smarca1作为恶性
胆道肿瘤erbb
抑制剂敏感性的生物标志物及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤指smarca1作为恶性胆道肿瘤erbb抑制剂敏感性的生物标志物及应用。
背景技术：
2.恶性胆道肿瘤主要包括胆管癌和胆囊癌，是一类恶性程度非常高且生存预后较差的肿瘤。恶性胆道肿瘤发作部位解剖较为复杂，该类肿瘤早期诊断不易，并且进展极为迅速，通常患者在确诊时就已经处于癌症晚期。恶性胆道肿瘤存在较高的癌转移和扩散风险，手术彻底切除率不高，医治困难。
3.恶性胆道肿瘤医治方案主要有手术介入切除，放疗化疗和中医药学。但由于恶性胆道肿瘤易发生侵袭和淋巴结转移复发，恶性程度极高，传统的手段干预疗效不佳。随着精准医学理念和靶向用药干预的实施推广应用，给恶性胆道肿瘤患者带来生机。基于恶性胆道肿瘤基因表达谱不同，从分子水平可以对该类患者做精细分类、诊断和精准化用药干预，明显改善恶性胆道肿瘤患者预后。但是精准医疗靶向用药过程出现的耐药方面的问题一直困扰着恶性胆道肿瘤患者临床疗效，比如her2高表达恶性胆道肿瘤患者出现的erbb抑制剂耐药难题。
4.erbb家族成员主要包括egfr(her1、erbb1)，her2(erbb2)和her4(erbb4)等，其在多种癌症中存在突变。在癌症中常用的erbb抑制剂包括拉帕替尼(lapatinib)，达克替尼(dacomitinib)和沙普替尼(sapitinib)。拉帕替尼主要靶向her-1/her-2，其属于可逆性的小分子酪氨酸激酶抑制剂，可以有效抑制erbb1和erbb2，进而阻断癌
细胞增殖信号通路；达克替尼在临床晚期或转移性乳腺癌方面有着广泛应用。达克替尼属于第二代酪氨酸激酶抑制剂，其可以靶向作用egfr(her1)，her2和her4；对多个erbb家族蛋白具有较好抑制作用。达克替尼在临床局部iv期或转移性非小细胞肺癌患者方面具有较好的疗效。针对her2高表达恶性胆道肿瘤患者出现的erbb抑制剂耐药难题，目前尚未有可以查询的报道和解决方案。
技术实现要素：
5.本发明提供smarca1作为恶性胆道肿瘤erbb抑制剂敏感性的生物标志物及应用，本发明通过生物标志物smarca1基因可以有效预测her2高表达恶性胆道肿瘤面临的erbb抑制剂的敏感程度。smarca1是调控恶性胆道肿瘤pdc中her2高表达细胞株耐药的关键靶标。通过smarca1高表达可以有效逆转her2高表达恶性胆道肿瘤pdc出现的erbb抑制剂的耐药。
6.正常情况下，her2高表达相对her2低表达患者能够更好的响应erbb抑制剂，因为靶向药有明确的作用靶点。但是当her2高表达患者不能够有效响应erbb抑制剂药物时，即是本发明所提及的耐药情况。
7.本发明提供的技术方案如下：
8.本发明提供用于检测smarca1基因的mrna或所述smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段的试剂在制备用于评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂敏感性的试剂盒中的用途。
9.恶性胆道肿瘤细胞中或恶性胆道肿瘤患者体内，her2表达的酪氨酸激酶活性跨膜蛋白水平较高，而对于恶性胆道肿瘤细胞中或恶性胆道肿瘤患者对于erbb抑制剂呈现出不同的敏感性，而本发明则是通过评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂敏感性的试剂盒中的试剂来检测smarca1基因的mrna或所述smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段，通过检测转录的mrna水平或者smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段的水平来评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂敏感性。
10.优选的，所述smarca1基因的表达水平越高，所述恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂的敏感性越强。
11.在本发明中，smarca1基因高表达是指smarca1基因转录或翻译出的产物相对于正常表达水平增高，smarca1基因低表达是指smarca1基因转录或翻译出的产物相对于正常表达水平降低，因此可通过检测smarca1基因转录的mrna水平或smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段的水平来评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂敏感性的程度。判定其表达高低的方法有q-pcr法、rna-seq法、northern-blot法和原位杂交法等。
