6.基于现代历史，可以说，大气中的过量二氧化碳以及其它有机废物将不会被减少，直到减少它们变得有利。仍然需要改进微生物的生物制造系统和过程，以便以商业规模生产有用的有机产物，诸如乙烯。仍然需要通过更有效的可再生技术来生产烃。仍然需要从大气中除去过量的二氧化碳。仍然需要用于工业和商业应用的由可再生原料来安全生产乙烯的改进方法。

技术实现要素：

7.本文的实施方案涉及用于生产有机产物的生物制造系统。在各种实施方案中，所述系统包括至少一个生物反应器培养容器。在各种实施方案中，至少一个生物反应器培养容器含有有机底物培养液，其中有机底物培养液含有第一重组微生物。在各种实施方案中，第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，能够利用碳源生产有机底物，并生产至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体中的至少一种。在各种实施方案中，至少一个生物反应器培养容器含有有机产物培养液，其中有机产物培养液含有第二重组微生物。在各种实施方案中，第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，并且能够利用有机底物来生产至少一种有机产物。
8.在某些实施方案中，至少一个生物反应器培养容器包括：第一生物反应器培养容器，所述第一生物反应器培养容器包括碳源入口、挥发性气体出口和动力源；以及第二生物反应器培养容器，所述第二生物反应器培养容器包括流体流动路径和有机产物出口，所述流体流动路径连接至第一生物反应器培养容器和第二生物反应器培养容器并位于二者之间。在此类实施方案中，第一生物反应器培养容器包括有机底物培养液，第二生物反应器培养容器包括有机产物培养液。在某些实施方案中，第一生物反应器培养容器或第二生物反应器培养容器还包括生物质收集端口。在某些实施方案中，动力源包括太阳光、太阳能动力源、电动力源或其组合。在某些实施方案中，系统还包括碳酸化单元、胺汽提塔、胺洗涤器、催化转化器、冷凝器、压缩机、苛性碱塔、干燥器或其组合。在某些实施方案中，第二生物反应器培养容器还包括碳源入口、挥发性气体出口、动力源或其组合。
9.在某些实施方案中，碳源包括二氧化碳、一氧化碳、正烷烃、乙醇、植物油、甘油、葡萄糖、蔗糖、单糖、二糖、多糖或其组合。在某些实施方案中，挥发性气体包括氧气、甲烷或其组合。在某些实施方案中，至少一种有机底物包括α-酮戊二酸、蔗糖、葡萄糖、甘油、单糖、二糖、多糖或其组合。在某些实施方案中，至少一种有机产物包括乙烯、醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、有机酸、丙酸、乙酸、醛、甲醛、长链脂肪酸、正烷烃、烃或其组合。
10.在某些实施方案中，碳源包括二氧化碳、一氧化碳、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、单糖、二糖、多糖、糖原、乙酸、脂肪酸或其组合。在某些实施方案中，动力源包括太阳光、太阳能动力源、电动力源或其组合。在某些实施方案中，挥发性气体包括氧气、甲烷或其组合。在某些实施方案中，至少一种有机底物包括α-酮戊二酸、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘油、单糖、二糖、多糖、糖原、脂肪酸或其组合。在某些实施方案中，至少一种有机产物包括醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、有机酸、丙酸、乙酸、醛、甲醛、长链脂肪酸、正烷烃、烃、乙烷、丙烯、丁烯、乙烷、丙烷、丁烷或其组合。在某些实施方案中，第二生物反应器培养容器还包括碳源入口、挥发性气体出口、动力源或其组合。
11.在某些实施方案中，在一个生物反应器培养容器中组合有机底物培养液和有机产物培养液。在其它实施方案中，通过过滤器分离有机底物培养液和有机产物培养物。在某些实施方案中，过滤器包括约0.2μm至约10μm或更大的孔径。
12.在本文的系统的某些实施方案中，至少一种有机底物包括α-酮戊二酸(akg)，其中第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量大于缺乏非天然akg形成酶表达核苷酸序
列的对照微生物生产的akg形成酶的量。在此类实施方案中，至少一种有机产物包括乙烯，其中第二重组微生物生产的至少一种乙烯形成酶(efe)的量大于缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe的量。在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达至少一种非天然akgp形成核酸序列来表达至少一种α-酮戊二酸通透酶蛋白(akgp)。
13.在某些实施方案中，至少一种akg形成酶包括异柠檬酸脱氢酶(icd)蛋白、谷氨酸脱氢酶(gdh)蛋白或其组合。在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：2或seq id no：4至少95％同一性的核苷酸序列的非天然icd蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：1或seq id no：3至少95％同一性的氨基酸序列的icd蛋白，或者第一重组微生物通过表达具有与seq id no：6至少95％同一性的核苷酸序列的非天然gdh蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：5至少95％同一性的氨基酸序列的gdh蛋白，或其组合。在某些实施方案中，第二重组微生物通过表达具有与seq id no：8至少95％同一性的核苷酸序列的非天然efe蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：7至少95％同一性的氨基酸序列的efe蛋白。
14.在某些实施方案中，第一重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：光合细菌、蓝细菌(cyanobacteria)、聚球藻属(synechococcus)、细长聚球藻(synechococcus elongatus)、synechococcus leopoliensis、集胞藻属(synechocystis)、鱼腥藻属(anabaena)、假单胞菌属(pseudomonas)、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)、萨瓦氏假单胞菌(pseudomonas savastanoi)、衣藻属(chlamydomonas)和莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)。在某些实施方案中、第二重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：埃希氏菌属(escherichia)、大肠杆菌(escherichia coli)、土细菌(geobacteria)、石蜡节杆菌(arthrobacter paraffineus)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、假单胞菌属(pseudomonas)、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)、萨瓦氏假单胞菌(pseudomonas savastanoi)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、bacillus metatherium、沼泽假丝酵母(candida paludigena)、pichia inositovora、光滑球拟酵母(torulopsis glabrata)、解脂假丝酵母(candida lipolytica)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、酿酒酵母(saccharomyces cereviciae)、曲霉菌属(aspergillus sp.)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和乳杆菌属(lactobacillus sp.)。
15.在某些实施方案中，第一重组微生物包括缺乏葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶蛋白表达的δ-glgc突变微生物。在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：10至少95％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖合酶蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：9至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖合酶蛋白。在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：12至少95％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖磷酸合酶核苷酸序列来表达具有与seq id no：11至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖磷酸合酶蛋白。
16.在某些实施方案中，第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量比缺乏非天然akg形成酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的akg形成酶的量高约5％至约200％或更多。在某些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量比缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe蛋白的量高约5％至约200％或更多。在某些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量为每升有机产物培养液约20克至约100克或更多。
17.在某些实施方案中，第二重组微生物包括大肠杆菌。第二重组微生物生产的efe蛋白的量为第二重组微生物的总细胞蛋白量的约30％至约80％或更多。在某些实施方案中，第二重组微生物生产的乙烯的生产率为约1亿磅/年至约10亿磅/年或更高。在某些实施方案中，第二重组微生物的细胞浓度为每毫升约107至约10
13
个细胞，或每升有机产物培养液的细胞干重为每升约100克至约300克细胞干重。
18.在某些实施方案中，将非天然akg形成酶表达核苷酸序列或非天然efe表达核苷酸序列插入到微生物表达载体中，其中微生物表达载体包括细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、抗生素抗性系统、用于蛋白纯化和检测的辅助系统、crispr cas系统、噬菌体展示系统或其组合。在某些实施方案中，efe表达核苷酸序列在微生物表达载体中具有约2至约500或更多的拷贝数。在某些实施方案中，微生物表达载体包括至少一种微生物表达启动子。在某些实施方案中，至少一种微生物表达启动子包括光敏启动子、化学敏感启动子、温度敏感启动子、lac启动子、t7启动子、cspa启动子、λpl启动子、λcl启动子、连续诱导启动子、psba启动子或其组合。
19.本文的实施方案涉及生产有机产物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括提供一种生物制造系统，所述生物制造系统包括：至少一个生物反应器培养容器；其中至少一个生物反应器培养容器含有有机底物培养液；其中有机底物培养液含有第一重组微生物；其中第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，能够利用碳源生产有机底物，并且产生至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体中的至少一种；其中至少一个生物反应器培养容器含有有机产物培养液；其中有机产物培养液含有第二重组微生物；其中第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，并且能够利用有机底物来生产至少一种有机产物；其中至少一个生物反应器培养容器包括：第一生物反应器培养容器，所述第一生物反应器培养容器包括碳源入口、挥发性气体出口和动力源；并且所述系统包括第二生物反应器培养容器，所述第二生物反应器培养容器包括流体流动路径和有机产物出口，所述流体流动路径连接至第一生物反应器培养容器和第二生物反应器培养容器并位于二者之间；其中第一生物反应器培养容器包括有机底物培养液，并且第二生物反应器培养容器包括有机产物培养液。在此类实施方案中，所述方法包括：在足以在第一生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机底物的条件下，在第一生物反应器培养容器中培养第一重组微生物；以及在足以在第二生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机产物的条件下，在第二生物反应器培养容器中培养第二重组微生物。
