CD3融合蛋白及其用途的制作方法

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cd3融合蛋白及其用途
技术领域
1.本发明提供了用于t细胞、特别是tcr阴性t细胞的不依赖于tcr的激活(tcr independent activation)的工具和方法。特别地，本发明涉及包含cd3ε胞外域、cd3δ或cd3γ胞外域、跨膜结构域、和cd3ζ结构域的cd3融合蛋白。本发明还涉及编码这样的cd3融合蛋白的核酸分子、编码这样的cd3融合蛋白的t细胞以及用于医疗用途的所述t细胞。此外，描述了所述t细胞用于测试和表征外源效应分子的用途。

背景技术：

2.t淋巴细胞是适应性免疫应答的一部分，并且起源于位于骨髓中的造血干细胞。t淋巴细胞在其膜上表达独特的抗原结合受体t细胞受体(tcr)，其识别与主要组织相容性复合体(mhc)分子相关的抗原。
3.利用它们在免疫系统中的核心作用，t细胞通常提供针对病原体或恶性细胞的保护。每种t细胞表达单一形式的t细胞受体(tcr)——t细胞用来识别受感染或改变的细胞的结构。
4.免疫疗法的概念是基于适应性免疫应答对病原体和肿瘤细胞的识别和消除的特异性。成功的免疫疗法的目的是操纵或重新编程患者的免疫应答，以通过免疫系统特异性靶向肿瘤细胞进行破坏。
5.用于在癌症中重新编程免疫系统的方法包括主动免疫疗法，包括使用疫苗接种策略，包括dc疫苗，以及被动免疫疗法，包括应用肿瘤特异性抗体或基因工程淋巴细胞或过继转移特异性识别肿瘤抗原的t细胞。
6.过继性t细胞转移的原理是基于自体或同种异体肿瘤特异性t淋巴细胞的离体扩增，然后再输注到患者体内。在转移离体扩增的自体肿瘤浸润淋巴细胞(til)后，已观察到患有转移性黑素瘤的患者的癌症消退。这种方法的缺点是需要从每个患者中分离出预先存在的肿瘤反应性细胞，以及难以检测除黑素瘤以外的癌症的til。因此，开发了专注于从患者中分离的t细胞的基因修饰的其它方法。例如，这些基因工程t细胞可以通过用肿瘤特异性tcr的α和β链(即重组tcr)转导自体t细胞来产生。
7.wilde等人在2009年开发并在wo 2007/017201中描述的一种方法允许使用用编码taa和选定的同种异体mhc分子二者的rna物质共转染的自体dc分离同种异体限制性(allo-restricted)肽特异性t细胞。通过将自体t细胞与呈递自身肽/同种异体mhc复合体的dc共培养，可以获得识别自身抗原的高亲合力t细胞(wilde et al.,2009,dendritic cells pulsed with rna encoding allogeneic mhc and antigen induce t cells with superior antitumor activity and higher tcr functional avidity.blood,114(10),2131
–
9)。由于t细胞培养和t细胞克隆的扩增很费力并且需要反复进行多轮再刺激，因此在较早时间点分离tcr的cdna以便通过将它们引入受体pbl来对其进行表征是一个优势。这允许在将tcr用于患者的应用之前，就抗原特异性、亲合力和功能性对tcr进行表征。然而，这种方法是费力和费时的。此外，淋巴细胞的具有未知特异性的内源tcr可能与引入的
转基因/重组tcr形成异二聚体，导致再次未知特异性的交叉反应。
8.此外，鉴于已经在癌症过继性免疫疗法方面取得的实质性进展，需要提供一种决定性且快速的方法来测试和表征转基因tcr在过继性t细胞疗法中的应用潜力。
9.t细胞能够增殖以使其能够进一步繁殖是t细胞发育的先决条件。然而，t细胞的增殖尤其依赖于完整tcr的表达。因此，在缺乏功能性tcr的受体细胞中，需要允许受体t细胞在没有功能性tcr的情况下分裂的替代增殖信号。特别是，需要可以在体外和/或体内触发t细胞的增殖。
10.此外，当用作剂时，理想的是受体细胞可以不依赖于介导效果的受体而在体外或体内增殖。这允许受体细胞在其命运确定之前进行繁殖。此外，该方法允许在引入活性受体后在体外和/或体内均匀诱导增殖刺激。因此，各自携带不同的受体(例如tcr)的不同的细胞系仍然可以通过不依赖于介导效果的分子的增殖刺激以统一和标准化的方式刺激。
11.因此，需要直接的策略来培养t细胞，而不依赖于其内源tcr的刺激。

技术实现要素：

12.本发明提供了不依赖于tcr的t细胞繁殖策略。特别地，本发明提供了一种cd3融合蛋白，包含：
[0013]-cd3ε胞外域，
[0014]-cd3δ胞外域或cd3γ胞外域，
[0015]-跨膜结构域，和
[0016]-cd3ζ结构域。
[0017]
当在t细胞中表达时，这种cd3融合蛋白允许t细胞在cd3和cd28活化刺激时不依赖于tcr的激活。特别地，t细胞可以容易地被包含抗cd3和抗cd28抗体的组合物激活。因此，t细胞的不依赖于tcr的激活可以使用市售产品进行，例如上面固定有抗cd3和抗cd28抗体的微球珠粒。因此，使用诸如lcl细胞的饲养细胞的耗时的激活变得不必要。从而提供了用于t细胞的不依赖于tcr的激活的直接经济的方法。由于cd3融合蛋白在体外不识别任何特定的靶标，因此细胞测定中的背景激活是降低的。
[0018]
通常，所提及的跨膜结构域是cd28跨膜结构域。cd3胞外域可以通过铰链结构域与跨膜结构域连接。将cd3胞外域与跨膜结构域连接的铰链结构域可以选自由igg铰链结构域、cd28铰链结构域或cd8铰链结构域组成的组。
[0019]
将cd3胞外域与跨膜结构域连接的铰链结构域可以选自由igg铰链结构域、cd28铰链结构域或cd8铰链结构域组成的组。优选地，铰链结构域是cd8铰链结构域。
[0020]
融合蛋白还可以进一步包含允许共翻译定位至er膜的信号肽结构域。信号结构域优选地是cd8信号结构域。
[0021]
通常，cd3δ胞外域和cd3ε胞外域或cd3ε胞外域和cd3γ胞外域通过接头、优选非免疫原性接头连接。通常，接头包含至少5个氨基酸。氨基酸可以选自甘氨酸和丝氨酸残基的组。
[0022]
在一个优选实施方案中，cd3融合蛋白包含
[0023]-cd8信号肽结构域，
[0024]-cd3δ胞外域和cd3ε胞外域，
[0025]-cd8铰链结构域，
[0026]-cd28跨膜结构域，
[0027]-cd3ζ结构域。
[0028]
cd8信号肽可以包含为seq id no:1或与seq id no:1具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0029]
cd3δ胞外域可以包含为seq id no:2或与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0030]
cd3γ胞外域可以包含为seq id no:3或与seq id no:3具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0031]
cd3ε胞外域可以包含为seq id no:4或与seq id no:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0032]
连接cd3δ胞外域和cd3ε胞外域或连接cd3δ结构域和cd3γ胞外域的接头可以包含为seq id no:5或与seq id no:5具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0033]
cd8铰链结构域可以包含为seq id no:6或与seq id no:6具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0034]
跨膜结构域可以包含为seq id no:7或与seq id no:7具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0035]
cd3ζ结构域可以包含为seq id no:8或与seq id no:8具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0036]
在一个具体实施方案中，融合蛋白可以包含为seq id no:11或与seq id no:11具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0037]
通常，cd3融合蛋白从n末端到c末端方向的结构域顺序是cd3δ胞外域或cd3γ胞外域、接头、cd3ε胞外域、铰链结构域、cd28跨膜结构域和cd3ζ结构域。
[0038]