12.优选的，所述erbb抑制剂选自拉帕替尼、达克替尼和沙普替尼。
13.优选的，所述用于检测smarca1基因的mrna或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂包括与smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂，或与smarca1基因的mrna杂交或扩增smarca1基因的mrna的物质。
14.优选的，与所述smarca1基因的mrna杂交或扩增smarca1基因的mrna的物质为寡核苷酸引物或探针。
15.优选的，所述smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂为靶向所述蛋白或蛋白片段的抗体。
16.本发明提供一种用于评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂敏感性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含用于检测smarca1基因的mrna或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂。
17.本发明还提供smarca1基因的过表达调控元件在制备提高恶性胆道肿瘤患者对于erbb抑制剂敏感性的药物中的应用。基因过表达的原理为：通过人工构建的方式在目的基因上游加入调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。基因过表达的步骤是：1，构建克隆：将目的基因连接在特定的载体上，载体种类依据表达系统差异而不同；在载体上一般含有增强基因转录的启动子，不同系统中采用的启动子完全不同。2，将克隆导入表达细胞中进行表达。
18.本发明在制备erbb抑制剂敏感性的药物中时，通过smarca1基因的过表达调控元件提高smarca1基因的表达，从而使恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂敏感性程度增加，使erbb抑制剂能够有效抑制恶性胆道肿瘤细胞或者恶性胆道肿瘤患者体内的细胞的增殖。
19.本发明还提供smarca1基因在提高恶性胆道肿瘤药物erbb抑制剂的敏感性中的应
用。
20.本发明提供制备对erbb抑制剂敏感性不同的恶性胆道肿瘤细胞株或细胞系的方法，通过下调恶性胆道肿瘤细胞中的smarca1基因表达水平，制备对erbb抑制剂敏感性低的恶性胆道肿瘤细胞株或细胞系；通过上调恶性胆道肿瘤细胞中的smarca1基因表达水平，制备对erbb抑制剂敏感性高的恶性胆道肿瘤细胞株或细胞系。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.本发明中的生物标志物smarca1转录的mrna或其编码的蛋白或蛋白片段水平可以作为评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂耐药的关键分子，smarca1可以用作判断恶性胆道肿瘤细胞对erbb抑制剂耐药的生物学标志物，为恶性胆道肿瘤对erbb抑制剂耐药提供了准确检测和辅助判断的手段；通过干预关键分子来有效逆转恶性胆道肿瘤细胞对erbb抑制剂的耐药，高表达smarca1可用于解决恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂耐药的难题，且生物标志物smarca1在预测和恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂耐药方面具有巨大的发掘潜力，从而为更好的干预和恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤细胞对erbb抑制剂耐药提供候选的研究方向和切入点。
附图说明
23.下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对smarca1作为恶性胆道肿瘤erbb抑制剂敏感性的生物标志物及应用的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
24.图1a是本发明细胞模型为4494r和783r1分别针对拉帕替尼(lapatinib)，erbb抑制剂耐药性的结果示意图；
25.图1b是本发明细胞模型为4494r和783r1分别针对达克替尼(dacomitinib)erbb抑制剂耐药性的结果示意图；