20.在某些实施方案中，所述方法还包括通过挥发性气体出口从有机底物培养液中除去一定量的至少一种挥发性气体。在某些实施方案中，所述方法还包括通过有机产物出口从有机产物培养液中除去一定量的至少一种有机产物。在某些实施方案中，如果碳源包括二氧化碳，则所述方法还包括通过碳源入口将一定量的二氧化碳从二氧化碳源进料至有机底物培养液中。在某些实施方案中，所述方法还包括将有机底物培养液和有机产物培养液的ph水平维持在约5.0至约8.5。在某些实施方案中，所述方法包括将有机底物培养液和有机产物培养液的温度维持在约25摄氏度至约70摄氏度或更高。
21.在某些实施方案中，所述方法还包括：基于第二生物反应器培养容器的总内部体
积，将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量维持在约10体积％至约1体积％或更少。
22.在某些实施方案中，如果第一生物反应器培养容器或第二生物反应器培养容器还包括生物质收集端口，则所述方法还包括通过生物质收集端口收集由第一重组微生物或第二重组微生物生产的一定量的生物质。
23.在本文方法的某些实施方案中，将非天然有机底物形成重组酶表达核苷酸序列或非天然有机产物表达核苷酸序列插入到微生物表达载体中，其中至少一种微生物表达载体包括至少一种微生物表达启动子。在某些实施方案中，所述方法还包括通过向有机底物培养液或有机产物培养液中加入至少一种启动子诱导物，来控制至少一种有机底物的量或至少一种有机产物的量。在某些实施方案中，至少一种微生物表达启动子包括光敏启动子、化学敏感启动子、温度敏感启动子、lac启动子、t7启动子、cspa启动子、λpl启动子、λcl启动子、连续生产启动子、psba启动子或其组合；至少一种启动子诱导物包括乳糖、木糖、iptg、冷激、热激或其组合。
24.至少一种有机产物包括乙烯。在某些实施方案中，如果至少一种有机底物培养杂质包括至少一种挥发性气体，则所述方法还包括通过挥发性气体出口除去至少一种挥发性气体。在某些实施方案中，所述方法包括回收以约1亿磅/年至约10亿磅/年或更高的速率生产的乙烯的量。在某些实施方案中，生产的乙烯的量含有约1摩尔％或更少的挥发性气体的量。
25.本文的实施方案涉及生产有机产物的方法，其中所述方法包括提供生物制造系统，所述生物制造系统包括：至少一个生物反应器培养容器；其中至少一个生物反应器培养容器含有有机底物培养液；其中有机底物培养液含有第一重组微生物；其中第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，能够利用碳源生产有机底物，并且生产至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体中的至少一种；并且其中至少一个生物反应器培养容器含有有机产物培养液；其中有机产物培养液含有第二重组微生物；其中第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列表达至少一种有机产物形成酶，并且能够利用有机底物生产至少一种有机产物；在此类实施方案中，在一个生物反应器培养容器中组合有机底物培养液和有机产物培养液，其中将非天然有机底物形成重组酶表达核苷酸序列插入到第一微生物表达载体中，其中将非天然有机产物形成酶表达核苷酸序列插入到第二微生物表达载体中，并且其中第一微生物表达载体和第二微生物表达载体各自包括至少一个微生物表达启动子。在此类实施方案中，所述方法包括提供连接至碳源入口的碳源；在足以在第一生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机底物的条件下，在第一生物反应器培养容器中培养第一重组微生物；通过在第一时间点向有机底物培养液中添加至少一种启动子诱导物，来生产一定量的至少一种有机底物；在足以在第二生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机产物的条件下，在第二生物反应器培养容器中培养第二重组微生物；以及通过在第二时间点向有机产物培养液中添加至少一种启动子诱导物，来生产一定量的至少一种有机产物。在某些实施方案中，所述方法包括在第二时间点之前，基于第二生物反应器培养容器的总内部体积，将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量降低至约10体积％至约1体积％或更少。
26.本文的实施方案涉及生产乙烯的方法。在某些实施方案中，所述方法包括提供一种生物制造系统，所述生物制造系统包括：第一生物反应器培养容器，所述第一生物反应器培养容器包括碳源入口、挥发性气体出口和动力源；以及第二生物反应器培养容器，所述第二生物反应器培养容器包括流体流动路径和有机产物出口，所述流体流动路径连接至第一生物反应器培养容器和第二生物反应器培养容器并位于二者之间；其中第一生物反应器培养容器包括有机底物培养液，第二生物反应器培养容器包括有机产物培养液；其中有机底物培养液含有第一重组微生物，所述第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，其中有机底物包括akg，其中第一重组微生物通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，其中有机底物形成酶包括akg形成酶，其中第一重组微生物能够利用碳源生产一定量的akg，其中第一重组微生物生产至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体中的至少一种；其中挥发性气体包括氧气，其中有机产物培养液含有第二重组微生物，所述第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，其中有机产物包括乙烯，其中第二重组微生物通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，其中有机产物形成酶包括efe，并且其中第二重组微生物能够利用akg来生产一定量的乙烯。在某些实施方案中，所述方法包括：在足以在第一生物反应器培养容器中产生一定量的akg的条件下，在第一生物反应器培养容器中培养第一重组微生物；在足以在第二生物反应器培养容器中产生一定量的efe的条件下，在第二生物反应器培养容器中培养第二重组微生物；通过挥发性气体出口从有机底物培养液中除去一定量的氧气；以及通过有机产物出口从有机产物培养液中除去一定量的efe。
附图说明
27.当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及以下实施方案的详细描述。为了说明的目的，在附图中示出了一些优选的实施方案。应当理解，所描述的实施方案不限于所示的精确细节。除非另有说明，附图并非按比例绘制。
28.图1是描绘根据本文的实施方案通过微生物生产有机底物和有机产物的图示。
29.图2是根据本文的实施方案的生物制造系统的图示。
30.图3a是显示根据本文的实施方案在表达低、中等或高拷贝数的efe基因并在不同生长培养基中培养的大肠杆菌培养物中生产乙烯的图。
31.图3b是显示根据本文的实施方案在没有补充物或具有不同生长补充物的情况下生长的大肠杆菌培养物中生产乙烯的图。
32.图4是描述本文生产有机产物的方法的实施方案的流程图。
具体实施方式
33.除非另有说明，所有测定值均以标准公制单位表示。
34.除非另有说明，词语“一”、“一个”或“该”的所有实例可以指它们所修饰的词语中的一个或多于一个。
35.除非另有说明，短语“至少一个”是指一个或多于一个对象。例如，“至少一个生物反应器培养容器”是指一个生物反应器培养容器、多于一个生物反应器培养容器或其任何组合。
36.除非另有说明，术语“约”是指所述非百分数的
±
10％，四舍五入至最接近的整数。例如，约20克将包括18至22克。除非另有说明，术语“约”是指百分数的
±
5％。例如，约50％将包括45％至55％。当根据范围讨论术语“约”时，则该术语是指小于下限且大于上限的适当量。例如，每升约100至约300克细胞干重将包括每升90至330克细胞干重。
37.除非另有说明，本文所述的性质(高度、宽度、长度、比率等)应理解为平均测定值。
38.除非另外指明，术语“提供(provide)”、“提供(provided)”、“提供(providing)”是指本文任何实施方案的任何方法或系统的任何要素、量、组分、试剂、定量、测定或分析的供应、生产、购买、制造、组装、形成、选择、配置、转换、引入、添加或并入。
39.序列同一性在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白)序列、或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。通常，在所比较序列的全长上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配所确定。通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行比较，来确定两个氨基酸序列之间的“相似性”。通过本领域技术人员已知的各种方法，可以容易地计算“同一性”和“相似性”。在一个实施方案中，通过比较本文鉴定的序列的全长来确定序列同一性。
40.确定同一性的示例性方法被设计为给出测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法可编入公众可获得的计算机程序中。确定两个序列之间的同一性和相似性的示例性计算机程序方法包括例如bestfit、blastp(蛋白质基本局部比对搜索工具)、blastn(核苷酸基本局部比对搜索工具)和fasta(altschul,s.f.等人,j.mol.biol.215:403-410(1990)，可从ncbi和其它来源公开获得(blast.rtm.manual,altschul,s.等人,ncbi nlm nih bethesda,md.20894)。所使用的最具代表性的算法是emboss(欧洲分子生物学开放软件套件)。使用emboss进行氨基酸序列比较的示例性参数是空位开头(gap open)10.0、空位延长(gap extend)0.5、blosum矩阵。使用emboss进行核酸序列比较的示例性参数是空位开头(gap open)10.0、空位延长(gap extend)0.5、dna全矩阵(dna同一性矩阵)。在实施方案中，可以使用在线数据如genebank、keg、blast和ensemble来比较不同物种中的dna/蛋白序列以确定序列的同源性。
41.可选地，在确定氨基酸相似性的程度时，技术人员也可以考虑所谓的“保守性”氨基酸置换，这对于技术人员而言是清楚的。保守性氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公开的氨基酸序列的置换变体是其中所公开的序列中的至少一个残基已被除去且在其位置上插入不同残基的那些。优选地，氨基酸改变是保守性的。每种天然存在的氨基酸的优选保守性置换如下：ala对ser；arg对lys；asn对gln或his；asp对glu；cys对ser或ala；gln对asn；glu对asp；gly对pro；his对asn或gln；ile对leu或val；leu对ile或val；lys对arg；gln或glu；met对leu或ile；phe对met、leu或tyr；ser对thr；thr对ser；trp对tyr；tyr对trp或phe；以及val对ile或leu。
42.除非另有说明，术语“适应的”或“密码子适应的”是指本文公开的多核苷酸的“密码子优化”，其序列可以是天然的或非天然的，或者可以适应于在其它微生物中表达。密码子优化使所编码的多肽的密码子使用适应于表达该多肽的生物体的密码子偏倚。密码子优化通常有助于增加宿主细胞中编码的多肽的生产水平。
43.由于使用化石燃料而导致的二氧化碳排放在全球范围内持续上升。降低大气二氧化碳水平是减缓或逆转气候变化的关键。碳捕集与封存(ccs)是用于从大气中除去工业二氧化碳的重要技术；据估计，从精炼和其它工业过程中捕集的超过20万亿吨的二氧化碳可以被运输并储存于各种类型的地下环境或储罐中。尽管与其它目前可用的方法相比，ccs是降低二氧化碳排放的具有经济效益且可负担的方式，但问题仍然在于二氧化碳仅被储存于地下直至其逸出。因此，ccs方法并未提供减少大气中过量二氧化碳的可持续解决方案。此外，对于工业来说，将二氧化碳泵送到地下环境中几乎没有财务激励，除非环境规章强制他们，或者向他们付费作为其商业模式的一部分。毫无争议，由于产生二氧化碳比处置二氧化碳更有利可图，全球变暖危机重重。
44.仍然需要以更有效且可持续的方式从大气中除去过量的二氧化碳。仍然需要能够利用过量的二氧化碳来制备有用产物，以及用于对工业和环境有益的其它应用的技术。