cd3融合蛋白还可以包含至少一种选自由cd28、ox40、icos和cd28组成的组的共刺激分子。
[0039]
本发明的另一方面涉及包含编码如本文所述的cd3融合蛋白的序列的核酸分子。
[0040]
核酸分子还可以包含编码荧光蛋白的序列。通常，在编码cd3融合蛋白的序列和编码荧光蛋白的序列之间存在核糖体跳跃序列。
[0041]
本发明的另一方面涉及如本文所述的cd3融合蛋白或如本文所述的核酸分子用于通过cd3刺激物和cd28刺激物激活tcr阴性t细胞的用途。优选地，cd3刺激物是活化的抗cd3抗体或其结合片段。
[0042]
cd28刺激物可以是与饲养细胞(例如淋巴母细胞系(lcl)细胞)共培养的形式或通过活化的抗cd28抗体。优选地，cd28刺激物是活化的抗cd28抗体或其结合片段。
[0043]
优选地，对于不依赖于tcr的激活，使用包含抗cd3和抗cd28抗体的组合物。抗cd3和抗cd28抗体可以被固定在合适的表面上，例如微球珠粒表面上、上或组织培养容器表面上。优选地，包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段的组合物被固定在微球珠粒上。
[0044]
因此，本方法是有利的，因为不需要用于刺激的细胞因子和饲养细胞，导致更便宜
和更有效的刺激。
[0045]
本发明的另一方面涉及一种用于t细胞的不依赖于tcr的激活的方法，包括以下步骤：
[0046]-表达如本文所述的cd3融合蛋白，
[0047]-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞。
[0048]
该方法还可以包括使内源tcr缺失的步骤。因此，该方法可以包括以下步骤：
[0049]-表达如本文所述的cd3融合蛋白，
[0050]-使内源tcr缺失，
[0051]-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞。
[0052]
本发明的另一方面涉及包含如本文所述的cd3融合蛋白的t细胞。
[0053]
技术人员理解t细胞是cd28阳性的，即t细胞在其细胞表面表达cd28。
[0054]
不依赖于tcr的t细胞激活的目标是在细胞培养期间保持没有表达的tcr的t细胞存活，即在细胞培养中扩增t细胞。在转基因/重组tcr或嵌合抗原受体表达后，t细胞引发细胞效应功能(即ifn-γ释放)和杀伤能力。因此，通常在本发明方法的一个阶段敲除tcr复合物或抑制其表达。因此，在一些实施方案中，包含如本文所述的cd3融合蛋白的t细胞不表达功能性tcr，或者换句话说，是tcr受体阴性的。
[0055]
包含如本文所述的cd3融合蛋白的此类tcr阴性t细胞已准备好用于引入能够激活受体细胞的免疫效应功能的外源受体。
[0056]
本发明还涉及用作药物的t细胞。特别地，本发明涉及用于癌症的t细胞。
附图说明
[0057]
图1：cd3融合蛋白的结构域结构。通过柔性(gly4ser)3接头分开的cd3δ胞外域和cd3ε胞外域的胞外单链片段(scfv)通过cd8铰链结构域与cd28跨膜结构域和cd3ζ信号传导结构域偶联。scfv在天然折叠时保留了α-cd3抗体okt-3的结合表位。cd3融合蛋白的编码序列前面是cd8信号肽，以确保共翻译定位到er(内质网)膜。通过p2a元件偶联的egfp可用于监测成功转导到细胞中。多克隆位点(mcs)允许容易克隆到不同的骨架载体中。
[0058]
图2：利用cd3融合蛋白的策略。用cd3融合蛋白转导的t细胞可以被α-cd3和α-cd28抗体激活，以在敲除后没有内源tcr的情况下递送刺激信号1和2。结合cd3融合蛋白的抗体可以在饲养细胞存在的情况下以可溶形式使用，或以与α-cd28抗体组合的珠粒结合(微球)形式使用。
[0059]
图3：tcr缺陷型jurkat-76细胞中cd3融合蛋白的表达。在转导后7天，通过用α-cd3抗体染和随后的流式细胞术分析，分析了转导的jurkat-76细胞的cd3融合蛋白表达和egfp表达。随后还在facs后2周通过α-cd3抗体染然后流式细胞术分析评估了产生的单细胞克隆(单细胞克隆)的cd3融合蛋白和egfp的表达。显示了2个代表性克隆的结果。转导的细胞以灰描绘。未转导的jurkat-76细胞用作阴性对照(黑线)。在直方图中，分别显示了cd3阳性细胞和egfp阳性细胞的百分比。
[0060]
图4：用cd3融合蛋白转导的tcr缺陷型t细胞克隆的x倍扩增。a)在每14天进行重复刺激的56天过程中，四个不同t细胞克隆(cd8+_001、cd8+_002、cd8+_003和cd8+_004)的x倍扩增。在每一轮扩增后确定细胞计数。携带其内源tcr的克隆cd4+_50用作对照(control)，
以比较增殖能力。b)使用不同激活条件的单个刺激周期内两个选定的t细胞克隆的x倍扩增。用包含lcl饲养细胞、il-2和okt-3抗体的完整刺激混合物(黑填充的矩形或黑填充的圆)或用分别缺乏okt-3(灰填充的矩形或灰填充的圆)或okt-3和lcl(未填充的矩形或未填充的圆)的刺激混合物刺激细胞。在第5天和第10天确定活细胞数。
[0061]
图5a、5b和5c：cd3融合蛋白转导的t细胞克隆在用酪氨酸酶特异性tcr t58或d115转导后的效应功能。图5a)用对各自的转基因tcrβ链具有特异性的α-cd3和α-tcr-vβ抗体和包含ymdgtmsqv(ymd)肽的四聚体对分别用t58或d115转导的分离的t细胞克隆(cd3融合蛋白001＝cd8+_001和cd3融合蛋白002＝cd8+_002)和pbl进行染。显示的数字代表为cd3阳性并且同时结合特异性trbv抗体或各自的四聚体的细胞的百分比。在通过facs富集后，随后通过流式细胞术分析细胞。未转导的cd8+_001和cd8+_002t细胞克隆和未处理的pbl用作各自的阴性对照(在直方图中以灰描绘)。图5b)来源于将转导的t细胞(cd3-融合蛋白001＝cd8+_001、cd3-融合蛋白002＝cd8+_002或pbl)与靶细胞以2:1的e:t比率孵育后20小时进行的杀伤测定中使用的相同共培养物的上清液的ifn-γelisa。阳性对照包括用750ng/ml pma和5ng/ml离子霉素(pma/iono)激活的效应细胞。在两个独立的实验中确定了转导的pbl的ifn-γ释放。未转导的细胞(w/o)用作阴性对照。靶细胞包括酪氨酸酶阳性(mel624.38)和酪氨酸酶阴性肿瘤细胞(a375)。图5c)作为响应于肽浓度降低的相对ifn-γ释放绘制的tcr转导的t细胞克隆(cd3-融合蛋白001＝cd8+_001、cd3-融合蛋白002＝cd8+_002)和pbl的功能性亲合力。向k562_a2_cd86细胞负载减少量的肽(10-4
至10-12
m)，并以2:1的固定e:t比率分别与表达t58或d115的t细胞共培养。20小时后通过ifn-γelisa测定ifn-γ释放，并通过将最大ifn-γ释放设置为参考值100％来计算相对ifn-γ释放。根据此参考计算较低的值。值来自生物学重复。虚线表示计算的ec50值。负载有10-4
m无关sllmwitqc肽(seq id no:25)的k652_a2_cd86细胞用作阴性对照。
[0062]
图6：在转基因酪氨酸酶特异性tcr t58(001_t58)或d115(001_d115)的转导后，分离的表达cd3融合蛋白的t细胞克隆的杀伤能力。使用zoom系统进行杀伤测定，以监测在2:1的e:t比率下经过72小时的nuclight red染料标记的酪氨酸酶阳性(mel624.38)和酪氨酸酶阴性(a375)肿瘤细胞的杀伤(细胞溶解)。在没有效应细胞的情况下，单独的各肿瘤细胞(未填充的圆)用作增殖对照。未转导的效应细胞(未填充的正方形，001)用作对照以估计在没有转基因tcr的情况下的背景杀伤。通过使用zoom软件2016b分析每种方法的一式四份来确定细胞计数/孔。
[0063]
图7：使用通过饲养细胞(lcl细胞)和α-cd3抗体或α-cd3/cd28抗体包被的微球珠粒的刺激或通过cd3/cd28 streptamer的刺激进行刺激，用cd3融合蛋白转导的t细胞克隆(001和002)的x倍扩增。显示了两个不同t细胞克隆(001和002)的x倍扩增。
具体实施方式
[0064]
在关于本发明的一些优选实施方案详细描述本发明之前，提供以下一般定义。
[0065]
如以下示例性描述的本发明可以适当地在没有本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实施。
[0066]
将关于特定实施方案并参考某些附图来描述本发明，但本发明不限于此，而仅由
权利要求书限制。
[0067]