26.图1c是本发明细胞模型为4494r和783r1分别针对沙普替尼(sapitinib)erbb抑制剂耐药性的结果示意图；
27.图2a是本发明494r细胞模型响应erbb抑制剂lapatinib和sapitinib的效果图；
28.图2b是发明783r1细胞模型响应erbb抑制剂lapatinib和sapitinib的效果图；
29.图3a是本发明将smarca1相对高表达的4494r进行smarca1敲低后的表达效果图；
30.图3b是本发明将smarca1相对低表达的783r1进行smarca1过表达后的表达效果图；
31.图3c是本发明4494r-10034细胞(对照组)与4494r-1051细胞经过erbb抑制剂lapatinib处理后的增殖效果图；
32.图3d是本发明783r1-1011细胞(对照组)与783r1-1044细胞经过erbb抑制剂lapatinib处理后的增殖效果图。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明，下述实施例是说明性的，
glo发光定量法)。通过进一步的四参数拟合曲线分析，计算出细胞增殖抑制一半时所需药物的浓度(ic50值)，从而对体外细胞活力进行评估。
42.参见图1a-图1c，为不同细胞模型分别针对三种erbb抑制剂耐药性的结果示意图。通过上述步骤的测定，发现恶性胆道肿瘤患者肿瘤组织来源的原代细胞783r1相对于4494r的ic50检测值有明显升高，即恶性胆道肿瘤患者肿瘤组织来源的原代细胞783r1对erbb抑制剂耐药。
43.为验证smarca1作为恶性胆道肿瘤响应erbb抑制剂敏感性的生物学标志物，使用体外平板克隆形成试验做进一步证实。通过对上述细胞活力测定，平板克隆形成实验选用恶性胆道肿瘤患者肿瘤组织来源的原代细胞783r1和4494r，作为验证的对象，其中4494r相对于783r1高表达smarca1。
44.具体的步骤如下：通过对体外细胞活力进行评估进行平板克隆，在具体实施时，还可以使用新型细胞活性检测方法、mtt法、cck8法、蛋白质抗体标记法、氧化应激测定方法等方法进行细胞增殖能力的评估，而本实施例中的平板克隆是将体外生长状态良好的恶性胆道肿瘤来源的pdc细胞进行6孔板铺板，控制每孔中细胞数目为2000个。第二天，观察细胞贴壁情况，确认良好后，配置不同浓度的erbb抑制剂拉帕替尼和沙普替尼，并加入到6孔板中。标准条件下继续培养，期间定期更换含有相应erbb抑制剂的正常细胞培液，定期观察克隆形成情况。2周后，吸弃培液后用pbs进行清洗，清洗完成后通过含有甲醇的固定液进行细胞固定，室温放置10分钟。吸弃细胞培液并用pbs进行清洗，之后加入含有浓度为0.1％的结晶紫的染液进行着，室温放置10分钟。待细胞着完全后，吸弃结晶紫染液，并用pbs进行清洗。晾干后，显微镜下观察、计数、拍照和定量分析。
45.参见图2a和2b，分别为494r和783r1细胞模型响应erbb抑制剂lapatinib和sapitinib效果图。实验数据分析结果显示：使用浓度分别为的0μm、0.1μm、0.5μm、2.5μm抑制剂lapatinib和sapitinib分别对4494r细胞和783r1进行处理，erbb抑制剂lapatinib和sapitinib可以显著抑制4494r细胞克隆形成能力，而783r1不能效响应lapatinib和sapitinib处理；同样的药物浓度处理下，4494r相比783r1能够更好的响应erbb抑制剂lapatinib和sapitinib效果。以上数据结果表明，smarca1高表达原代细胞在受erbb抑制剂处理情况下，克隆形成能力显著降低。而smarca1低表达原代细胞在分别受erbb抑制剂处理情况下，克隆形成能力未显著降低。这些研究结果提示smarca1有潜力成为评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或者恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂是否敏感的关键生物标志物，在本实施例中选用了lapatinib和sapitinib作为erbb抑制剂进行处理，本实施例不局限于这两种抑制剂处理后的结果。
46.为进一步验证smarca1作为恶性胆道肿瘤响应erbb抑制剂敏感性的生物标志物，在原代细胞模型4494r和783r1构建的稳定低表达或过表达原代细胞株中使用体外平板克隆形成试验做进一步证实。平板克隆实验选用恶性胆道肿瘤患者癌组织来源的原代细胞模型4494r和783r1。基于pdc细胞中smarca1表达情况，本发明方案将smarca1相对高表达的4494r进行smarca1敲低，将smarca1相对低表达的783r1进行smarca1过表达。参见图3a，为将smarca1相对高表达的4494r进行smarca1敲低后的表达效果图，其中4494r-1051是smarca1敲低后的细胞；图3b为将smarca1相对低表达的783r1进行smarca1过表达后的表达效果图，其中783r1-1044是smarca1过表达的细胞。