45.石油有限供应的挑战以及石油作业对环境的有害影响促使日益强调使现有资源的产出最大化，以及开发可使环境影响最小化的燃料和化学品的可再生资源。将生物质和捕集的二氧化碳转化成新产物(诸如生物燃料)的技术可有助于减少石油进口和二氧化碳排放。人们日益关注使用生物过程由有机废物生产增值燃料和其它有用的有机产物。
46.在此类有价值的有机产物中，乙烯是世界上最广泛生产的有机化合物，可用于广泛的工业，包括塑料、溶剂和纺织品。由于乙烯是潜在可再生的原料，因此已非常关注开发由可再生来源(诸如二氧化碳和生物质)生产乙烯的技术。目前通过蒸汽裂化化石燃料或使乙烷脱氢来生产乙烯。然而，在每年生产数百万公吨乙烯的情况下，此类方法生产了过多的二氧化碳以致极大地助长了全球碳足迹。因此，通过可再生方法生产乙烯将有助于满足来自能源和化学工业的巨大需求，同时还有助于保护环境。
47.已经开发了使用源自玉米或甘蔗的乙醇来生产生物乙烯的常规方法。然而，由生物质(例如玉米和甘蔗)生产生物乙烯是耗时且成本低效的方法，需要土地、运输和消化生物质。例如，存在与玉米和甘蔗的生长及运输相关的大量低效率情况，而玉米和甘蔗本身亦引起co2排放。多种微生物(包括细菌和真菌)天然产生少量乙烯。此类微生物利用乙烯形成酶(efe)。诸如在丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)和指状青霉菌(penicillium digitatum)中发现的一类乙烯途径在由乙烯形成酶催化的反应中使用α-酮戊二酸(akg)和精氨酸作为底物。乙烯形成酶提供了有前景的目标，因为单个基因的表达可足以用于乙烯生产。利用异源表达efe的技术已经在几种微生物物种中得到证实，其中微生物宿主已经能够在卡尔文循环中利用多种碳源，包括木质纤维素和二氧化碳。此外，近来有成本效益的高通量遗传测序技术的发展使得对微生物基因表达的理解增加。然而，目前可用的技术不能通过微生物活性来生产工业上相关量的乙烯。因此，生产足够量的乙烯所需的生物反应器的数量和体积可能过高。
48.在微生物有机产物生产过程中可能出现的另一个挑战是微生物代谢的副产物可以作为杂质与有机产物一起在生物反应器培养物中产生。有机产物和副产物杂质的混合物
可增加下游纯化过程的更多复杂性及附加成本。培养杂质可包括挥发性气体，诸如氧气，其可与挥发性有机产物共同产生。例如，通常由光合微生物产生氧气。生物反应器废气中氧气的浓度可能太高以致出现安全风险，或超过法规允许的最大量。另一个挑战是如何处理对另一种副产物的加工：作为微生物培养物生长的结果而产生的生物质。
49.仍然需要改进微生物生产，其可以以更高的效率和更低的成本以商业规模生产有机产物，包括乙烯。仍然需要改进微生物生产，其可以安全地减少或消除有机产物和培养杂质(包括挥发性气体)的共同产生，同时遵守政府法规。仍然需要在微生物有机产物生产中改进生物质的生产和处理。仍然需要使用二氧化碳原料来生产可用于工业及其它应用的有机产物(诸如生物乙烯)的方法。
50.本发明的实施方案可以提供从环境中除去二氧化碳的益处，以及生产能够在商业上销售的有价值的有机产物的益处。因此，通过使用重组微生物技术将二氧化碳转化为一种或多种有用的有机化合物，本发明的实施方案可提供常规二氧化碳储存的可再生替代物。本发明的实施方案的一个益处是该系统和方法可以使石油或天然气公司从环境中除去二氧化碳在经济上有利可图。石油公司或其承包商可以不将二氧化碳泵入地下环境或将隔离的二氧化碳留在地下，而是使用二氧化碳作为碳源来培养重组微生物，以具有经济效益的方式将二氧化碳转化为有用的有机产物。此外，由于该方法可以在现场实施，可以避免通过运输产生大量二氧化碳，或者预期消耗的二氧化碳比它们产生的二氧化碳更多。
51.用于保护环境的最有效方法是人们实际使用的那些方法。那些方法越有利，人们就越可能使用它们。本文公开的方法的益处之一是使用生物反应器系统的成本效益。本发明的实施方案可以通过使相关的代谢信号传导途径适应于以工业规模生产有机底物，来提供对光合有机底物生产微生物进行工程化的益处。本发明的实施方案可以提供对有机产物生产微生物进行工程化的益处，所述有机产物生产微生物可以利用由光合微生物生产的有机底物来生产有机产物，通过调整相关代谢信号传导途径来以工业规模生产有机产物。此类实施方案可以提供有机产物生产效率提高和成本降低的益处。此类实施方案可以有利地从大气中除去二氧化碳，并且在微生物进行工作的同时被动地以先前无法想象的规模产生有价值的有机化合物。
52.本发明的实施方案还可以提供从有机产物的生产中分离一种或多种培养杂质的生产的益处，从而减少或消除有机产物和培养杂质的共同产生。此类实施方案可以提供更安全的有机产物生产的益处，以及减少下游纯化的复杂性和成本。本文的实施方案还可提供使生物质产生最小化的益处，同时促进生产的生物质用于有益应用。
53.如果全球变暖危机变得更有利可图，或正像有利可图一样，将二氧化碳转化成有价值的有机化合物，就像它首先产生二氧化碳一样，将会发生什么情况？当前公开的方法可以使能源生产者从全球变暖公司转变为全球变冷公司。
54.本发明涉及用于生产有机产物的生物制造系统。在某些实施方案中，此类系统包括有机底物培养液和有机产物培养液，所述有机底物培养液含有具有改进的底物生产能力的第一重组微生物，所述有机产物培养液含有具有改进的有机产物生产能力的第二重组微生物。作为分别通过有机底物培养液和有机产物培养液生产有机底物和生产有机产物的总体概述，参考图1，有机底物培养液100在光合光反应108中捕集二氧化碳102以及水104和光106，产生培养杂质氧气110和能量底物112；酶途径114利用能量底物112生产有机底物α-酮
戊二酸116。有机底物α-酮戊二酸116在时间点118通过启动子诱导物控制的生产，或通过过滤器或流动路径分离120，进入有机产物培养液122。酶途径124利用有机产物培养液α-酮戊二酸126和乙烯形成酶128生产有机产物乙烯130。
55.作为本文公开的生物制造系统的总体概述，参考图2，系统200包括：含有有机底物培养液204的第一生物反应器培养容器202、碳源入口206、挥发性气体出口208、动力源和/或光源210，包括连接至第一生物反应器培养容器202的出水口214及出水口216的压缩机/冷凝器212；第二生物反应器培养容器218，该第二生物反应器培养容器218含有有机产物培养液220并包括流体流动路径222和有机产物出口224，该流体流动路径222连接至第一生物反应器培养容器202和第二生物反应器培养容器218并位于第一生物反应器培养容器202与第二生物反应器培养容器218之间；胺汽提塔226，该胺汽提塔226包括连接至胺洗涤器232的富胺出口228和贫胺入口230；二氧化碳出口234，该二氧化碳出口234连接至胺洗涤器232和第一生物反应器培养容器202并位于胺洗涤器232与第一生物反应器培养容器202之间；包括出水口238的压缩机/冷凝器236；催化转化器240；苛性碱塔242；包括再生气体入口246和出水口248的干燥器244；压缩机/泵250；以及有机产物出口252。
56.本发明涉及用于生产有机产物的方法。作为本文公开的方法的总体概述，参见图4，该方法包括提供根据本文的实施方案的生物制造系统102；在足以在第一生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机底物的条件下，在含有有机底物培养液的第一生物反应器培养容器中培养第一重组微生物104；在足以在第二生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机产物的条件下，在含有有机产物培养液的第二生物反应器培养容器中培养第二重组微生物106；从有机底物培养物中除去一定量的至少一种挥发性气体108；从有机产物培养液中除去一定量的至少一种有机产物110；将一定量的二氧化碳从二氧化碳源进料至有机底物培养液中112；将有机底物培养液和有机产物培养液的ph水平维持在约5.0至约8.5 114；从第一生物反应器培养容器收集第一重组微生物生产的生物质的量116，从第二生物反应器培养容器收集第二重组微生物生产的生物质的量118；以及基于第二生物反应器培养容器的总内部体积，将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量维持在约10体积％至约1体积％或更少120。
57.生物制造系统的实施方案
58.本文的实施方案涉及用于生产有机产物的生物制造系统。在各种实施方案中，所述系统包括至少一个生物反应器培养容器。在各种实施方案中，至少一个生物反应器培养容器含有有机底物培养液，其中有机底物培养液含有第一重组微生物。在各种实施方案中，第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，能够利用碳源来生产有机底物，并生产至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体副产物或其它不期望的产物中的至少一种。杂质的实例可以是气态或液态的氧气或甲烷或其组合。在各种实施方案中，至少一个生物反应器培养容器含有有机产物培养液，其中有机产物培养液含有第二重组微生物。在各种实施方案中，第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，并且能够利用有机底物来生产至少一种有机产物。在各种实施方案中，至少一种有机产物可以包括烯烃、烷烃、多烯、醇、挥发性有机化合物或其组合。
59.在某些实施方案中，至少一个生物反应器培养容器包括：第一生物反应器培养容器，该第一生物反应器培养容器包括碳源入口、挥发性气体出口和动力源；以及第二生物反应器培养容器，该第二生物反应器培养容器包括流体流动路径和有机产物出口，该流体流动路径连接至第一生物反应器培养容器和第二生物反应器培养容器并位于二者之间。在此类实施方案中，第一生物反应器培养容器包括有机底物培养液，第二生物反应器培养容器包括有机产物培养液。此类实施方案可以提供将第一重组微生物生产的至少一种有机底物培养杂质与第二重组微生物生产的至少一种有机产物分离的益处。在此类实施方案中，可以通过连接至第一生物反应器培养容器和第二生物反应器培养容器并位于二者之间的流体流动路径，将有机底物和其它营养物提供给第二重组微生物，以提供第二重组微生物的生长和有机产物的生产。在此类实施方案中，如果至少一种有机底物培养杂质包括挥发性气体，则可以通过挥发性气体出口从有机底物培养液中除去挥发性气体。在某些实施方案中，挥发性气体包括氧气、甲烷或其组合。此类实施方案可以提供对第一重组微生物和第二重组微生物生长速率的控制改进、碳捕集速率改进以及有机产物产率改进的益处。
60.在此类实施方案中，可以通过碳源入口提供碳源作为营养物，以支持第一重组微生物的生长和至少一种有机底物的生产。在某些实施方案中，碳源包括二氧化碳、一氧化碳、植物油、甘油、葡萄糖、蔗糖、单糖、二糖、多糖或其组合。此类实施方案可以提供利用工业二氧化碳生产有机产物的益处。在某些实施方案中，第一重组微生物生产的至少一种有机底物包括α-酮戊二酸(akg)、蔗糖、葡萄糖、甘油、单糖、二糖、多糖或其组合。此类实施方案可提供以下益处：提供在第一生物反应器培养容器中生产的非挥发性有机底物，所述非挥发性有机底物可用于在第二生物反应器培养容器中生产有机产物。在某些实施方案中，第二生物反应器培养容器还包括碳源入口、挥发性气体出口、动力源或其组合。
61.在某些实施方案中，第二重组微生物生产的至少一种有机产物包括乙烯、醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、有机酸、丙酸、乙酸、醛、甲醛、长链脂肪酸、正烷烃、烃或其组合。在某些实施方案中，至少一种有机底物包括akg，并且至少一种有机产物包括乙烯。
62.在某些实施方案中，第一生物反应器培养容器或第二生物反应器培养容器还包括生物质收集端口。在此类实施方案中，生物质收集端口可以提供能够从第一生物反应器培养物、第二生物反应器培养物或其组合收集生物质的益处，用于处置或处理生物质以用于肥料、原料、生物燃料或其它应用。
63.在某些实施方案中，动力源包括太阳光、太阳能动力源、电动力源或其组合。在某些实施方案中，系统还包括碳酸化单元、胺汽提塔、胺洗涤器、催化转化器、冷凝器、压缩机、苛性碱塔、干燥器或其组合。
64.在某些实施方案中，在一个生物反应器培养容器中组合有机底物培养液和有机产物培养液。在一些实施方案中，通过过滤器分离有机底物培养液和有机产物培养物。在此类实施方案中，过滤器可包括约0.2μm至约10μm或更大的孔径。在某些实施方案中，过滤器包括约1μm至约8μm或更大的孔径。在某些实施方案中，过滤器包括约3μm至约5μm或更大的孔径。通过允许至少一种有机底物和其它营养物从有机底物培养液通过过滤器流至有机产物培养液，同时不允许或减少至少一种有机底物培养杂质通过过滤器的流动，此类实施方案可以提供将第一重组微生物生产的至少一种有机底物培养杂质与第二重组微生物生产的至少一种有机产物分离的益处。在某些实施方案中，有机底物培养液和有机产物培养液含
有通过过滤器分离的悬浮有机颗粒。在某些实施方案中，可以使用离心机从有机底物培养液或有机产物培养液中分离悬浮有机颗粒。