在本说明书和权利要求书中使用术语“包括/包含”时，它不排除其它元素。为了本发明的目的，术语“由
……
组成”被认为是术语“包括/包含
……”
的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括至少一定数量的实施方案，这也应理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。
[0068]
当指单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“a”、“an”或“the”，则这包括该名词的复数形式，除非另有明确说明。
[0069]
技术术语按其常识使用。如果将特定含义传达给某些术语，则将在以下使用术语的上下文中给出术语的定义。
[0070]
本发明提供了不依赖于tcr的t细胞繁殖策略。特别地，本发明提供了一种cd3融合蛋白，包含：
[0071]-cd3ε胞外域，
[0072]-cd3δ胞外域或cd3γ胞外域，和
[0073]-跨膜结构域，和
[0074]-cd3ζ结构域。
[0075]
通常，跨膜结构域是cd28跨膜结构域。cd3ε胞外域和cd3δ胞外域或cd3γ胞外域可以通过铰链结构域与跨膜结构域连接。将cd3ε胞外域和cd3δ胞外域或cd3γ胞外域与跨膜结构域连接的铰链结构域可以选自由igg铰链结构域、cd28铰链结构域或cd8铰链结构域组成的组。
[0076]
根据权利要求1至3所述的cd3融合蛋白，其中将cd3ε胞外域和cd3δ胞外域或cd3γ胞外域与跨膜结构域连接的铰链结构域选自由igg铰链结构域、cd28铰链结构域或cd8铰链结构域组成的组。优选地，铰链结构域是cd8铰链结构域。
[0077]
融合蛋白还可以进一步包含允许共翻译定位至er膜的信号肽结构域。信号结构域优选地是cd8信号结构域。
[0078]
通常，cd3δ胞外域和cd3ε胞外域或cd3ε胞外域和cd3γ胞外域通过优选非免疫原性接头连接。通常，接头包含至少5个氨基酸。氨基酸可以选自甘氨酸和丝氨酸残基的组。
[0079]
在一个优选实施方案中，cd3融合蛋白包含
[0080]-cd8信号肽结构域，
[0081]-cd3δ胞外域和cd3ε胞外域，
[0082]-cd8铰链结构域，
[0083]-cd28跨膜结构域，
[0084]-cd3ζ结构域。
[0085]
cd8信号肽可以包含为seq id no:1或与seq id no:1具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0086]
cd3δ胞外域可以包含为seq id no:2或与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0087]
cd3γ胞外域可以包含为seq id no:3或与seq id no:3具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0088]
cd3ε胞外域可以包含为seq id no:4或与seq id no:4具有至少80％同一性的氨
database of immunoglobulin and t cell receptor nucleotide sequences,nucl.acids res.,34,d781-d784(2006).pmid:16381979；t cell receptor factsbook,lefranc and lefranc,academic press isbn 0-12-441352-8)。
[0103]
本发明的另一方面涉及包含编码如本文所述的cd3融合蛋白的序列的核酸分子。
[0104]
核酸分子还可以包含编码荧光蛋白的序列。通常，在编码cd3融合蛋白的序列和编码荧光蛋白的序列之间存在核糖体跳跃序列。
[0105]
下表指示了编码各肽序列的核苷酸序列：
[0106][0107]“核酸分子”通常是指dna或rna的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或从天然来源获得(例如，分离和/或纯化)的，其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸间键联(linkage)，例如氨基磷酸酯键联或硫代磷酸酯键联，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。优选地，本文所述的核酸是重组的。如本文所用，术语“重组”是指(i)通过将天然或合成的核酸区段与可在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或(ii)由上述(i)中所述的那些复制产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。可以基于化学合成和/或酶促连接反应使用本领域已知的或可商购的程序(例如来自genscript、thermo fisher等公司)构建核酸。参见，例如sambrook等人，可以使用天然存在的核苷酸或旨在提高分子的生物学稳定性或提高杂交后形成的双链体的物理稳定性的各种经修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成核酸。核酸可以包含编码重组tcr、多肽或蛋白质或其功能部分或功能变体中的任一种的任何核苷酸序列。
[0108]
本公开还提供了分离的或纯化的核酸的变体，其中变体核酸包含与编码本文所述的cd3融合蛋白的核苷酸序列具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
[0109]
本公开还提供了分离的或纯化的核酸，包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序
列。
[0110]
在严格条件下杂交的核苷酸序列优选在高度严格条件下杂交。“高度严格条件”意味着核苷酸序列与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)以比非特异性杂交更强烈可检测的量特异性杂交。高度严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸或仅包含少数分散错配的多核苷酸与恰好具有几个与核苷酸序列匹配的小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列区分开来的条件。这种互补的小区域比14-17个或更多碱基的全长互补区域更容易解链，并且高度严格的杂交使它们易于区分。相对高的严格条件包括例如低盐和/或高温条件，例如由约50-70℃的温度的约0.02-0.1m nacl或等效物提供。这种高度严格条件几乎不能容忍(如果有的话)核苷酸序列与模板或靶链之间的错配，并且特别适用于检测本文所述的任何tcr的表达。通常可以理解，通过添加增加量的甲酰胺可以使条件变得更加严格。
[0111]
如本文其它地方已经描述的，可以对编码tcr的核酸进行修饰。整个核酸序列中的有用修饰可以是密码子优化。可以进行导致表达的氨基酸序列内的保守置换的改变。这些变化可以在不影响功能的tcr链氨基酸序列的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在cdr3区域内进行添加和缺失。
[0112]
另一个实施方案涉及包含编码如本文所述的cd3融合蛋白的核酸的载体。
[0113]
载体优选是质粒、穿梭载体、噬菌体、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或用于基因的颗粒和/或载体。
[0114]“载体”是能够将核酸序列携带到合适的宿主细胞中的任何分子或组合物，在该宿主细胞中可以进行被编码多肽的合成。通常并且优选地，载体是已经使用本领域已知的重组dna技术进行工程改造以引入期望的核酸序列(例如本发明的核酸)的核酸。载体可以包含dna或rna和/或包括脂质体。载体可以是质粒、穿梭载体、噬菌体、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或用于基因的颗粒和/或载体。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或多种选择标记基因和本领域普通技术人员已知的其它遗传元件。载体优选是包含根据本发明的核酸的表达载体，所述核酸可操作地连接至允许所述核酸表达的序列。
[0115]
优选地，载体是表达载体。更优选地，载体是逆转录病毒，更具体地γ-逆转录病毒或慢病毒载体。
