一种hsa-mir-130b抑制的a549稳转
细胞株及其构建方法
技术领域
1.本发明涉及医学分子生物学技术领域，具体涉及一种hsa-mir-130b抑制的a549稳转
细胞株及其构建方法。
背景技术：
2.微核糖核酸(mirnas)是长度为20-25个核苷酸的小型非编码rna分子。这些分子通过与目标mrnas的3
′‑
非翻译区(3
′‑
utr)结合，通过翻译抑制或降解mrna来调节基因表达
1.。这些分子有可能调节各种细胞过程，如细胞生长、迁移、入侵、凋亡和血管生成。有研究发现，mir-130家族，包括mir-130b、mir-301a和mir-301b，在膀胱癌标本中高度表达，并通过促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭发挥致癌作用
2.。
3.近年来，在许多肿瘤中都发现mir-130b高表达，包括弥漫性大b细胞淋巴瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、肝癌、肺癌等。tian j等人发现mir-130b靶向pparγ，并通过vegf-a/bcl-2途径抑制肺癌细胞凋亡，mir-130b高表达与肺癌患者预后不良有关
3.。迄今为止，还未有文献报道应用慢病毒
转染技术构建人肺腺癌细胞构建稳转细胞株的方法。
4.肺癌(lung cancer，lc)是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球最致命的癌症，约占所有癌症死亡人数的18.4％。而非小细胞肺癌约占lc的85％，且在诊断时大约75％的患者处于中晚期，五年生存率非常低。临床上肺癌多以手术、化疗和放疗为主，近年来虽已取得显著进展，但是仍然存在生存率低和副作用强等缺陷。因此深入研究肺癌发生发展机制和寻有效方法是目前亟待解决的问题。
5.参照文献如下：
6.[1]ha m,kim vn.regulation of microrna biogenesis.nature reviews molecular cell biology(2014)15(8):509-24.epub 2014/07/17.doi:10.1038/nrm3838.pubmed pmid:25027649.
[0007]
[2]hirono t,jingushi k,nagata t,sato m,minami k,aoki m,et al.microrna-130b functions as an oncomirna in non-small cell lung cancer by targeting tissue inhibitor of metalloproteinase-2.scientific reports(2019)9(1):6956.epub 2019/05/08.doi:10.1038/s41598-019-43355-8.pubmed pmid:31061410；pubmed central p mcid:pmcpmc6502853.
[0008]
[3]tian j,hu l,li x,geng j,dai m,bai x.microrna-130b promotes lung cancer progression via pparγ/vegf-a/bcl-2-medi ated suppression of apoptosis.journal of experimental&clinical cancer research:cr(2016)35.doi:10.1186/s13046-016-0382-3.pubmed pmid:27364335；pubmed central pmcid:pmcpmc4929777.
技术实现要素：
[0009]
针对现有技术所存在的上述缺点，本发明公开了一种hsa-mir-130b抑制的a549稳
转细胞株及其构建方法，应用慢病毒载体系统转染人肺癌a549细胞，构建了hsa-mir-130b抑制的人肺癌a549稳转细胞株，并对其hsa-mir-130b表达进行了初步探讨，本发明的细胞模型可用于探究hsa-mir-130b与肿瘤的相关性及其机理，也可用于从hsa-mir-130b表达情况探索人肺癌发生发展的机制。
[0010]
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0011]
本发明的第一方面：提供了一种hsa-mir-130b抑制的a549稳转细胞株，是取mir130b序列进行6次串联得到anti-mir130b序列，在anti-mir130b基因片段插入plvx
‑‑
ires-neo-egfp载体，再转入a549细胞株，在细胞中表达anti-mir130b基因，经阳性细胞克隆筛选，a549细胞内源性mir-130b在a549细胞中高表达，a549细胞内源性mir-130b的表达量被抑制到10％，且90％以上的细胞表达绿荧光蛋白的稳转细胞株。
[0012]
本发明的第二方面：还提供了一种hsa-mir-130b抑制的a549稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0013]
(1)shrna序列设计：取mir130b序列进行6次串联，得到anti-mir130b序列；
[0014]
(2)hsa-mir-130b-3p抑制载体构建：以正常人血液基因组dn a为模板通过pcr扩增anti-mir130b基因，通过酶切反应将anti-mir130b克隆至真核表达载体plvx
‑‑
ires-neo-egfp中，所得的重组病毒质粒与另外三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂lipofectamine
tm 2000(invitrogen，cat.no.11668019)进行共转染293t细胞，转染后6h更换为完全
培养基，培养72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液进行浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液，并通过荧光显微镜或facs计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度；
[0015]