65.在其它实施方案中，在一个生物反应器培养容器中组合有机底物培养液和有机产物培养液，将第一重组微生物表达的至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列以及第二重组微生物表达的至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列分别插入到第一微生物表达载体和第二微生物表达载体中。第一微生物表达载体和第二微生物表达载体各自包括至少一个微生物表达启动子。此类实施方案可以提供以下益处：通过在不同时间点生产至少一种有机底物和至少一种有机产物，通过在不同时间点向有机底物培养液中或有机产物培养液中加入至少一种启动子诱导物，将第一重组微生物生产的至少一种有机底物培养杂质与第二重组微生物生产的至少一种有机产物分离。
66.重组微生物的实施方案
67.在本文系统的某些实施方案中，有机底物包括α-酮戊二酸(akg)，其中第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量大于缺乏表达非天然akg形成酶的核苷酸序列的对照微生物生产的akg形成酶的量。在此类实施方案中，至少一种有机产物包括乙烯，其中第二重组微生物生产的至少一种乙烯形成酶(efe)的量大于缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe的量。在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达至少一种非天然akgp形成核酸序列来表达至少一种α-酮戊二酸通透酶蛋白(akgp)。此类实施方案可以提供有机底物和至少一种有机产物的产率增加的益处，从而减少以商业规模生产乙烯所需的生物反应器的数量和体积。
68.在某些实施方案中，至少一种akg形成酶包括异柠檬酸脱氢酶(icd)蛋白、谷氨酸脱氢酶(gdh)蛋白或其组合。在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：2至少95％同一性的核苷酸序列的非天然icd蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：1至少95％同一性的氨基酸序列的icd蛋白。在一个实施方案中，icd氨基酸序列具有与seq id no：1至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，icd氨基酸序列具有与seq id no：1至少98％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，icd核苷酸序列具有与seq id no：2至少80％或至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，icd核苷酸序列具有与seq id no：2至少98％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：4至少95％同一性的核苷酸序列的非天然icd蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：3至少95％同一性的氨基酸序列的icd蛋白。在一个实施方案中，icd氨基酸序列具有与seq id no：3至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，icd氨基酸序列具有与seq id no：3至少98％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，icd核苷酸序列具有与seq id no：4至少80％或至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，icd核苷酸序列具有与seq id no：4至少98％同一性的核苷酸序列。
69.在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：6至少95％同一性的核苷酸序列的非天然gdh蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：5至少95％同一性的氨基酸序列的gdh蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：5至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列的gdh蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：5至少98％同一性的氨基酸序列的gdh蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：6至少80％或至少90％同一性的核苷酸序列的gdh核苷
酸序列。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：6至少98％同一性的核苷酸序列的gdh核苷酸序列。
70.在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：2或seq id no：4至少95％同一性的核苷酸序列的非天然icd蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：1或seq id no：3具有至少95％同一性的氨基酸序列的icd蛋白，以及通过表达具有与seq id no：6至少95％同一性的核苷酸序列的非天然gdh蛋白核苷酸序列来获得具有与seq id no：5至少95％同一性的氨基酸序列的gdh蛋白。
71.在某些实施方案中，第二重组微生物通过表达具有与seq id no：8至少95％同一性的核苷酸序列的非天然efe蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：7至少95％同一性的氨基酸序列的efe蛋白。在一个实施方案中，第二重组微生物表达具有与seq id no：7至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列的efe蛋白。在一个实施方案中，第二重组微生物表达具有与seq id no：7至少98％同一性的氨基酸序列的efe蛋白。在一个实施方案中，第二重组微生物表达具有与seq id no：8至少80％或至少90％同一性的核苷酸序列的非天然efe蛋白核苷酸序列。在一个实施方案中，第二重组微生物表达具有与seq id no：8至少98％同一性的核苷酸序列的非天然efe蛋白核苷酸序列。
72.在某些实施方案中，第一重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：光合细菌、蓝细菌、聚球藻属、细长聚球藻、synechococcus leopoliensis、集胞藻属、鱼腥藻属、假单胞菌属、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻属和莱茵衣藻。在某些实施方案中、第二重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：埃希氏菌属、大肠杆菌、土细菌、石蜡节杆菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞菌属、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、粘质沙雷氏菌、bacillus metatherium、沼泽假丝酵母、pichia inositovora、光滑球拟酵母、解脂假丝酵母、解脂耶氏酵母、酿酒酵母、曲霉菌属、枯草芽孢杆菌、乳杆菌属。
73.在某些实施方案中，第一重组微生物包括缺乏葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶蛋白表达的δ-glgc(δglgc)突变微生物。在此类实施方案中，第一重组微生物将其代谢途径从糖原产生转变为有利于产生更多的酮酸，包括akg。在某些实施方案中，包括δglgc突变的第一重组微生物将产生并分泌增加水平的akg。此类实施方案可以提供以下益处：通过增加有机底物的量来增加第二重组微生物的乙烯生产。
74.在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：10至少95％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖合酶蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：9至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖合酶蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：9至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列的蔗糖合酶蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：9至少98％同一性的氨基酸序列的蔗糖合酶蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：10至少80％或至少90％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖合酶蛋白核苷酸序列。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：10至少98％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖合酶蛋白核苷酸序列。此类实施方案可以提供增加蔗糖生产作为用于第一重组微生物生长的碳源以及用于第二重组微生物生长的碳源的益处。
75.在某些实施方案中，第一重组微生物通过表达具有与seq id no：12至少95％同一性的核苷酸序列的蔗糖磷酸合酶核苷酸序列来表达具有与seq id no：11至少95％同一性
的氨基酸序列的蔗糖磷酸合酶蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：11至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列的蔗糖磷酸合酶蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：11至少98％同一性的氨基酸序列的蔗糖磷酸合酶蛋白。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：12至少80％或至少90％同一性的核苷酸序列的蔗糖磷酸酯蛋白核苷酸序列。在一个实施方案中，第一重组微生物表达具有与seq id no：12至少98％同一性的核苷酸序列的蔗糖磷酸酯蛋白核苷酸序列。此类实施方案可以提供蔗糖生产作为用于生长第一重组微生物的附加碳源以及用于生长第二重组微生物的附加碳源的益处。
76.在各种实施方案中，第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量大于缺乏表达非天然akg形成酶的核苷酸序列的对照微生物生产的量。在某些实施方案中，第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量比缺乏表达非天然akg形成酶的核苷酸序列的对照微生物生产的量高约5％至约200％或更多。在一些实施方案中，第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量比缺乏表达非天然akg形成酶的核苷酸序列的对照微生物生产的量高约50％至约150％或更多。在某些实施方案中，第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量比缺乏表达非天然akg形成酶的核苷酸序列的对照微生物生产的量高约75％至约100％或更多。
77.在各种实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量大于缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe蛋白的量。在某些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量比缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe蛋白的量高约5％至约200％或更多。在某些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量比缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe蛋白的量高约50％至约150％或更多。在某些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量比缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe蛋白的量高约75％至约100％或更多。