[0116]
本发明的另一方面涉及如本文所述的融合蛋白或如本文所述的核酸分子用于通过cd3刺激物和cd28刺激物激活tcr阴性t细胞的用途。优选地，cd3刺激物是活化的抗cd3抗体或其结合片段。
[0117]
cd28刺激物可以是淋巴母细胞系(lcl)细胞(其通常通过cd86和/或cd80激活cd28)或活化的抗cd28抗体。优选地，cd28刺激物是活化的抗cd28抗体。
[0118]
优选地，对于不依赖于tcr的激活，使用包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段(例如fab片段)的组合物。抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段可以被固定例如在珠粒上、在上或在组织培养容器表面上。优选地，包含抗cd3和抗cd28的组合物被固定在珠粒上。
[0119]
因此，结合片段可以包含完整全长抗体的部分，例如完全抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括fab、f(ab')2、id和fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv)；多特异性抗体片段，例如双特异性、三特异性和多特异性抗体(例如，双
抗体、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody))；微抗体(minibody)；螯合重组抗体；三体(tribody)或双体(bibody)；胞内抗体(intrabody)；纳米抗体(nanobody)；小型模块化免疫药物(small modular immunopharmaceuticals，smip)、结合结构域免疫球蛋白融合蛋白；骆驼化抗体；含vhh的抗体)；以及由抗体片段形成的任何其它多肽。技术人员知道抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。优选地，结合片段是fab片段。
[0120]
fab片段由vl、vh、cl和ch1结构域组成。f(ab')2片段包含在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段。fd是抗体单臂的vh和ch1结构域。fv片段是抗体单臂的vl和vh结构域。
[0121]
具有固定的抗cd3和抗cd28抗体的珠粒是可商购的，例如dynabeads(thermofisher scientific#11132d)。此外，可以使用例如(iba,#6-8901-000)。优选使用珠粒，即dynabeads(thermofisher scientific#11132d)。
[0122]
包含与多聚体结合的fab片段。多聚体是多聚化的后者是链霉亲和素的突变蛋白。
[0123]
因此，本方法是有利的，因为不需要用于刺激的细胞因子和饲养细胞，导致更便宜和更有效的刺激。
[0124]
本发明的另一方面涉及用于t细胞的不依赖于tcr的激活的方法，包括以下步骤：
[0125]-在t细胞中表达如本文所述的cd3融合蛋白，
[0126]-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞。
[0127]
该方法还可以包括使内源tcr缺失的步骤。因此，该方法可以包括以下步骤：
[0128]-在t细胞中表达如本文所述的cd3融合蛋白，
[0129]-使所述t细胞的内源tcr缺失，
[0130]-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞。
[0131]
在本发明的具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0132]-在t细胞中表达如本文所述的cd3融合蛋白，
[0133]-使所述t细胞的内源tcr缺失，
[0134]-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞，
[0135]-表达外源t细胞效应分子，
[0136]
任选地使d3融合蛋白缺失。
[0137]
使t细胞的内源tcr缺失和在t细胞中表达cd3融合蛋白的步骤可以基本上并行发生。这意味着这两个步骤之间的时间段，即使t细胞的内源tcr缺失与表达cd3融合蛋白之间或表达cd3融合蛋白与使t细胞的内源tcr缺失之间的时间小于12小时，优选小于6小时，更优选小于1小时，甚至更优选小于10分钟，甚至更优选小于5分钟，最优选小于1分钟。
[0138]
外源t细胞效应分子是外源抗原特异性受体，更特别地是能够激活t细胞的至少一种效应功能的外源抗原特异性受体，并且可以是tcr、嵌合抗原受体(car)或抗体偶联的t细胞受体。优选地，能够激活t细胞的至少一种效应功能的外源抗原特异性受体是tcr。
[0139]
效应分子可以稳定地或瞬时地引入t细胞中。稳定引入通常可以不受限制地通过稳定转染、病毒转导或通过允许在基因组的限定靶位点稳定引入的方法进行，例如安全港基因座(safe harbor loci)或睡美人(sleeping beauty)技术。瞬时引入通常通过瞬时转染，优选通过ivtrna的瞬时转染进行。在优选的实施方案中，特别是当基因工程t细胞用于
时，可以将效应分子(例如外源tcrα和tcrβ链)稳定地引入t细胞中。如果基因工程t细胞用于表征期望的tcr，则t细胞通常被瞬时转染，优选地用ivtrna瞬时转染。本发明的另一方面涉及一种t细胞，其中tcrα链和tcrβ链两者都已敲除，并且包含至少一种外源分子，其允许t细胞在体外不依赖于内源tcr增殖刺激而增殖。
[0140]
嵌合抗原受体(car)是模块化组装的人工受体，其赋予t细胞单克隆抗体的特异性。胞外结构域包含抗体来源的单链可变片段(scfv)，该片段由通过柔性接头分隔的免疫球蛋白轻链和重链组成。scfv通过间隔区和跨膜结构域与胞质信号传导结构域连接。car可以包含共刺激信号传导结构域，例如但不限于cd3ζ、cd27、cd28、cd137、dap10、fcr和/或ox40。
[0141]
不依赖tcr的t细胞激活的目标是在细胞培养过程中保持没有表达的tcr的t细胞存活，即在细胞培养中扩增t细胞。在转基因/重组tcr或嵌合抗原受体表达后，t细胞引发细胞效应功能(即ifn-γ释放)和杀伤能力。通常，在本发明方法的一个阶段敲除tcr复合物或抑制其表达。因此，在一些实施方案中，包含如本文所述的cd3融合蛋白的t细胞不表达功能性tcr，或者换句话说，是tcr受体阴性的。
[0142]
包含如本文所述的cd3融合蛋白的这种tcr阴性t细胞已准备好用于引入能够激活受体细胞的免疫效应功能的外源受体。
[0143]
在一些实施方案中，细胞是分离的或非天然存在的。
[0144]
在具体实施方案中，细胞可以包含编码如本文所述的cd3融合蛋白的核酸或包含所述核酸的载体。
[0145]
在细胞中，可以引入包含编码上述cd3融合蛋白的核酸序列的上述载体，或者可以引入编码所述cd3融合蛋白的ivtrna。该细胞可以是外周血淋巴细胞，例如t细胞。用慢病毒载体转导原代人t细胞描述于例如cribbs“simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human t cells”bmc biotechnol.2013；13:98中。
[0146]
术语“转染”和“转导”是可互换的，并且是指将外源核酸序列引入宿主细胞(例如真核宿主细胞)的过程。值得注意的是，核酸序列的引入或转移不限于上述方法，而是可以通过任何数量的手段来实现，包括电穿孔、显微注射、基因递送、脂转染、超感染和通过逆转录病毒或其它适合转导或转染的病毒进行的所述感染。
[0147]
在一些实施方案中，细胞是外周血淋巴细胞(pbl)或外周血单核细胞(pbmc)。细胞可以是自然杀伤细胞或t细胞。优选地，细胞是t细胞。t细胞可以是cd4+或cd8+ t细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞样记忆t细胞。
[0148]
干细胞样记忆t细胞(tscm)是cd8+ t细胞的分化程度较低的亚，其以自我更新和长期持续存在的能力为特征。一旦这些细胞在体内遇到它们的抗原，它们就会进一步分化成中枢记忆t细胞(tcm)、效应记忆t细胞(tem)和终末分化的效应记忆t细胞(temra)，其中一些tscm保持静止(flynn et al.,clinical&translational immunology(2014)。这些保留的tscm细胞显示出在体内建立持久免疫记忆的能力，因此被认为是用于过继t细胞疗法的重要t细胞亚(lugli et al.,nature protocols 8,33