(3)慢病毒颗粒感染a549细胞：感染细胞前，进行细胞复苏及培养，用胰酶消化处于生长对数期的a549细胞，用无抗生素的培养基重悬细胞，并进行细胞计数；
[0016]
(4)hsa-mir-130b-3p抑制稳转细胞筛选和鉴定：a549细胞经慢病毒转染后，进行2周g418杀伤曲线检测，确定a549的g418筛选浓度为500μg/ml，挑取克隆，使用酶滴消化为单细胞并用96孔板进行单细胞接种，使用荧光观察gfp表达，挑选有荧光的孔，进行细胞扩增，筛选结束后通过荧光定量pcr检测anti-mir-130b，较a549细胞表达减少10倍，干扰效率达到预期，hsa-mir-130b-3p抑制稳转细胞株构建成功。
[0017]
进一步的，在步骤(1)中，所述的anti-mir130b序列如seq id no.1所示：
[0018]
seq id no.1：atgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactg。
[0019]
进一步的，在步骤(3)中，转染前一天对细胞株进行传代，使其融合度为30％-50％，转染时使用rpmi-1640培养基(hyclone，cat.no.sh30809.01b)。
[0020]
需要说明的是，本发明所用的人肺癌a549细胞株由广州莱德尔生物科技有限公司提供，a549细胞系是1972年由d.j.giard等人通过对一名58岁白人男性的腺癌肺组织的外植体培养而建立的，是人肺泡基底上皮细胞，在体外呈单层贴壁生长，可作为合适的转染宿主。
[0021]
有益效果
[0022]
采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
[0023]
本发明公开的hsa-mir-130b抑制的a549稳转细胞株，一方面，慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期表达，非常适合于基因抑制稳定细胞株的建立和基因干扰研究，另一方面，脂质体作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹dna，同样可以通过融合而进入细胞，使用脂质体将dna带入不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性，通过pmr-zsgreen1/pri-hsa-anti-mir-130b重组载体并进行慢病毒包装，感染a549细胞，进入a549细胞核内转录、表达，最终整合至a549细胞基因组，对a549细胞进行筛选、克隆。
附图说明
[0024]
图1为本发明a549-plvx-ires-neo-egfp稳定细胞株10
×
10拍照图；
[0025]
图2为本发明2种样品中hsa-mir-130b的表达水平的示意图。
具体实施方式
[0026]
本发明应用慢病毒载体系统转染人肺癌a549细胞，构建了hsa-mir-130b抑制的人肺癌a549稳转细胞株，并对其hsa-mir-130b表达进行了初步探讨，本细胞模型可用于探究hsa-mir-130b与肿瘤的相关性及其机理，可用于从hsa-mir-130b表达情况探索人肺癌发生发展的机制。
[0027]
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0028]
实施例1：shrna序列设计
[0029]
取mir130b序列进行6次串联，得到anti-mir130b序列，anti-m ir130b序列如seq id no.1所示：
[0030]
seq id no.1：atgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactgttcgatgccctttcatcattgcactg。
[0031]
实施例2：hsa-mir-130b-3p抑制载体构建
[0032]
以正常人血液基因组dna为模板通过pcr扩增anti-mir130b基因，通过酶切反应将anti-mir130b克隆至真核表达载体plvx
‑‑
ires-n eo-egfp中，所得的重组病毒质粒与另外三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂lipofectamine
tm 2000(invitrogen，cat.no.11668019)进行共转染293t细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液进行浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液，并通过荧光显微镜或fa cs计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。
[0033]
实施例3：a549细胞复苏
[0034]
用37℃水浴迅速解冻细胞，过程中注意要不断摇动，在冰冻管内残存一点点未融化时取出，放入超净台内，制备细胞悬液，将细胞转移至15ml离心管内，一滴一滴加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上，离心(800rpm,5min)，吸去上清，用1ml培养基重悬细胞；将细胞悬液分装入培养皿内，37℃含co2条件下培养，换液的时间由细胞沉降速度情况而定。
[0035]
实施例4：a549细胞培养
[0036]
取出细胞用pbs洗涤细胞一至二次，加入trypsin-edta溶液(1ml/25cm2，2ml/75cm2)，轻洗细胞皿底部；吸掉trypsin-edta溶液，放入37℃培养箱2-3分钟，轻拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用。以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混合均匀后，补足3n(n为传代瓶数)ml培养基(rpmi-1640)，依稀释比例转移至新的培养瓶中，放入co2培养箱(培养条件5％co2、饱和湿度、37℃)。
[0037]
实施例5：慢病毒颗粒感染a549细胞
[0038]