78.在某些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量为每升有机产物培养液约20克至约100克或更多。在一些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量为每升有机产物培养液约35克至约85克或更多。在一些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量为每升有机产物培养液约50克至约70克或更多。
79.在某些实施方案中，第二重组微生物包括大肠杆菌。此类实施方案可提供第二重组微生物的快速生长速率的益处，以及可用于可增加有机产物产率的遗传修饰的广泛工具。在某些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量为第二重组微生物的总细胞蛋白量的约30％至约80％或更多。在一些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量为第二重组微生物的总细胞蛋白量的约40％至约70％或更多。在一些实施方案中，第二重组微生物生产的efe蛋白的量为第二重组微生物的总细胞蛋白量的约50％至约60％或更多。
80.在某些实施方案中，第二重组微生物生产的乙烯的生产率为约1亿磅/年至约10亿磅/年或更高。在一些实施方案中，第二重组微生物生产的乙烯的生产率为约2亿磅/年至约8亿磅/年或更高。在一些实施方案中，第二重组微生物生产的乙烯的生产率为约4亿磅/年至约6亿磅/年或更高。在某些实施方案中，第二重组微生物生产的乙烯的生产率为每月约0.13至约8.3磅/加仑生物反应器培养物。在规模上，约0.13磅/加仑生物反应器/月生产率可转化为具有高达642个商业规模(1000000加仑)生物反应器的工业工厂，用于每年生产高
达约10亿磅或更多的乙烯。如果生产率增加到约8.3磅/加仑生物反应器/月，10个商业规模(1000000加仑)生物反应器将足以用于约10亿磅/年或更多乙烯生产的工业工厂。
81.在某些实施方案中，第二重组微生物的细胞浓度在每毫升约107至约10
13
个细胞的范围内。在一些实施方案中，第二重组微生物的浓度为每毫升约108至约10
12
个细胞。在一些实施方案中，第二重组微生物的浓度为每毫升约109至约10
11
个细胞。在某些实施方案中，第二重组微生物的浓度范围为：每升有机产物培养液的细胞干重为每升约100克至约300克细胞干重，或每升约0.2克至约100克细胞干重。在某些实施方案中，第二重组微生物的浓度范围为：每升有机产物培养液的细胞干重为约125克至约275克细胞干重。在某些实施方案中，第二重组微生物的浓度范围为：每升有机产物培养液的细胞干重为每升约150克至约250克细胞干重。
82.在某些实施方案中，将非天然akg形成酶表达核苷酸序列或非天然efe表达核苷酸序列插入到微生物表达载体中，其中微生物表达载体包括细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、抗生素抗性系统、用于蛋白纯化和检测的辅助系统、crisprcas系统、噬菌体展示系统或其组合。在某些实施方案中，efe表达核苷酸序列在微生物表达载体中具有约2至约500或更多的拷贝数。在一些实施方案中，efe表达核苷酸序列在微生物表达载体中具有约10至约300的拷贝数。在一些实施方案中，efe表达核苷酸序列在微生物表达载体中具有约50至约100的拷贝数。此类实施方案可以提供乙烯产率增加的益处，从而降低商业规模乙烯生产的体积和成本。
83.在某些实施方案中，所述微生物表达载体包括至少一种微生物表达启动子。在某些实施方案中，所述至少一种微生物表达启动子包括光敏启动子、化学敏感启动子、温度敏感启动子、lac启动子t7启动子、cspa启动子、λpl启动子、λcl启动子、连续生产启动子、psba启动子或其组合。
84.生产有机产物的方法的实施方案
85.本文的实施方案涉及生产有机产物的方法。在一个实施方案中，该方法包括提供一种生物制造系统，该生物制造系统包括：至少一个生物反应器培养容器；其中至少一个生物反应器培养容器含有有机底物培养液；其中有机底物培养液含有第一重组微生物；其中第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，能够利用碳源生产有机底物，并且生产至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体中的至少一种；其中至少一个生物反应器培养容器含有有机产物培养液；其中有机产物培养液含有第二重组微生物；其中第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，并且能够利用有机底物生产至少一种有机产物；其中至少一个生物反应器培养容器包括第一生物反应器培养容器，第一生物反应器培养容器包括碳源入口、挥发性气体出口和动力源；并且系统包括第二生物反应器培养容器和有机产物出口，所述第二生物反应器培养容器包括流体流动路径连接至第一生物反应器培养容器和第二生物反应器培养容器并位于二者之间；其中第一生物反应器培养容器包括有机底物培养液，并且第二生物反应器培养容器包括有机产物培养液。
86.在此类实施方案中，所述方法包括：在足以在第一生物反应器培养容器中产生至少一种有机底物的量的条件下，在第一生物反应器培养容器中培养第一重组微生物；以及
在足以在第二生物反应器培养容器中产生至少一种有机产物的量的条件下，在第二生物反应器培养容器中培养第二重组微生物。此类实施方案可以提供以下益处：第一重组微生物生产至少一种有机底物培养杂质与第二重组微生物生产至少一种有机产物分开。在此类实施方案中，可以通过连接至第一生物反应器培养容器和第二生物反应器培养容器并位于二者之间的流体流动路径，将有机底物和其它营养物提供给第二重组微生物，以提供第二重组微生物的生长和有机产物的生产。
87.在某些实施方案中，所述方法还包括通过挥发性气体出口从有机底物培养液中除去一定量的至少一种挥发性气体。在某些实施方案中，所述方法还包括通过有机产物出口从有机产物培养液中除去一定量的至少一种有机产物。在某些实施方案中，如果碳源包括二氧化碳，则该方法还包括通过碳源入口将一定量的二氧化碳从二氧化碳源进料至有机底物培养液中。此类实施方案可以提供以下益处：对第一重组微生物和第二重组微生物生长速率的控制改进，碳捕集速率改进以及有机产物产率改进。
88.在某些实施方案中，所述方法还包括将有机底物培养液和有机产物培养液的ph水平维持在约5.0至约8.5。在某些实施方案中，所述方法还包括将有机底物培养液和有机产物培养液的ph水平维持在约5.5至约8.0。在某些实施方案中，所述方法还包括将有机底物培养液和有机产物培养液的ph水平维持在约6.0至约7.0。
89.在某些实施方案中，所述方法还包括将有机底物培养液和有机产物培养液维持在约25摄氏度至约70摄氏度或更高的温度下。在某些实施方案中，所述方法还包括将有机底物培养液和有机产物培养液维持在约35摄氏度至约60摄氏度的温度下。在某些实施方案中，所述方法还包括将有机底物培养液和有机产物培养液维持在约40摄氏度至约50摄氏度的温度下。在某些实施方案中，所述方法还包括将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量维持在基于第二生物反应器培养容器的总内部体积的约10体积％至约1体积％或更少。在某些实施方案中，所述方法还包括将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量维持在基于第二生物反应器培养容器的总内部体积的约5体积％至约0.5体积％或更少。在某些实施方案中，所述方法还包括将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量维持在基于第二生物反应器培养容器的总内部体积的约1体积％至约0.1体积％或更少。此类实施方案可以提供以下益处：生产的至少一种有机产物含有安全水平的挥发性气体。此类实施方案可以提供以下益处：生产的至少一种有机产物含有在规定限度内的挥发性气体水平。
90.在某些实施方案中，如果第一生物反应器培养容器或第二生物反应器培养容器还包括生物质收集端口，则所述方法还包括通过生物质收集端口收集由第一重组微生物或第二重组微生物生产的一定量的生物质。此类实施方案可以提供以下益处：收集生物质用于处置或加工生物质以用于肥料、原料、生物燃料或其它应用。
91.在本文方法的某些实施方案中，将非天然有机底物形成重组酶表达核苷酸序列或非天然有机产物表达核苷酸序列插入到微生物表达载体中，其中至少一种微生物表达载体包括至少一种微生物表达启动子。在某些实施方案中，所述方法还包括通过向有机底物培养液或有机产物培养液中加入至少一种启动子诱导物来控制至少一种有机底物的量或至少一种有机产物的量。在某些实施方案中，所述至少一种微生物表达启动子包括光敏启动子、化学敏感启动子、温度敏感启动子、lac启动子、t7启动子、cspa启动子、λpl启动子、λcl启动子、连续生产启动子、psba启动子或其组合。在某些实施方案中，所述至少一种启动子
诱导物包括乳糖、木糖、iptg、冷激、热激或其组合。
92.在本文方法的某些实施方案中，至少一种有机底物包括akg。在此类实施方案中，至少一种有机产物包括乙烯。在某些实施方案中，如果至少一种有机底物培养杂质包括至少一种挥发性气体，则该方法还包括通过挥发性气体出口除去至少一种挥发性气体。
93.在某些实施方案中，所述方法包括回收以约1亿磅/年至约10亿磅/年或更高的速率生产的乙烯的量。在一些实施方案中，所述方法包括回收以约2亿磅/年至约8亿磅/年或更高的速率生产的乙烯的量。在某些实施方案中，所述方法包括回收以约4亿磅/年至约6亿磅/年或更高的速率生产的乙烯的量。在某些实施方案中，所述方法包括回收以每月约0.13至约8.3磅/加仑生物反应器培养物的速率产生的乙烯的量。在规模上，0.13磅/加仑生物反应器/月生产率可转化为具有高达642个商业规模(1000000加仑)生物反应器的工业工厂，用于每年生产高达约10亿磅或更多的乙烯。如果生产率增加到约8.3磅/加仑生物反应器/月，10个商业规模(1000000加仑)生物反应器将足以用于约10亿磅/年或更多乙烯生产的工业工厂。在某些实施方案中，生产的乙烯的量含有约1摩尔％或更少的量的挥发性气体。在某些实施方案中，生产的乙烯的量含有约0.5摩尔％或更少的量的挥发性气体。在某些实施方案中，生产的乙烯的量含有约0.25摩尔％或更少的量的挥发性气体。
94.本文的实施方案涉及生产有机产物的方法，其中所述方法包括提供生物修复系统，所述生物修复系统包括：至少一个生物反应器培养容器；其中至少一个生物反应器培养容器含有有机底物培养液；其中有机底物培养液含有第一重组微生物；其中第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，能够利用碳源产生所述有机底物，并且产生至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体中的至少一种；并且其中至少一个生物反应器培养容器含有有机产物培养液；其中有机产物培养液含有第二重组微生物；其中第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，并且能够利用有机底物产生至少一种有机产物。在此类实施方案中，在一个生物反应器培养容器中组合有机底物培养液和有机产物培养液，其中将非天然有机底物形成重组酶表达核苷酸序列插入到第一微生物表达载体中，其中将非天然有机产物形成酶表达核苷酸序列被插入到第二微生物表达载体中，并且其中第一微生物表达载体和第二微生物表达载体各自包括至少一个微生物表达启动子。
95.在此类实施方案中，所述方法包括提供连接至碳源入口的碳源；在足以在第一生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机底物的条件下，在第一生物反应器培养容器中培养第一重组微生物；通过在第一时间点向有机底物培养液中添加至少一种启动子诱导物来产生一定量的至少一种有机底物；在足以在第二生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机产物的条件下，在第二生物反应器培养容器中培养第二重组微生物；以及通过在第二时间点向有机产物培养液中添加至少一种启动子诱导物来产生一定量的至少一种有机产物。此类实施方案可以提供以下益处：通过在不同时间点产生至少一种有机底物和至少一种有机产物，通过在有机底物培养液中或在不同时间点向有机产物培养液中加入至少一种启动子诱导物，将第一重组微生物生产的至少一种有机底物培养杂质与第二重组微生物生产的至少一种有机产物分离。
96.在某些实施方案中，所述方法包括：在第二时间点之前，基于第二生物反应器培养