–
42(2013)gattinoni et al.,nat.med.2011oct；17(10):1290
–
1297)。可以使用免疫磁性选择来将t细胞库限制为干细胞记忆t细胞亚型，参见(riddell et al.2014,cancer journal 20(2):141
–
44)。
[0149]
本发明还涉及可用作药物的t细胞。特别地，本发明涉及用于癌症或病毒性疾病的t细胞。
[0150]
tcr的缺失
[0151]
技术人员清楚的是，产生用于异二聚体细胞表面蛋白(例如tcr)的有效敲除策略对于受体细胞的产生是至关重要的。
[0152]
tcr两条链的双敲除可通过以下步骤实现：
[0153]
(a)敲除内源tcrα链，
[0154]
(b)选择缺乏功能性tcr的细胞，
[0155]
(c)敲除内源tcrβ链，
[0156]
(d)瞬时表达tcrα链，
[0157]
(e)选择缺乏功能性tcr的细胞；
[0158]
或替代地通过以下步骤实现：
[0159]
(a)敲除内源tcrβ链，
[0160]
(b)选择缺乏功能性tcr的细胞，
[0161]
(c)敲除内源tcrα链，
[0162]
(d)瞬时表达tcrβ链，
[0163]
(e)选择缺乏功能性tcr的细胞。
[0164]
在一个具体的实施方案中，tcrα链和tcrβ链的双敲除可以通过以下步骤实现：
[0165]
(a)敲除内源tcrβ链，
[0166]
(b)选择缺乏功能性tcr的细胞，
[0167]
(c)敲除内源tcrα链，
[0168]
(d)瞬时表达tcrβ链，
[0169]
(e)选择缺乏功能性tcr的细胞。
[0170]
技术人员理解，这种连续敲除tcrα链和tcrβ链的策略是优选的实施方案，并且因此不限制本技术的公开内容。替代地，也可以通过同时敲除tcrα链和tcrβ链来实现双敲除。
[0171]
在步骤(d)中，可以瞬时表达前tcrα链或成熟的α链。前tcrα链是在t细胞发育过程中表达的替代tcrα链(也称为不变ptα链)。术语“tcrα链的成熟形式”或“成熟tcrα链”是指通常发生在tcrα链基因排列之后的tcrα链序列，并且不包括前tcrα链。
[0172]
优选地，在步骤(d)“瞬时表达tcrα链”中，瞬时表达tcrα链的成熟形式。
[0173]
如本文所用，术语“受体细胞”是指由于内源tcrα和tcrβ链的双敲除而不表达功能性tcr并且能够不依赖于内源tcr增殖刺激而增殖的t细胞。
[0174]
(内源)tcrα和β链的敲除和双敲除可以例如通过包括锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)的分子克隆工具和通过成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，crispr)系统、辐射或化学诱变实现。术语双敲除意味着使编码tcrα链和tcrβ链二者的生产性重排等位基因无效，因此在双敲除细胞中既不存在tcrα链也不存在tcrβ链。这意味着双敲除的细胞不仅缺乏细胞表面上tcrα链和tcrβ链的功能表达，而且也意味着在细胞(例如er)中既不存在功能性内源tcrα链也不存在功能性内源tcrβ链。
[0175]
如本文所用，术语“功能性内源tcrα链”、“功能性tcrα链”和“功能性tcr链”意味着
功能性tcrα链能够与功能性tcrβ链配对，并且因此可以在细胞表面表达。因此，非功能性tcrα链是指不能与功能性tcrβ链配对并因此tcrα链不会在细胞表面表达的tcrα链。
[0176]
如本文所用，术语“功能性内源tcrβ链”、“功能性tcrβ链”和“功能性tcr链”意味着功能性tcrβ链能够与功能性tcrα链配对，并且因此可以在细胞表面表达。因此，非功能性tcrβ链是指不能与功能性tcrα链配对并因此tcrβ链不会在细胞表面表达的tcrβ链。
[0177]
zfn和talen由可调节的序列特异性dna结合结构域和非特异性dna切割结构域构成。通过引入定向dna双链断裂和刺激容易出错的非同源末端连接或同源定向修复机制，它们提供了用于基因操作的极好的工具。talen的dna结合结构域的特点是具有可变长度的中心重复结构域，而每个重复通常由34个氨基酸组成。dna结合结构域的特异性取决于每个重复中第12和13位的相邻高变氨基酸对，称为重复可变二残基(rvd)。序列特异性由简单代码控制，其中每个rvd独立指定dna中的一个碱基对。四种最常见的rvd优先与dna中的四种碱基之一缔合(ng＝t、hd＝c、ni＝a、nn＝g)。
[0178]
技术人员知道用于构建talen的不同方案。大多数策略都基于golden gate克隆，该克隆允许以有序方式同时组装多个dna片段(cermak et al.,2011,efficient design and assembly of custom talen and other tal effector-based constructs for dna targeting.nucleic acids research,39(12),e82；li et al.,2011,modularly assembled designer tal effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.nucleic acids research,39(14),6315
–
25；morbitzer et al.,2011,assembly of custom tale-type dna binding domains by modular cloning.nucleic acids research,39(13),5790
–
9,2011；sanjana,et al.2012；atranscription activator-like effector toolbox for genome engineering.nature protocols,7(1),171
–
92.)。该方法基于使用iis型限制酶，该酶使人们能够在单一反应混合物中进行消化和连接。iis型限制酶的特征是其在识别位点外部切割以产生独特的4bp突出端的特性。当用于克隆质粒时，通过独特的突出端和在正确组装片段时消除识别位点来确保正确的连接(engler et al.,2009golden gate shuffling:a one-pot dna shuffling method based on type iis restriction enzymes.plos one,4(5),e5553)。在本技术中，cermak等人(2011)的方法用于构建talen。商业试剂盒例如ez-tal
tm
(system bioscience)或fasttalen
tm
(sidansai biotechnology co.,ltd)以及由例如thermo fisher scientific或genecopoeia提供的商业服务可用于talen组装。
[0179]
在具体实施方案中，通过talen获得双敲除。tcrα链的talen靶区可以在可变av区段中或在恒定ac区段中。tcrβ链的talen靶区可以在可变bv区段中或在恒定bc区段中。在某些实施方案中，tcrα链的talen靶区在恒定ac区段中和/或其中tcrβ链的talen靶区在恒定bc区段中。在一些具体实施方案中，tcrα链的talen靶区在恒定ac区段中，并且tcrβ链的talen靶区在恒定bc区段中。
[0180]
crispr系统提供了zfn和talen的替代方案。在细菌中，crispr系统通过rna指导的dna切割提供对入侵外源dna的获得性免疫，当使用crispr系统时，需要将两种组分引入细胞中以进行基因组编辑：核酸酶(通常为cas9)和指导rna(grna)。grna由crispr rna(crrna)部分和反式激活crispr rna(tracrrna)部分组成。grna的5’末端的20个核苷酸将核酸酶(例如cas9)引导至特定的靶dna位点，该位点必须紧邻前间隔区相邻基序(pam)序列
的5’。crispr/cas9系统可用于改变多种物种中的基因，包括小鼠、大鼠和人类细胞系(参见例如sander and joung,2014,improving crispr-cas nuclease specificity using truncated guide rnas,nat biotechnol.2014mar；32(3):279