47.smarca1基因mrna及所述smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段定量分析步骤如下：将恶性胆道肿瘤来源细胞收集后进行细胞样品rna提取，细胞样品rna提取采用trizol标准提取法。具体如下，将恶性胆道肿瘤来源细胞收集后加入适当体积trizol(600ul-1ml)，充分混匀裂解后，加入1/5trizol体积的氯仿，混匀后，室温放置10分钟后再进行离心，转速为12000g,温度设置为4℃,时间为15分钟。转移上清至rnaase-free的1.5ml离心管。加入等上清液体积的异丙醇，混匀后室温静置10分钟。按照离心速度12000g，温度为4℃,离心时间为10分钟。小心吸弃上清，保留离心管管底白的rna沉淀物。75％乙醇清洗2遍，离心速度为12000r/min,离心温度为4℃,离心时间为10分钟。吸弃上清，室温放置3分钟，用depc水溶解。使用nanodrop测定rna浓度后，将rna样品存储于-80℃冰箱。
48.通过q-pcr检测上述提取的细胞样品rna的mrna水平变化，具体实施时，也可以采用northern-bot或原位杂交法，而本实施例中的q-pcr所需要的引物由thermo fisher scientific合成，具体引物序列信息如下：smarca1 forward primer：5
′‑
ccgctgctttgaaagagaacc-3
′
，smarca1 reverse primer：5
′‑
gcagtaacacaaacaagccca-3
′
；gapdh forwardprimer：
[0049]5′‑
catgagaagtatgacaacagcct-3
′
，gapdh reverse primer：5
′‑
agtccttccacgataccaaagt-3
′
。以细胞样品rna逆转录合成的cdna为模板，以gapdh作为内参，使用sybr green pcr mastermix试剂盒，扩增目的基因片段。反应条件如下：
[0050]
94℃20秒，
[0051]
60℃30秒
[0052]
72℃30秒，
[0053]
以上反应为一组，共计40个循环。
[0054]
待检测的smarca1基因以gapdh为内参，按照δδct法进行计算得出mrna相对量。然后校准对照组mrna表达水平为1，计算实验组目的基因mrna相对表达。
[0055]
通过对smarca1基因表达出来的蛋白或蛋白片段样本用ripa裂解液(p0013b,beyotime,shanghai,china)来裂解，冰上裂解30min后，12000g，4℃离心10min。裂解后样本的蛋白浓度用bcaproteinassay kit(thermo fisher scientific,usa)来检测，取20μg的总蛋白量用4％—20％sds-page gel(#4561095,bio-rad,usa)恒压电泳。电泳时，要保证加样速度，同时保证电泳液是新鲜配制且完全浸没至电泳槽对应刻度线。电泳运行电压及相应时间为80v，30分钟；待条带压齐后，调整至：120v，60分钟。电泳各条带分离完全且清晰后，停止电泳运行程序。然后，进行转膜操作：提前准备好电转液、pvdf膜和滤纸；按照“黑胶白膜”顺序将其小心放入电转装置，整个过程要避免起泡产生；电转全过程在冰上进行；转膜电流为200ma，转膜时间为90分钟。转膜结束后，小心取出含有目的条带的pvdf膜，放入含有5％脱脂牛奶的封闭盒中，在摇床上封闭1小时。抗体封闭过程一般转速较慢，摇床封闭，转速为35kd左右。封闭结束，剪取目的条带蛋白。1x tbst洗膜10分钟，重复三次。进而，进行一抗孵育，条件为4℃冰箱，摇床低速过夜。第二天，1x tbst洗膜，每次10分钟，重复三次。然后，进行二抗孵育，室温60分钟，孵育完成后1x tbst洗膜，每次10分钟，重复三次。最后加入发光液，进行目的条带显影拍照，定量分析。
[0056]
参见图3c，是本发明4494r-10034细胞(对照组)与4494r-1051细胞经过erbb抑制剂lapatinib处理后的增殖效果图；图3d是本发明783r1-1011细胞(对照组)与783r1-1044