容器的总内部体积，将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量降低至约10体积％至约1体积％或更少。在一些实施方案中，所述方法包括：在第二时间点之前，基于第二生物反应器培养容器的总内部体积，将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量降低至约5体积％至约0.5体积％或更少。在某些实施方案中，所述方法包括：在第二时间点之前，基于第二生物反应器培养容器的总内部体积，将第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量降低至约1体积％至约0.1体积％或更少。此类实施方案可以提供生产含有安全水平的挥发性气体的至少一种有机产物的益处。此类实施方案可以提供生产至少一种含有在规定限度内的挥发性气体水平的有机产物的益处。
97.本文的实施方案涉及生产乙烯的方法。在某些实施方案中，所述方法包括提供一种生物制造系统，所述生物制造系统包括：第一生物反应器培养容器，所述第一生物反应器培养容器包括碳源入口、挥发性气体出口和动力源；以及第二生物反应器培养容器，所述第二生物反应器培养容器包括流体流动路径和有机产物出口，所述流体流动路径连接至第一生物反应器培养容器和第二生物反应器培养容器并位于二者之间；其中第一生物反应器培养容器包括有机底物培养液，第二生物反应器培养容器包括有机产物培养液；其中有机底物培养液含有具有改进的有机底物生产能力的第一重组微生物，其中有机底物包括akg，其中第一重组微生物通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，其中有机底物形成酶包括akg形成酶，其中第一重组微生物能够利用碳源产生一定量的akg，其中第一重组微生物生产至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体中的至少一种；其中挥发性气体包括氧气，其中有机产物培养液含有具有改进的有机产物生产能力的第二重组微生物，其中有机产物包括乙烯，其中第二重组微生物通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，其中有机产物形成酶包括efe，并且其中第二重组微生物能够利用akg产生一定量的乙烯。在某些实施方案中，所述方法包括：在足以在第一生物反应器培养容器中产生一定量akg的条件下，在第一生物反应器培养容器中培养第一重组微生物；在足以在第二生物反应器培养容器中产生一定量的efe的条件下，在第二生物反应器培养容器中培养第二重组微生物；通过挥发性气体出口从有机底物培养液中除去一定量的氧气；以及通过有机产物出口从有机产物培养液中除去一定量的efe。此类实施方案可以提供在分开的生物反应器培养容器中产生氧气和乙烯的益处；在此类实施方案中，可以减少或消除氧气和挥发性产物(诸如乙烯)的共同产生。此类实施方案还可以提供生产非挥发性有机底物(诸如akg)的益处，其可以用于在第二生物反应器培养容器中生产乙烯。
98.附加实施方案：
99.实施方案1.一种用于生产有机产物的生物制造系统，包括：
100.至少一个生物反应器培养容器；
101.其中所述至少一个生物反应器培养容器含有有机底物培养液，
102.其中所述有机底物培养液含有第一重组微生物，所述第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，
103.其中所述第一重组微生物通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，
104.其中所述第一重组微生物能够利用碳源生产有机底物，
105.其中所述第一重组微生物生产至少一种有机底物培养杂质，包括挥发性气体、液体和固体中的至少一种；以及
106.其中所述至少一个生物反应器培养容器含有有机产物培养液，
107.其中所述有机产物培养液含有第二重组微生物，所述第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，
108.其中所述第二重组微生物通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，
109.其中所述第二重组微生物能够利用有机底物生产至少一种有机产物。
110.实施方案2.根据实施方案1或任何前述实施方案的系统，其中所述至少一个生物反应器培养容器包括第一生物反应器培养容器，所述第一生物反应器培养容器包括碳源入口、挥发性气体出口和动力源；以及第二生物反应器培养容器，所述第二生物反应器培养容器包括流体流动路径和有机产物出口，所述流体流动路径连接至所述第一生物反应器培养容器和所述第二生物反应器培养容器并位于二者之间；
111.其中第一生物反应器培养容器包括有机底物培养液，并且第二生物反应器培养容器包括有机产物培养液；或者其中第一生物反应器培养容器或第二生物反应器培养容器还包括生物质收集端口。
112.实施方案3.根据实施方案2或任何前述实施方案的系统，其中所述碳源包括二氧化碳、一氧化碳、正烷烃、乙醇、植物油、甘油、葡萄糖、蔗糖、单糖、二糖、多糖或其组合；或者
113.其中所述动力源包括太阳光、太阳能动力源、电动力源或其组合；或者
114.其中所述挥发性气体包括氧气、甲烷或其组合；或者
115.其中所述至少一种有机底物包括α-酮戊二酸、蔗糖、葡萄糖、甘油、单糖、二糖、多糖或其组合；或者
116.其中所述至少一种有机产物包括醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、有机酸、丙酸、乙酸、醛、甲醛、长链脂肪酸、正烷烃、烃或其组合；或者
117.其中所述第二生物反应器培养容器还包括碳源入口、挥发性气体出口、动力源或其组合。
118.实施方案4.根据实施方案1或任何前述实施方案的系统，其中在一个生物反应器培养容器中组合所述有机底物培养液和所述有机产物培养液；或者
119.通过过滤器分离所述有机底物培养液和所述有机产物培养物，其中所述过滤器包括约0.2μm至约10μm或更大的孔径；或者
120.其中所述系统还包括碳酸化单元、胺汽提塔、胺洗涤器、催化转化器、冷凝器、压缩机、苛性碱塔、干燥器或其组合。
121.实施方案5.根据实施方案1或任何前述实施方案的系统，其中所述有机底物包括α-酮戊二酸(akg)，其中所述第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量大于缺乏非天然akg形成酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的akg形成酶的量；或者
122.其中所述至少一种有机产物形成酶包括乙烯形成酶(efe)，并且所述第二重组微生物生产的efe的量大于缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe的量。
123.实施方案6.根据实施方案5或任何前述实施方案的系统，其中所述第一重组微生物通过表达至少一种非天然akgp形成核苷酸序列来表达至少一种α-酮戊二酸通透酶蛋白
(akgp)。
124.实施方案7.根据实施方案5或任何前述实施方案的系统，其中所述至少一种akg形成酶包括异柠檬酸脱氢酶(icd)蛋白、谷氨酸脱氢酶(gdh)蛋白或其组合。
125.实施方案8.根据实施方案7或任何前述实施方案的系统，其中所述第一重组微生物通过表达具有与seq id no：2至少95％同一性的核苷酸序列的非天然icd蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：1至少95％同一性的氨基酸序列的icd蛋白；或者
126.所述第一重组微生物通过表达具有与seq id no：6至少95％同一性的核苷酸序列的非天然gdh蛋白核苷酸序列或其组合来表达具有与seq id no：5至少95％同一性的氨基酸序列的gdh蛋白；或者
127.其中所述第二重组微生物通过表达具有与seq id no：8至少95％同一性的核苷酸序列的非天然efe蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：7至少95％同一性的氨基酸序列的efe蛋白。
128.实施方案9.根据实施方案1或任何前述实施方案的系统，其中所述第一重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：光合细菌、蓝细菌、聚球藻属、细长聚球藻、synechococcus leopoliensis、集胞藻属、鱼腥藻属、假单胞菌属、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻属、莱茵衣藻、埃希氏菌属、大肠杆菌、土细菌、石蜡节杆菌、荧光假单胞菌、粘质沙雷氏菌、bacillus metatherium、沼泽假丝酵母、pichia inositovora、光滑球拟酵母、解脂假丝酵母、解脂耶氏酵母、酿酒酵母、鱼腥藻属、曲霉菌属、枯草芽孢杆菌、小球藻属、乳杆菌属、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌和植物细胞；或者所述第二重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：埃希氏菌属、大肠杆菌、土细菌、石蜡节杆菌、荧光假单胞菌、粘质沙雷氏菌、bacillus metatherium、沼泽假丝酵母、pichia inositovora、光滑球拟酵母、解脂假丝酵母、解脂耶氏酵母、酿酒酵母、鱼腥藻属、曲霉菌属、枯草芽孢杆菌、小球藻属、乳杆菌属、厌氧菌和枯草芽孢杆菌。
129.实施方案10.根据实施方案1或任何前述实施方案的系统，其中所述第一重组微生物包括缺乏葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶蛋白表达的δ-glgc突变微生物；或者其中所述第一重组微生物通过表达具有与seq id no：10至少95％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖合酶蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：9至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖合酶蛋白；或者其中所述第一重组微生物通过表达具有与seq id no：12至少95％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖磷酸合酶核苷酸序列来表达具有与seq id no：11至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖磷酸合酶蛋白。
130.实施方案11.根据实施方案5或任何前述实施方案的系统，其中所述第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量比缺乏表达非天然akg形成酶的核苷酸序列的对照微生物生产的量高约5％至约200％或更多；或者
131.其中所述第二重组微生物生产的efe蛋白的量比缺乏所述非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe蛋白的量高约5％至约200％或更多；或者
132.其中所述第二重组微生物生产的efe蛋白的量为每升有机产物培养液约20克至约100克或更多。
133.实施方案12.根据实施方案5或任何前述实施方案的系统，其中所述第二重组微生物包括大肠杆菌，所述第二重组微生物生产的efe蛋白的量为所述第二重组微生物的总细
胞蛋白量的约30％至约80％或更多；或者
134.所述第二重组微生物生产的所述至少一种有机产物的生产率为约1亿磅/年至约10亿磅/年或更高；或者
135.其中所述第二重组微生物的细胞浓度为每毫升约107至约10
13
个细胞，或每升有机产物培养液的细胞干重为每升约100克至约300克细胞干重。
136.实施方案13.根据实施方案5或任何前述实施方案的系统，其中将所述非天然akg形成酶表达核苷酸序列或非天然efe表达核苷酸序列插入到微生物表达载体中，其中所述微生物表达载体包括细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、抗生素抗性系统、用于蛋白纯化和检测的辅助系统、crispr cas系统、噬菌体展示系统或其组合。
137.实施方案14.根据实施方案5或任何前述实施方案的系统，其中所述efe表达核苷酸序列在所述微生物表达载体中具有约2至约500的拷贝数；或者其中所述微生物表达载体包括至少一个微生物表达启动子。
138.实施方案15.根据实施方案14或任何前述实施方案的系统，其中所述至少一种微生物表达启动子包括光敏启动子、化学敏感启动子、温度敏感启动子、lac启动子、t7启动子、cspa启动子、λpl启动子、λcl启动子、连续生产启动子、psba启动子或其组合。
139.实施方案16.一种生产有机产物的方法，包括：
140.提供如在实施方案2或任何前述实施方案中所述的生物制造系统；
141.在足以在第一生物反应器培养容器中产生一定量的至少一种有机底物的条件下，在第一生物反应器培养容器中培养第一重组微生物；以及
142.在足以在所述第二生物反应器培养容器中产生一定量的所述至少一种有机产物的条件下，在所述第二生物反应器培养容器中培养所述第二重组微生物。
143.实施方案17.根据实施方案16或任何前述实施方案的方法，还包括：
144.通过所述挥发性气体出口从所述有机底物培养液中除去一定量的所述至少一种挥发性气体；