–
284)。
[0181]
tcrα链的靶区可以在恒定ac区段中选择和/或tcrβ链的靶区可以在恒定bc区段中选择。因此可以靶向任何特异性的任何tcrα链和/或可以靶向任何特异性的任何tcrβ链。因此，不必为具有不同特异性的不同tcr(例如具有不同可变链的tcr)选择不同的靶区。然而，如果在已知可变tcrα链类型和可变tcrβ链类型的特定细胞克隆中进行敲除，则tcrα链的靶区可以在可变av区段中选择和/或tcrβ链的靶区可以在可变bv区段中选择。
[0182]
替代地，可以通过辐射或化学诱变来实现敲除和/或双敲除。由于通过辐射或化学诱变的敲除不是靶向的，因此需要有效地选择经处理细胞的不在细胞表面表达功能性tcr的突变体。因此，本发明的方法，即基于细胞表面tcr的存在选择敲除细胞连同第二敲除后互补tcr链的瞬时表达在与随机突变策略组合时非常有用。
[0183]
此外，特别地如果在体内使用受体细胞，则可以对经辐射的细胞进行功能分析，以选择不受其它突变影响导致例如t细胞效应功能丧失的tcr敲除细胞。
[0184]
术语“内源tcrα和tcrβ链”是指t细胞固有的tcrα和β链。
[0185]
虽然tcrα链的缺失导致在缺失后7-10天成熟t细胞细胞表面的tcr丢失，但少量表面结合的tcrβ链在很长一段时间内表达(polic et al.,howαβt cells deal with induced tcrαablation.proceedings of the national academy of sciences,98(15),8744
–
8749.2001)。此外，当在单敲除突变体中引入外源tcr时，内源tcr链的存在会导致具有未知特异性的混合tcr异二聚体的表达(sommermeyer et al.,2006,designer t cells by t cell receptor replacement；european journal of immunology,36(11),3052
–
9)。因此，敲除两条tcr链具有防止细胞表面上内源tcr链的甚至低水平表达以及在外源tcr链表达后可能形成混合tcr异二聚体的优势。
[0186]
瞬时表达可以例如通过ivtrna的表达来进行。
[0187]
在优选的实施方案中，在步骤(d)中瞬时表达的tcrα链是tcrα链的成熟形式。
[0188]
技术人员从包含三种不同蛋白质的蛋白质复合物的敲除的该实例中理解，通过应用该原理，还可以产生包含超过3种蛋白质的表面蛋白质复合物的敲除。
[0189]
术语“在细胞表面缺乏tcr”是指在细胞表面不表达tcrα/tcrβ异二聚体的细胞。t细胞是否在细胞表面表达tcr可以例如基于与tcr复合物的蛋白质结合的抗体和流式细胞术来检测。
[0190]
本技术的一个实施方案涉及提供一种用于获得tcr受体细胞的方法。在所得的tcr受体细胞中，内源tcrα和tcrβ链都被敲除。
[0191]
术语“tcrα链的瞬时表达”、“成熟tcrα链的瞬时表达”或“tcrβ链的瞬时表达”是指tcrα链或tcrβ链的不稳定表达。在某些实施方案中，瞬时表达通过用ivtrna转染细胞而发生。在第二敲除步骤后tcrα链和tcrβ链的瞬时表达允许区分其中仍然存在两条tcr链之一的细胞，并且具有瞬时表达的tcr链不会在细胞中永久表达的优点。因此，当ivtrna的产物不再表达并且表达的产物被降解时，细胞就没有瞬时表达的tcr链。
[0192]
因此，在步骤(e)中选择在细胞表面缺乏tcr的细胞后，并且当ivtrna不再表达并且表达的产物被降解时，细胞既不表达功能性tcrα链也不表达tcrβ链。
[0193]
通常，cd3融合蛋白允许t细胞在体外在不依赖于内源tcr增殖刺激的情况下增殖至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代、至少50代、至少60代、至少70代、至少80代、至少90代、至少100代、至少120代、至少140代、至少160代、至少180代、至少200代、至少220代、至少240代、至少260代、至少280代、至少300代或更多代。这意味着细胞中的大部分分裂至少30次、至少40次、至少50次、至少60次、至少70次、至少80次、至少90次、至少100次、至少120次、至少140次、至少160次、至少180次、至少200次、至少220次、至少240次、至少260次、至少280次、至少300次或更多次。
[0194]
为了选择性地杀死细胞，例如如果患者经历负面副作用，则可以将包含例如胱天蛋白酶结构域的分子引入受体细胞，其在配体结合时诱导细胞凋亡。
[0195]
此外，为了避免患者对工程t细胞的免疫应答，可以敲除受体细胞中的免疫原性表面蛋白。因此，可以抑制细胞表面mhc i和mhc ii复合体分子的表达，例如通过敲除。例如，可以敲除受体细胞中的mhc i复合体，例如通过破坏β-2微球蛋白(b2m)的两个等位基因。
[0196]
t细胞可以表达cd8和/或cd4，或者可以缺乏cd8和cd4二者。
[0197]
在某些实施方案中，t细胞表达cd4。在另一些实施方案中，t细胞可以表达cd8。
[0198]“t细胞效应功能”尤其是指细胞因子和/或细胞毒性效应蛋白例如穿孔素、粒酶和粒溶素的释放，和/或fas-配体的表达。t细胞效应功能在janeway,immunobiology:the immune system in health and disease,2011中有详细描述。不同的t细胞类型表现出不同的t细胞效应功能。
[0199]
例如，th1型的cd4+细胞以及cd8+ t细胞都释放ifn-γ。因此，ifn-γ的释放是t细胞效应功能的常用测试。技术人员知道用于测量ifn-γ的不同技术，例如ifn-γ酶联免疫吸附测定(elisa)(bd opteia
tm
)。
[0200]
术语“外源”是指已通过任何基因工程技术转移到相应细胞中的分子。
[0201]
本技术还考虑了基因工程t细胞用于测试和表征外源效应分子、特别是外源tcr的用途。本技术考虑了在细胞毒性和细胞因子释放测定中研究tcr肽敏感性、多聚体结合特征和功能。可以将需要表征的感兴趣的tcr引入受体细胞。由此产生的携带感兴趣的tcr的基因工程t细胞可用于测试和表征外源tcr。
[0202]
在一个具体实施方案中，本发明的t细胞具有正常核型。特别是当受体细胞用于时，优选地受体细胞具有正常核型并且不是改变为具有异常核型，因为具有异常核型的细胞很可能发展为癌细胞。术语“正常核型”是指缺乏例如利用染体显带分析或荧光原位杂交(fish)可检测到的任何可见核型异常的那些细胞的状态。
[0203]
实施例
[0204]
通过借助α-cd3抗体和egfp表达检测如图1中所述的cd3融合蛋白(图3)，在tcr缺陷型jurkat-76细胞中验证了构建体的正确表达和折叠。在转导后7天，通过用抗cd3抗体染和随后的流式细胞术分析，分析了经转导的jurkat-76细胞的cd3融合蛋白表达和egfp表达。在facs后2周，再次通过抗cd3抗体染和随后的流式细胞术分析评估产生的单细胞克隆的cd3融合蛋白和egfp表达。产生的单细胞克隆表明，cd3嵌合体的表达水平在不同的克隆中可能有所不同。
[0205]
产生了来自两个供体的tcr阴性t细胞，并同时用cd3融合蛋白转导，以允许细胞通过α-cd3抗体刺激扩增。分离的克隆cd8
+
_001和cd8
+
_002在体外扩增并显示出不依赖于内源
tcr的非常高的增殖率(图4a)。这些t细胞克隆的高扩增率只能在抗cd3抗体(okt-3)的存在下实现，这表明α-cd3抗体与cd3-嵌合体构建体的结合导致这些tcr阴性t细胞激活(图4b)。
[0206]
使用cd3融合蛋白产生的通用受体细胞允许测试转基因tcr(t58、d115，如以下中公开的：wo2010058023a1和wilde,s.,d.sommermeyer,b.frankenberger,m.schiemann,s.milosevic,s.spranger,h.pohla,w.uckert,d.h.busch,and d.j.schendel.2009.dendritic cells pulsed with rna encoding allogeneic mhc and antigen induce t cells with superior antitumor activity and higher tcr functional avidity.blood 114:2131
–