转染前一天对细胞株进行铺板(24孔板或96孔板)，使其融合度为50％左右，感染时使用rpmi-1640培养基(hyclone，cat.no.sh30809.01b)培养基。慢病毒浓缩液用培养基稀释成所需浓度，并加入polybrene(sigma公司产品，cat.no.h9268)，吸去细胞原有培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中(96孔板用100ul/孔，24孔板用200ul/孔，其它按面积类推)。轻摇匀，37℃培养6小时或过夜后换为细胞生长培养基(不含polybrene)，继续37℃培养。感染后第三天，根据情况，或收集细胞检测目的蛋白的表达，或观察gfp表达。
[0039]
实施例6：杀伤曲线检测
[0040]
感染病毒后，第三天加500μg/ml的g418培养基于每个孔，压力筛选一周，中间换一次液。一周后在倒置显微镜下观察，把单独每一个细胞用标记笔在细胞培养板上圈出。用0.25％胰酶消化画圈的细胞，每一团细胞收集到新的24孔板的一个孔培养。继续用500μg/ml的g418压力筛选一周，做亚克隆筛选。再用倒置显微镜下观察，挑选出正常生长细胞传代。用200μg/ml的g418维持一个月稳定培养。
[0041]
实施例7：挑选阳性克隆
[0042]
细胞培养在6cm或10cm培养板内，在酒精灯火焰上将玻璃吸管口端拉细，然后将尖细的末端烧结成细小的圆球状。先从四周轻轻推开克隆边缘，然后使整个克隆脱离培养板底部。挑取克隆后，在酶滴里(20ul左右，根据克隆大小而定)将其消化为单细胞。关于96孔板单细胞接种有两种方法，第一种方法，对于细胞颗粒比较大的将细胞做倍比稀释，然后用拉细的玻璃毛细管每孔放一个细胞即可。第二种方法，即将消化的单细胞做连续10稀释(根据情况也可以加上其他倍比稀释)，当达到每100ul培养基含1个细胞的浓度时，在每个孔内加100ul即可，这样每孔都会有1个细胞。荧光观察gfp表达(如图1所示)，挑选有荧光的孔，进行细胞扩增。
[0043]
实施例8：荧光定量pcr(qrt-pcr)检测
[0044]
①
取阳性克隆细胞样品进行总rna提取；
[0045]
②
总rna纯度和完整性检测；
[0046]
③
逆转录合成cdna；
[0047]
④
荧光定量pcr：内参片段:u6-94bp；目的片段：hsa-anti-mir-130b-3p-71bp(mimat0000691)；
[0048]
其中，设计引物包括hsa-anti-mir-130b-3p：
[0049]
上游引物为：f：5’acactccagctgggcagtgcaatgatgaaag；
[0050]
下游引物为：r：5’ctcaactggtgtcgtgga；
[0051]
内参片段:u6-94bp：
[0052]
上游引物为：u6-f：5’ctcgcttcggcagcaca；
[0053]
下游引物为：u6-r：5’aacgcttcacgaatttgcgt。
[0054]
反应体系的配制，反应参数等均按takarapremix ex taq
tm
ii(perfect real time)试剂盒说明进行，real time pcr的扩增曲线和融解曲线应用abi7500sequence detection system real-time pcr system的操作方法进行。表达水平效果，如图2所示。
[0055]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术特征：
1.一种hsa-mir-130b抑制的a549稳转细胞株，其特征在于，是取mir130b序列进行6次串联得到anti-mir130b序列，在anti-mir130b基因片段插入plvx
‑‑
ires-neo-egfp载体，再转入a549细胞株，在细胞中表达anti-mir130b基因，经阳性细胞克隆筛选，a549细胞内源性mir-130b在a549细胞中高表达。2.一种hsa-mir-130b抑制的a549稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)shrna序列设计：取mir130b序列进行6次串联，得到anti-mir130b序列；(2)hsa-mir-130b-3p抑制载体构建：以正常人血液基因组dna为模板通过pcr扩增anti-mir130b基因，通过酶切反应将anti-mir130b克隆至真核表达载体plvx
‑‑
ires-neo-egfp中，所得的重组病毒质粒与另外三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂lipofectamine
tm 2000进行共转染293t细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液进行浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液，并通过荧光显微镜或facs计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度；(3)慢病毒颗粒感染a549细胞：感染细胞前，进行细胞复苏及培养，用胰酶消化处于生长对数期的a549细胞，用无抗生素的培养基重悬细胞，并进行细胞计数；(4)hsa-mir-130b-3p抑制稳转细胞筛选和鉴定：a549细胞经慢病毒转染后，进行2周g418杀伤曲线检测，确定a549的g418筛选浓度为500μg/ml，挑取克隆，使用酶滴消化为单细胞并用96孔板进行单细胞接种，使用荧光观察gfp表达，挑选有荧光的孔，进行细胞扩增，筛选结束后通过荧光定量pcr检测anti-mir-130b，较a549细胞表达减少10倍，干扰效率达到预期，hsa-mir-130b-3p抑制稳转细胞株构建成功。3.根据权利要求2所述的一种hsa-mir-130b抑制的a549稳转细胞株的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的anti-mir130b序列如seq id no.1所示。4.根据权利要求2所述的一种hsa-mir-130b抑制的a549稳转细胞株的构建方法，其特征在于，在步骤(3)中，转染前一天对细胞株进行传代，使其融合度为30％-50％，转染时使用rpmi-1640培养基。
技术总结
本发明涉及医学分子生物学技术领域，具体涉及一种hsa-miR-130b抑制的A549稳转细胞株及其构建方法；本发明是取mir130b序列进行6次串联得到Anti-mir130b序列，在Anti-mir130b基因片段插入pLVX
技术研发人员：
陈龙 牛华涛 黄蓉 李科 曹红花 陈颖
受保护的技术使用者：
陈龙
技术研发日：
2022.05.05
技术公布日：
2022/11/17