145.通过所述有机产物出口从所述有机产物培养液中除去一定量的所述至少一种有机产物；
146.如果所述碳源包括二氧化碳，则通过所述碳源入口将一定量的二氧化碳从二氧化碳源进料到所述有机底物培养液中；
147.将所述有机底物培养液和所述有机产物培养液的ph水平维持在约5.0至约8.5；
148.将所述有机底物培养液和所述有机产物培养液的温度维持在约25摄氏度至约70摄氏度；
149.如果第一生物反应器培养容器或第二生物反应器培养容器包括生物质收集端口，则通过所述生物质收集端口收集第一重组微生物或第二重组微生物生产的一定量的生物质；或者
150.基于所述第二生物反应器培养容器的总内部体积，将所述第二生物反应器培养容器中的挥发性气体的量维持在约10体积％至约1体积％或更少。
151.实施方案18.根据实施方案16或任何前述实施方案的方法，其中将非天然有机底物形成重组酶表达核苷酸序列或非天然有机产物表达核苷酸序列插入到微生物表达载体中，其中所述至少一种微生物表达载体包括至少一种微生物表达启动子，所述方法还包括：
末端bamhi识别位点(seq id no：4)。使用质粒构建体，将icd和gdh基因克隆到未修饰的细长聚球藻或细长聚球藻δglgc突变菌株(参见实施例2)。将转化1-3个拷贝的目标基因。通过pcr和测序证实icd和gch基因的克隆。通过sds-page、western印迹和乙烯生产试验，评价akg合成和定量。
171.根据akg生产的放大，评价培养物生长速率和培养条件。
172.实施例2.对蓝细菌进行工程化以分泌α-酮戊二酸
173.创建蓝细菌的糖原突变株改变了细菌产生更高浓度的酮酸(诸如αkg)的途径。
174.通过glgc基因(δglgc)的突变创建糖原缺陷型菌株，产生糖原突变体蓝细菌。氨苄青霉素抗性(ampr)基因作为gblock合成并整合到质粒构建体中。将质粒构建体转化到野生型蓝细菌(集胞藻属(synechocystis)、细长聚球藻2973、细长聚球藻2434)中。野生型glgc基因的一部分被ampr基因取代以产生突变菌株。通过在含有ampr的培养基中生长，随后进行pcr和测序来确认δglgc突变株。
175.实施例3.由二氧化碳生产蔗糖
176.蓝细菌(细长聚球藻，集胞藻属)经工程化以生产蔗糖作为下游生产乙烯的微生物生长的底物(大肠杆菌)。
177.细长聚球藻pcc 7942的工程化包括一个基因(cscb)的激活和一个基因(glgc)的缺失。工程菌产生的蔗糖产量为15-31.5磅/加仑生物反应器/月。
178.使用1-ha光生物反应器(640000升)、2％二氧化碳供应、300天生长季、每天8小时光照(65ue m2s-1
)和高达55公吨蔗糖/年的产量，进行蔗糖的大规模生产。
179.实施例4.将乙烯形成酶克隆到大肠杆菌中
180.因生长速率快，并且可获得用于遗传修饰的广泛工具，选择大肠杆菌用于乙烯生产。目前的质粒能够以非常高的产率生产乙烯形成酶。
181.efe的多核苷酸编码序列最初来自萨瓦氏假单胞菌菜豆致病变种(pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola)。选择efe蛋白并使基因适于在大肠杆菌中表达(genbank：kpb44727.l，seq id no：6)。合成编码efe酶的合成dna构建体并将其克隆到pet-30a(+)载体质粒中。相应的核苷酸序列是适于在大肠杆菌中表达的密码子(seq id no：5)，在c-末端含有任选的his标签，随后是终止密码子和hindiii位点。ndei位点用于在5-引物末端克隆，其中ndei位点含有atg起始密码子。用重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。
182.在laci基因存在下用iptg诱导型启动子(ptrc)激活氨苄青霉素盒；由laciq启动子(seq id no：13)调节laci基因。
183.大肠杆菌菌株bl21(de3)：倍增时间(20分钟)，除非搅拌，否则细胞下沉到生物反应器的底部。
184.·
理论最大细胞密度：50g细胞干重/l或1
×
10
13
活菌/l；在正常状态下：l
×
10
10
活菌/l。使用富培养基可提高细胞密度。
185.·
培养物ph：7.5-8.5
186.·
质粒：低(2-4)、中等(15-60)和高(50-500)拷贝数
187.·
用于蛋白生产的启动子/诱导物
188.·
lac启动子/乳糖：葡萄糖的存在会与乳糖竞争并对蛋白生产产生负面影响
189.·
t7启动子/iptg：目标蛋白代表总细胞蛋白的50％
190.·
cspa启动子/冷激：随着温度从37℃降低至15℃的蛋白表达
191.·
λpl-λci启动子/热激降温：随着温度从37℃升高至42℃的蛋白表达
192.·
psba启动子：无需诱导物
193.·
当前由大肠杆菌生产乙烯的产量：188nmol乙烯/od600/ml
194.在没有efe、低拷贝数构建体(prk290-ppsba-efe-flag)、中等拷贝数构建体(pbbrl-ppsba-efe-flag)或高拷贝数构建体(puc-ppsba-efe-flag)的情况下，进行efe(约44.5kda)_bl21(de3)的先导表达。sds-page和western印迹用于监测培养在luria肉汤、含0.2％葡萄糖的m9培养基或含0.2％葡萄糖的mops培养基中的各种拷贝数构建体(genscript usa公司，piscataway，nj)中的efe蛋白表达。对于印迹，测定α-groel表达作为阳性对照。图3a显示了在各种培养基中生长的培养物中由对照、低拷贝、中等拷贝和高拷贝构建体生产的efe蛋白的水平。
195.评估puc-ppsba-efe-flag mb1655构建体的乙烯产率，其生长在培养基中，不添加补充物，或向培养基中添加各种生长补充物(图3b)。
196.实施例5：在重组微生物中合成生产共轭烯烃、多烯和烷烃
197.共轭烯烃(包括二烯和多烯)和烷烃是在聚合物工业和生物技术中具有若干应用的重要商品。通过合成生物学可再生生产共轭烯烃和烷烃可以是生产基于石油的化学品的替代方法。短烷烃和烯烃是挥发性气体。这些挥发性气体的实例包括乙烯、乙烯、丙烯、丁烯、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或其组合。
198.生产烯烃和烷烃的天然方法极其缓慢。此处，我们应用遗传修饰方法来生产共轭烯烃和烷烃。为此，进行了参与烯烃和烷烃生物合成的关键酶途径的过表达。通过生物信息学研究定义了烯烃和烷烃生物合成的五个酶途径。游离脂肪酸或碳水化合物(糖)可用作这些反应的原料。将游离酸或其衍生物转化为烷烃或烯烃的四种酶途径包括：
199.1-脂肪醛的脱羧、2-脂肪酸的脱羧、3-头对头烃生物合成、4-聚酮化合物合酶(pks)途径。在这些途径中，脂肪醛的脱羧具有最高的效率。醛脱羧酶(ad)在该途径中发挥关键作用。醛脱羧酶将脂肪醛转化为烷烃和/或烯烃。其他关键酶包括脂肪丙烯酰基载体蛋白(acp)还原酶(aar)或脂肪酸还原酶(far)。
200.脂肪酸的脱羧(用于生产烯烃/烷烃)由三种关键酶调节，包括ole t、unda和undb。ole abcd基因对于头对头烃生物合成非常关键。
201.聚酮化合物(pks)途径的关键酶包括3-b-酮-酰基合酶(ks)、酰基转移酶(at)、酰基载体蛋白(acp)、b-酮还原酶(kr)、脱水酶(dh)、烯酰还原酶(er)。
202.为了生产烷烃和烯烃，对上述遗传途径进行模拟。大肠杆菌用作宿主微生物。使用puc19(高拷贝数)作为表达载体并在iptg诱导型启动子下制备基因构建体。通过在补充有氨苄青霉素、iptg和x-gal的琼脂培养基上的菌落生长、pcr和凝胶电泳，来确认每个基因的表达。气相谱法(gc)和hplc分别用于检测气相和液相中的产物。psba启动子是连续表达启动子。大肠杆菌bl21(de3)、dh5α或mg1655细胞系用作宿主。
203.通过在不同培养基(包括lb和mops)中培养大肠杆菌进行细胞培养适应。mops培养基的组成定义如下。
204.培养基mops
205.葡萄糖4g/l
206.iptg 0.5mm
207.精氨酸3mm
208.akg 2mm
209.诱导开始时诱导
210.下面请参见与烷烃和烯烃的生产有关的基因的列表以及它们的切除数目。
211.醛脱羧酶(ads)、脂肪丙烯酰基载体蛋白(acp)还原酶(aar)或脂肪酸还原酶(far)、酿酒酵母s288c四功能脂肪酸合酶亚基fas1(fas1)，部分mrna ncbi参考序列：nm_001179748.l(seq id no.14)
212.ole t、unda和undb。
213.ole abcd基因
214.3-b-酮-酰合酶(ks)、酰基转移酶(at)、拟南芥hxxxd型酰基转移酶家族蛋白(cer2)，mrna ncbi参考序列：nm_l 18584.3(seq id no.15)
215.酰基载体蛋白(acp)，红蝽细滴虫(leptomonas pyrrhocoris)推定线粒体酰基载体蛋白，推定(acp)mrna ncbi参考序列：xm_015809471.1(seq id no.16)
216.b-酮基还原酶(kr)、脱水酶(dh)、烯基还原酶(er)。
217.β-羟酰基-酰基载体蛋白脱水酶/异构酶[大肠杆菌菌株k-12亚株mg1655]ncbi参考序列：np_415474.1(seq id no.17)
[0218]
实施例6.实验室规模的实验程序。
[0219]
1.将产生特制设计的dna构建体，其编码重组烯烃、多烯、烷烃、多元醇、醇和有机酸生物合成途径的关键中间体。2.然后将仔细选择的光合第一重组微生物扩增用于有机底物的克隆和基因表达，所述有机底物包括α酮戊二酸、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘油、脂肪酸等。3.然后将仔细选择的第二重组微生物扩增用于有机产物形成酶的克隆和基因表达。4.然后进行微生物的遗传和代谢工程以连续生产有机产物。5.然后在光生物反应器和生物反应器系统中选择和扩增生物工程微生物。6.将调整生物反应器培养条件(包括co2浓度、光照时间和波长、温度和ph)。7.收集样品并通过hplc分析以测定有机产物合成。8.将改变基因工程微生物中的有机产物生产。9.有机产物生产过程将从试管规模放大到1升、10升和100升生物反应器。将在每个阶段以1：10的比例进行放大。
[0220]
附录
[0221]
seq id no：1-[0222]
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[0223]
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[0225]
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[0227]
seq id no:4-[0228]
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[0229]
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[0231]
seq id no.6-[0232]
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[0233]
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[0235]
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[0237]
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[0239]
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[0241]
seq id no.11：-[0242]
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[0243]
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[0245]
seq id no.13：-[0246]
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[0247]
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[0249]
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seq id no：16-[0252]
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[0253]
seq id no：17-[0254]
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技术特征：