2139)在没有细胞的任何背景激活的情况下的表达、特异性、功能性亲合力(图5a-5c)和杀伤能力(图6)。用对各自的转基因tcrβ链具有特异性的α-cd3和α-tcr-vβ抗体(trbv抗体，tcr-vβ23、t58、af23、igg1小鼠pe；tcr-vβ8、d115、56c5.2、igg2a小鼠，两者均来自beckman coulter)和包含ymdgtmsqv(ymd,来源:immunaware,copenhagen,denmark)肽的四聚体对分别用t58或d115转导的分离的t细胞克隆(cd8+_001和cd8+_002)和pbl进行染(图5a)。在通过facs富集后，随后通过流式细胞术分析细胞。未转导的cd8+_001和cd8+_002t细胞克隆和未处理的pbl用作各自的阴性对照。通过elisa测量来源于将转导的t细胞(cd8+_001、cd8+_002或pbl)与靶细胞以2:1的e:t比率孵育后20小时进行的杀伤测定中使用的相同共培养物的上清液的ifn-γ。阳性对照包括用750ng/ml pma和5ng/ml离子霉素(pma/iono)激活的效应细胞。在两个独立的实验中确定了经转导的pbl的ifn-γ释放。未转导的细胞(w/o)用作阴性对照。靶细胞包括酪氨酸酶阳性(mel624.38)和酪氨酸酶阴性肿瘤细胞(a273)(图5b)。向k562_a2_cd86细胞负载减少量的肽(10-4
至10-12
m)，并以2:1的固定e:t比率分别与表达t58或d115的t细胞共培养。20小时后通过ifn-γelisa测定ifn-γ释放，并通过将最大ifn-γ释放设置为参考值100％来计算相对ifn-γ释放。根据此参考计算较低的值。tcr转导的t细胞克隆(cd8+_001、cd8+_002)和pbl的功能性亲合力在图5c)中作为响应于肽浓度降低的相对ifn-γ释放绘制。值来自生物学重复。
[0207]
在比较实验中，分离的克隆cd8
+
_001和cd8
+
_002在体外用饲养(lcl)细胞和okt-3抗体(指示为标准)、cd3/cd28(iba,#6-8901-000)或用具有固定在其上的α-cd3和α-cd28抗体的微球珠粒(thermo fisher scientific,#11132d)的激活下扩增。使细胞扩增2至3天。在15天的一段时间里刺激细胞。在第15天，确定细胞数目。使用zoom系统进行杀伤测定，以监测在2:1的e:t比率下经过72小时用nuclight red染料标记的酪氨酸酶阳性(mel624.38)和阴性(a375)肿瘤细胞的杀伤(细胞溶解)。在没有效应细胞的情况下的单独的各肿瘤细胞用作增殖对照。未转导的效应细胞用作对照以估计在没有转基因tcr的情况下的背景杀伤。通过使用zoom软件2016b分析每种方法的一式四份来确定细胞计数/孔。尽管缺少饲养细胞的另外共刺激分子，但使用或珠粒的刺激允许甚至是在可比较或更好的水平的显著激活。
[0208]
项目
[0209]
项目1.一种cd3融合蛋白，包含：
[0210]-cd3ε胞外域，
[0211]-cd3δ胞外域或cd3γ胞外域，
[0212]-跨膜结构域，和
[0213]-cd3ζ结构域。
[0214]
项目2.根据项目1所述的cd3融合蛋白，其中所述跨膜结构域是cd28跨膜结构域。
[0215]
项目3.根据项1或2所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3异二聚体通过铰链结构域与所述跨膜结构域连接。
[0216]
项目4.根据项目1至3所述的cd3融合蛋白，其中将所述cd3ε胞外域和cd3δ胞外域或cd3γ胞外域与所述跨膜结构域连接的铰链结构域选自由igg铰链结构域、cd28铰链结构域或cd8铰链结构域组成的组。
[0217]
项目5.根据项目4所述的cd3融合蛋白，其中所述铰链结构域是cd8铰链结构域。
[0218]
项目6.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含cd8信号肽结构域。
[0219]
项目7.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3δ胞外域和所述cd3ε胞外域或所述cd3ε胞外域和所述cd3γ胞外域通过包含至少5个氨基酸的接头连接。
[0220]
项目8.根据项目7所述cd3融合蛋白，其中所述氨基酸选自甘氨酸和丝氨酸残基的组。
[0221]
项目9.根据项目8所述的cd3融合蛋白，其中当其中表达所述融合蛋白的tcr阴性t细胞与cd3激活刺激物和cd28激活刺激物接触时，所述融合蛋白能够激活所述tcr阴性t细胞。
[0222]
项目10.根据项目9所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3激活刺激物是抗cd3抗体。
[0223]
项目11.根据项目9或10所述的cd3融合蛋白，其中所述cd28激活刺激物是抗cd28抗体。
[0224]
项目12.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述融合蛋白包含
[0225]-cd8信号肽结构域，
[0226]-cd3δ胞外域和cd3ε胞外域，
[0227]-cd8铰链结构域，
[0228]-cd28跨膜结构域，
[0229]-cd3ζ结构域。
[0230]
项目13.根据前述项目6至12所述的cd3融合蛋白，其中所述cd8信号肽包含与seq id no:1具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0231]
项目14.根据前述项目6至12所述的cd3融合蛋白，其中所述cd8信号肽包含为seq id no:1的氨基酸序列。
[0232]
项目15.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3δ胞外域包含与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0233]
项目16.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3δ胞外域包含为seq id no:2的氨基酸序列。
[0234]
项目17.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3γ胞外域包含与seq id no:3具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0235]
项目18.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3γ胞外域包含为seq id no:3的氨基酸序列。
[0236]
项目19.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3ε胞外域包含与seq id no:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0237]
项目20.根据项目3至14所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3ε胞外域包含为seq id no:4的氨基酸序列。
[0238]
项目21.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中连接cd3δ结构域和cd3ε结构域或连接cd3δ结构域和cd3γ结构域的接头包含与seq id no:5具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0239]
项目22.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中连接cd3δ胞外域和cd3ε胞外域或连接cd3δ胞外域和cd3γ胞外域的接头包含为seq id no:5的氨基酸序列。
[0240]
项目23.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd8铰链结构域包含与seq id no:6具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0241]
项目24.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd8铰链结构域包含为seq id no:6的氨基酸序列。
[0242]