细胞经过erbb抑制剂lapatinib处理后的增殖效果图。实验数据分析结果显示：相对于4494r-10034细胞(对照组)，erbb抑制剂lapatinib处理浓度为0.2μm时4494r-1051细胞(smarca1低表达组)克隆形成能力显著增强(参见图3c)；相对于783r1-1011细胞(对照组)，erbb抑制剂lapatinib处理浓度为6μm和12μm时可以显著抑制783r1-1044细胞(过表达组)克隆形成能力(参见图3d)。以上数据结果表明，smarca1表达下调导致恶性胆道肿瘤患者癌组织来源的原代细胞克隆形成能力显著增强，smarca1表达上调导致恶性胆道肿瘤患者癌组织来源的原代细胞克隆形成能力被显著抑制。因此，smarca1有潜力成为预测恶性胆道肿瘤对erbb抑制剂是否敏感的关键生物标志物。
[0057]
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.用于检测smarca1基因的mrna或所述smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段的试剂在制备用于评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂敏感性的试剂盒中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述smarca1基因的表达水平越高，所述恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂的敏感性越强。3.如权利要求1的用途，其特征在于：所述erbb抑制剂选自拉帕替尼、达克替尼和沙普替尼。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用于检测smarca1基因的mrna或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂包括与smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂，或与smarca1基因的mrna杂交或扩增smarca1基因的mrna的物质。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：与所述smarca1基因的mrna杂交或扩增smarca1基因的mrna的物质为寡核苷酸引物或探针。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述smarca1基因编码的蛋白或蛋白片段结合的结合剂为靶向所述蛋白或蛋白片段的抗体。7.一种用于评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对erbb抑制剂敏感性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含用于检测smarca1基因的mrna或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂。8.smarca1基因的过表达调控元件在制备提高恶性胆道肿瘤患者对于erbb抑制剂敏感性的药物中的应用。9.smarca1基因在提高恶性胆道肿瘤药物erbb抑制剂的敏感性中的应用。10.制备对erbb抑制剂敏感性不同的恶性胆道肿瘤细胞株或细胞系的方法，其特征在于：通过下调恶性胆道肿瘤细胞中的smarca1基因表达水平，制备对erbb抑制剂敏感性低的恶性胆道肿瘤细胞株或细胞系；通过上调恶性胆道肿瘤细胞中的smarca1基因表达水平，制备对erbb抑制剂敏感性高的恶性胆道肿瘤细胞株或细胞系。
技术总结
本发明提供SMARCA1基因或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段作为生物标志物用于评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对ErbB抑制剂的敏感性。本发明还提供了用于检测SMARCA1基因的mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的试剂在制备用于评价和/或预测恶性胆道肿瘤细胞或恶性胆道肿瘤患者对ErbB抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途。本发明还公开了通过干预SMARCA1基因的表达水平来有效调节恶性胆道肿瘤PDC或恶性胆道肿瘤患者对ErbB抑制剂的敏感性，提高SMARCA1基因的表达水平可有效改善HER2对ErbB抑制剂的耐药性。HER2对ErbB抑制剂的耐药性。HER2对ErbB抑制剂的耐药性。
技术研发人员：
冯飞灵 姜小清 张付闯 许晓雅 宋浩 张大东 肖念清
受保护的技术使用者：
上海思路迪医学检验所有限公司
技术研发日：
2021.05.14
技术公布日：
2022/11/15