1.一种用于生产有机产物的生物制造系统，包括：至少一个生物反应器培养容器；其中所述至少一个生物反应器培养容器含有有机底物培养液，其中所述有机底物培养液含有第一重组微生物，所述第一重组微生物具有改进的有机底物生产能力，其中所述第一重组微生物通过表达至少一种非天然有机底物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机底物形成重组酶，其中所述第一重组微生物能够利用碳源生产所述有机底物，其中所述第一重组微生物生产至少一种有机底物培养杂质，包括氧气、至少一种气相、液相和固相副产物；以及其中所述至少一个生物反应器培养容器含有有机产物培养液，其中所述有机产物培养液含有第二重组微生物，所述第二重组微生物具有改进的有机产物生产能力，其中所述第二重组微生物通过表达至少一种非天然有机产物形成酶核苷酸序列来表达至少一种有机产物形成酶，其中所述第二重组微生物能够利用所述有机底物生产所述至少一种有机产物。2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述至少一个生物反应器培养容器包括：第一生物反应器培养容器，所述第一生物反应器培养容器包括碳源入口和动力源；以及第二生物反应器培养容器，所述第二生物反应器培养容器包括流体流动路径和有机产物出口，所述流体流动路径连接至所述第一生物反应器培养容器和所述第二生物反应器培养容器并位于二者之间；其中所述第一生物反应器培养容器包括所述有机底物培养液，并且所述第二生物反应器培养容器包括所述有机产物培养液；或者其中所述第一生物反应器培养容器或所述第二生物反应器培养容器还包括生物质收集端口。3.根据权利要求2所述的系统，其中，所述碳源包括二氧化碳、一氧化碳、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、单糖、二糖、多糖、糖原、乙酸、脂肪酸或其组合；或者其中所述动力源包括太阳光、太阳能动力源、电动力源或其组合；或者其中所述挥发性气体包括氧气、甲烷或其组合；或者其中所述至少一种有机底物包括α-酮戊二酸、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘油、单糖、二糖、多糖、糖原、脂肪酸或其组合；或者其中所述至少一种有机产物包括醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、有机酸、丙酸、乙酸、醛、甲醛、长链脂肪酸、正烷烃、烃、乙烷、丙烯、丁烯、乙烷、丙烷、丁烷、c
2-c
20
烷烃、c
2-c
20
烯烃或其组合；或者其中所述第二生物反应器培养容器还包括碳源入口、挥发性气体出口、动力源或其组合。4.根据权利要求1所述的系统，其中，在一个生物反应器培养容器中组合所述有机底物培养液和所述有机产物培养液；或者通过过滤器分离所述有机底物培养液和所述有机产物培养物，其中所述过滤器包括约
0.2μm至约10μm或更大的孔径；或者其中所述系统还包括碳酸化单元、胺汽提塔、胺洗涤器、催化转化器、冷凝器、压缩机、苛性碱塔、干燥器或其组合。5.根据权利要求1所述的系统，其中，所述有机底物包括α-酮戊二酸(akg)，其中所述第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量大于缺乏非天然akg形成酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的akg形成酶的量；或者其中所述至少一种有机产物形成酶包括乙烯形成酶(efe)，并且所述第二重组微生物生产的efe的量大于缺乏非天然efe表达核苷酸序列的对照微生物生产的efe的量。6.根据权利要求5所述的系统，其中，所述第一重组微生物通过表达至少一种非天然akgp形成核苷酸序列来表达至少一种α-酮戊二酸通透酶蛋白(akgp)。7.根据权利要求5所述的系统，其中，所述至少一种akg形成酶包括异柠檬酸脱氢酶(icd)蛋白、谷氨酸脱氢酶(gdh)蛋白或其组合。8.根据权利要求7所述的系统，其中，所述第一重组微生物通过表达具有与seq id no：2至少95％同一性的核苷酸序列的非天然icd蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：1至少95％同一性的氨基酸序列的icd蛋白；或者所述第一重组微生物通过表达具有与seq id no：6至少95％同一性的核苷酸序列的非天然gdh蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：5至少95％同一性的氨基酸序列的gdh蛋白，或其组合；或者其中所述第二重组微生物通过表达具有与seq id no：8至少95％同一性的核苷酸序列的非天然efe蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：7至少95％同一性的氨基酸序列的efe蛋白。9.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第一重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：光合细菌、蓝细菌、聚球藻属、细长聚球藻、synechococcus leopoliensis、集胞藻属、鱼腥藻属、假单胞菌属、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻属和莱茵衣藻；或者其中所述第二重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：埃希氏菌属、大肠杆菌、土细菌、石蜡节杆菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞菌属、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、粘质沙雷氏菌、bacillus metatherium、沼泽假丝酵母、pichia inositovora、光滑球拟酵母、解脂假丝酵母、解脂耶氏酵母、酿酒酵母、曲霉菌属、枯草芽孢杆菌和乳杆菌属。10.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第一重组微生物包括缺乏葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶蛋白表达的δ-glgc突变微生物；或者其中所述第一重组微生物通过表达具有与seq id no：10至少95％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖合酶蛋白核苷酸序列来表达具有与seq id no：9至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖合酶蛋白；或者其中所述第一重组微生物通过表达具有与seq id no：12至少95％同一性的核苷酸序列的非天然蔗糖磷酸合酶核苷酸序列来表达具有与seq id no：11至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖磷酸合酶蛋白。11.根据权利要求5所述的系统，其中，所述第一重组微生物生产的至少一种akg形成酶的量比缺乏非天然akg形成酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的akg形成酶的量高约5％至约200％或更多；或者其中所述第二重组微生物生产的efe蛋白的量比缺乏所述非天然efe表达核苷酸序列
的对照微生物生产的efe蛋白的量高约5％至约200％或更多；或者其中所述第二重组微生物生产的efe蛋白的量为每升有机产物培养液约20克至约100克或更多。12.根据权利要求5所述的系统，其中，所述第二重组微生物包括大肠杆菌，所述第二重组微生物生产的efe蛋白的量为所述第二重组微生物的总细胞蛋白量的约30％至约80％或更多；或者所述第二重组微生物生产的所述至少一种有机产物的生产率为约1亿磅/年至约10亿磅/年或更高；或者其中所述第二重组微生物的细胞浓度为每毫升约107至约10
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个细胞，或每升有机产物培养液的细胞干重为每升约100克至约300克细胞干重。13.根据权利要求5所述的系统，其中，将所述非天然akg形成酶表达核苷酸序列或非天然efe表达核苷酸序列插入到微生物表达载体中，其中所述微生物表达载体包括细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、抗生素抗性系统、用于蛋白纯化和检测的辅助系统、crispr cas系统、噬菌体展示系统或其组合。14.根据权利要求5所述的系统，其中，所述efe表达核苷酸序列在所述微生物表达载体中具有约2至约500的拷贝数；或者其中所述微生物表达载体包括至少一个微生物表达启动子。15.根据权利要求14所述的系统，其中，所述至少一种微生物表达启动子包括光敏启动子、化学敏感启动子、温度敏感启动子、lac启动子、t7启动子、cspa启动子、λpl启动子、λcl启动子、连续生产启动子、psba启动子或其组合。16.一种生产有机产物的方法，包括：提供根据权利要求2所述的生物制造系统；在足以在所述第一生物反应器培养容器中生产一定量的所述至少一种有机底物的条件下，在所述第一生物反应器培养容器中培养所述第一重组微生物；以及在足以在所述第二生物反应器培养容器中生产一定量的所述至少一种有机产物的条件下，在所述第二生物反应器培养容器中培养所述第二重组微生物。17.根据权利要求16所述的方法，还包括：通过所述挥发性气体出口从所述有机底物培养液中除去一定量的所述至少一种挥发性气体；通过所述有机产物出口从所述有机产物培养液中除去一定量的所述至少一种有机产物；如果所述碳源包括二氧化碳，则通过所述碳源入口将一定量的二氧化碳从二氧化碳源进料到所述有机底物培养液中；将所述有机底物培养液和所述有机产物培养液的ph水平维持在约5.0至约8.5；将所述有机底物培养液和所述有机产物培养液的温度维持在约25摄氏度至约70摄氏度；如果所述第一生物反应器培养容器或所述第二生物反应器培养容器包括生物质收集端口，则通过所述生物质收集端口收集所述第一重组微生物或所述第二重组微生物生产的一定量的生物质；或者基于所述第二生物反应器培养容器的总内部体积，将所述第二生物反应器培养容器中
的挥发性气体的量维持在约10体积％至约1体积％或更少。18.根据权利要求16所述的方法，其中，将所述非天然有机底物形成重组酶表达核苷酸序列或所述非天然有机产物表达核苷酸序列插入到微生物表达载体中，其中至少一种微生物表达载体包括至少一种微生物表达启动子，所述方法还包括：通过向所述有机底物培养液或所述有机产物培养液中加入至少一种启动子诱导物来控制所述至少一种有机底物的量或所述至少一种有机产物的量。19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种微生物表达启动子包括光敏启动子、化学敏感启动子、温度敏感启动子、lac启动子、t7启动子、cspa启动子、λpl启动子、λcl启动子、连续生产启动子、psba启动子或其组合；并且所述至少一种启动子诱导物包括乳糖、木糖、iptg、冷激、热激或其组合。20.根据权利要求16所述的方法，还包括：如果所述至少一种有机底物培养杂质包括至少一种挥发性气体，则通过所述挥发性气体出口除去所述至少一种挥发性气体；或者回收以约1亿磅/年至约10亿磅/年或更高的速率生产的至少一种有机产物的量；或者其中生产的所述至少一种有机产物的量含有约1摩尔％或更少的挥发性气体的量。21.一种生产有机产物的方法，包括：提供根据权利要求1所述的生物修复系统，其中在一个生物反应器培养容器中组合所述有机底物培养液和所述有机产物培养液，其中将所述非天然有机底物形成重组酶表达核苷酸序列插入到第一微生物表达载体中，其中将所述非天然有机产物形成酶表达核苷酸序列插入到第二微生物表达载体中，其中所述第一微生物表达载体和所述第二微生物表达载体各自包括至少一个微生物表达启动子，提供连接至所述碳源入口的碳源；在足以在所述第一生物反应器培养容器中产生一定量的所述至少一种有机底物的条件下，在所述第一生物反应器培养容器中培养所述第一重组微生物；通过在第一时间点向所述有机底物培养液中添加至少一种启动子诱导物，来生产所述一定量的所述至少一种有机底物；在足以在所述第二生物反应器培养容器中产生一定量的所述至少一种有机产物的条件下，在所述第二生物反应器培养容器中培养所述第二重组微生物；以及通过在第二时间点向所述有机产物培养液中加入至少一种启动子诱导物，来生产所述一定量的至少一种有机产物。22.根据权利要求21所述的方法，还包括：在所述第二时间点之前，基于所述第二生物反应器培养容器的总内部体积，将所述第二生物反应器培养容器中的氧气的量降低至约10体积％至约1体积％或更少。

技术总结

本发明涉及用于生产有机产物的生物制造系统。本发明涉及具有改进的有机底物生产能力的重组微生物，并且涉及具有改进的有机产物生产能力的重组微生物。本文公开的系统和重组微生物的益处可包括能够分别生产有机产物和有机底物，该有机底物在其生产期间产生培养杂质。本发明涉及使用本文公开的生物制造系统和重组微生物来生产有机产物的方法。重组微生物来生产有机产物的方法。重组微生物来生产有机产物的方法。