项目25.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述跨膜结构域包含与seq id no:7具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0243]
项目26.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述跨膜结构域包含为seq id no:7的氨基酸序列。
[0244]
项目27.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3ζ结构域包含与seq id no:8具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0245]
项目28.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3ζ结构域包含为seq id no:8的氨基酸序列。
[0246]
项目29.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与seq id no:11具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0247]
项目30.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述融合蛋白包含为seq id no:11的氨基酸序列。
[0248]
项目31.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述融合蛋白从n末端到c末端方向的结构域顺序是cd3δ胞外域或cd3γ胞外域、接头、cd3ε胞外域、铰链结构域、cd28跨膜结构域、cd3ζ结构域。
[0249]
项目32.根据前述项目所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3融合蛋白还包含选自由cd28、ox40、icos和cd28组成的组的共刺激分子。
[0250]
项目33.包含编码项目1至32所述融合蛋白的序列的核酸分子。
[0251]
项目34.项目33所述的核酸分子，其中所述载体还包含编码荧光蛋白的序列。
[0252]
项目35.项目34所述的核酸分子，其中在编码权利要求1至32所述的cd3融合蛋白的序列和编码荧光蛋白的序列之间是核糖体跳跃序列。
[0253]
项目36.根据项目1至32所述的融合蛋白或根据项目33至35所述的核酸分子用于通过cd3刺激物和cd28刺激物激活tcr阴性t细胞的用途。
[0254]
项目37.根据项目36所述的用途，其中所述cd3刺激物是活化的抗cd3抗体或其结合片段。
[0255]
项目38.根据项目36至37所述的用途，其中所述cd28刺激物是活化的抗cd28抗体
或其结合片段。
[0256]
项目39.用于t细胞的不依赖于tcr的激活的方法，包括以下步骤：
[0257]-表达项目1至32所述的融合蛋白，
[0258]-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞。
[0259]
项目40.根据项目39所述的方法，包括以下步骤：
[0260]-表达项目1至32所述的融合蛋白，
[0261]-使tcr缺失，
[0262]-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞。
[0263]
项目41.根据项目38所述的用途和根据项目39或40所述的方法，其中所述cd3刺激物和所述cd28刺激物是包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段的组合物。
[0264]
项目42.根据项目38所述的用途和根据项目41所述的方法，其中所述包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段的组合物是固定的。
[0265]
项目43.根据项目38所述的用途和根据项目42所述的方法，其中所述包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段的组合物被固定在珠粒上或组织培养容器表面上。
[0266]
项目44.根据项目38所述的用途和根据项目43所述的方法，其中所述包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段的组合物被固定在珠粒上。
[0267]
项目45.根据项目38所述的用途和根据项目39至44所述的方法，其中所述tcr阴性t细胞的激活不需要细胞因子。
[0268]
项目46.根据实施方案38所述的用途和根据实施实施方案39至45中任一项所述的方法，其中所述t细胞是cd28阳性的。
[0269]
项目47.根据项目38所述的用途和根据项目39至46中任一项所述的方法，其中所述tcr复合物被敲除或其表达被抑制。
[0270]
项目48.包含项目1至32所述的融合蛋白的t细胞。
[0271]
项目49.根据项目48所述的t细胞，其中所述t细胞缺乏内源tcr。
[0272]
项目50.根据项目48和49中任一项所述的t细胞，用于作为药物使用。
[0273]
项目51.根据项目48和49中任一项所述的t细胞，用于在癌症或病毒性疾病中使用。
[0274]
项目52.根据权利要求48和49所述的t细胞用于测试和表征外源效应分子的用途。
[0275]
项目53.根据项目52所述的用途，其中所述效应分子是tcr。

技术特征：

1.一种cd3融合蛋白，包含：-cd3ε胞外域，-cd3δ胞外域或cd3γ胞外域，-跨膜结构域，和-cd3ζ结构域。2.根据前述权利要求所述的cd3融合蛋白，其中所述融合蛋白包含-cd8信号肽结构域，-包含cd3δ胞外域和cd3ε胞外域的cd3异二聚体，-cd8铰链结构域，-cd28跨膜结构域，-cd3ζ结构域。3.根据前述权利要求所述的cd3融合蛋白，其中所述cd3δ胞外域包含为seq id no:2的氨基酸序列，其中所述cd3ε胞外域包含为seq id no:4的氨基酸序列，并且其中所述cd3ζ结构域包含为seq id no:8的氨基酸序列。4.包含编码权利要求1至3中所述的融合蛋白的序列的核酸分子。5.用于t细胞的不依赖于tcr的激活的方法，包括以下步骤：-在所述t细胞中表达权利要求1至3所述的融合蛋白，-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞。6.根据权利要求6所述的方法，包括以下步骤：-在所述t细胞中表达权利要求1至3所述的融合蛋白，-使所述t细胞的内源tcr缺失，-用cd3刺激物和cd28刺激物刺激所述t细胞。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述cd3刺激物是活化的抗cd3抗体或其结合片段。8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述cd28刺激物是活化的抗cd28抗体或其结合片段。9.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述cd3刺激物和所述cd28刺激物是包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段的组合物。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段的组合物是固定的。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述包含抗cd3抗体或其结合片段和抗cd28抗体或其结合片段的组合物被固定在珠粒上。12.包含权利要求1至3所述的融合蛋白的t细胞。13.根据权利要求12所述的t细胞，其中所述t细胞缺乏内源tcr。14.根据权利要求12和13中任一项所述的t细胞，用于作为药物使用。15.根据权利要求12和13中任一项所述的t细胞，用于在癌症或病毒性疾病中使用。16.根据权利要求12和13所述的t细胞用于测试和表征外源效应分子的用途。

技术总结

本发明提供了用于T细胞、特别是TCR阴性T细胞的不依赖于TCR的激活的工具和方法。特别地，本发明涉及包含CD3异二聚体并且包含跨膜结构域和CD3ζ结构域的CD3融合蛋白。本发明还涉及编码这样的CD3融合蛋白的核酸分子、编码这样的CD3融合蛋白的T细胞以及用于医疗用途的所述T细胞。此外，描述了所述T细胞用于测试和表征外源效应分子的用途。和表征外源效应分子的用途。