液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法与流程

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1.本发明涉及盐酸雷尼替丁中基因毒性杂质的测定，特别是液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法。

背景技术：

2.盐酸雷尼替丁为强效的h2受体阻滞剂，能竞争性阻滞组胺与h2受体结合，抑制胃酸分泌。临床上用于十二指肠溃疡、胃溃疡、消化道出血、食管反流、口腔溃疡等疾病。盐酸雷尼替丁结构式中含有的二甲胺和亚硝基结构，也是亚硝胺类化合物中的主要组成结构。亚硝胺类化合物，具有强基因毒性、强致畸性和强致癌性，能直接或间接损害dna，导致基因突变或癌变的遗传毒性杂质。各国的法规机构ema、fda、ich等都对遗传毒性杂质有了更明确的要求。2018年华海药业缬沙坦中含有遗传毒性杂质n-亚硝基二甲胺事件发生后，n-亚硝胺类遗传毒性杂质倍受关注。
3.公开号为cn114878707a的中国专利公开了一种测定雷尼替丁及其固体制剂中n-亚硝基二甲胺的高效液相谱法，利用谱柱对处理后的供试品溶液和对照溶液分别进行谱分析，高效液相谱的条件为：波长为235nm，流速为1ml/min，柱温为30℃，进样20μl；高效液相谱的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为碱性水性流动相，所述碱性水相流动相满足7＜ph≤10.5，所述流动相b为有机相。该发明流动相体系应呈碱性，实现雷尼替丁以稳定的分子态被固定相吸附，实现更好的分离度。用氨-碳酸氢铵缓冲体系可满足体系碱性需要，基线噪音较小，且兼容质谱。该专利采用高效液相谱法测定雷尼替丁中的杂质，但是通过目前测定方法仅能测定雷尼替丁中杂质n-亚硝基二甲胺的含量，无法同时测定多种杂质。
4.盐酸雷尼替丁的化学结构中同时含有亚硝酸盐和二甲胺基团，可降解产生n-亚硝基二甲胺(ndma)、n-亚硝基二乙胺(ndea)和n-亚硝基二异丙胺(ndipa)等n-亚硝胺类遗传毒性杂质亚硝胺类化合物并带入最终产品中，该方法只针对n-亚硝基二甲胺这1种亚硝基类基因毒性杂质进行研究，适用性小，不能全面反映原料及制剂中n-亚硝胺类遗传毒性杂质的控制情况。

技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供液质联用法测定盐酸雷尼替丁中多种遗传毒性杂质的方法，即可同时测定盐酸雷尼替丁中的十一种亚硝胺类杂质。
6.为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
7.液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，包括以下步骤：
8.s1、配制盐酸雷尼替丁供试品溶液；
9.s2、配制盐酸雷尼替丁对照品溶液，绘制标准曲线；
10.s3、将s1中的盐酸雷尼替丁供试品溶液利用液相谱-质谱联用法进行测定，液相
谱条件为：以0.05-0.15％甲酸的水溶液为流动相a，以0.05-0.15％甲酸的甲醇溶液为流动相b，进行梯度洗脱，测得盐酸雷尼替丁供试品溶液中杂质的含量；
11.s3中质谱参数确定的方法为：采用流动注射法，通过全扫描确定待测遗传毒性杂质的母离子，再执行仪器优化程序确定mrm优化参数。
12.本发明可以同时对盐酸雷尼替胶囊中11种基因毒性杂质进行检测，能更加全面反映原料及制剂中n-亚硝胺类遗传毒性杂质的控制情况，从而有效提高盐酸雷尼替胶囊用药安全性，为雷尼替丁胶囊合理设计生产工艺、贮存环境、运输条件和包装等提供参考，为保障雷尼替丁胶囊质量控制提供依据。
13.本发明采用水做溶剂时，各基因毒性杂质在质谱中的响应要优于采用甲醇做溶剂，各基因毒性杂质在质谱中的响应更好，且盐酸雷尼替丁在质谱中干扰更小，有利于11种基因杂质测定。
14.在本发明的一个优选的实施例中，s3中梯度洗脱时间、流动相a和流动相b的比例具体为：
15.时间(min)a％b％1:0093-973-72:0090-946-106:5090-946-1010:0060-7030-4011:0030-5050-7018:00010021:00010021:1093-973-726:0093-973-7
16.在本发明的一个优选的实施例中，s3中液相谱柱的柱温35-45℃，进样量为5-10μl；流速是0.5-1ml
·
min-1
。
17.在本发明的一个优选的实施例中，s3中液相谱柱的柱温40-45℃，进样量为5μl；流速是0.5-1ml
·
min-1
。进样体积进样体积为5μl时，各杂质的响应已达到检验基本要求，即浓度为1ng/ml的对照溶液所得的信噪比大于10，且相对于进样体积10μl，盐酸雷尼替丁进样的量更小、在质谱中干扰更小、对质谱污染可能性更小，更有利于杂质测定。
18.在本发明的一个优选的实施例中，s3中质谱的参数如下：
[0019][0020]
在本发明的一个优选的实施例中，s3中，液相谱-质谱联用法采用液相谱仪和质谱仪联用，在质谱仪这端上配置有六通阀。
[0021]
在本发明的一个优选的实施例中，六通阀控制每隔0.5min-18min通入s1中的盐酸雷尼替丁供试品溶液，可排除盐酸雷尼替丁对质谱检测的干扰和因其浓度过大和制剂中杂质引起的质谱污染。
[0022]
在本发明的一个优选的实施例中，s1中配制盐酸雷尼替丁供试品溶液需进行过滤，滤膜微孔直径为0.1-0.5μm。
[0023]
在本发明的一个优选的实施例中，滤膜微孔直径为0.1-0.3μm。0.1-0.3μm滤膜基本没有吸附作用且不影响杂质的测定。滤膜微孔直径大于0.3μm对盐酸雷尼替丁溶液有一定吸附作用，故本试验对离心后取上清液样品采用0.1-0.3μm滤膜进行过滤，取续滤液作为供试品溶液。
[0024]
与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：
[0025]
本发明采用液相谱-大气压化学离子化-三重四极杆质谱联用法(lc-apci-ms/ms)测定雷尼替丁胶囊中n-甲基-n-亚硝苯胺(nmpa)、n-甲基-n-亚硝苯胺(ndela)、n-甲基-n-亚硝苯胺(npip)、n-甲基-n-亚硝苯胺(nmor)、(2s)-n-亚硝基降烟碱(nnn)、n-亚硝基二甲胺(ndpa)、n-亚硝基二甲胺(ndba)、n-亚硝基二甲胺(ndma)、n-亚硝基二乙胺(ndea)、n-亚硝基二乙胺(neipa)、n-亚硝基二乙胺(ndipa)等11种n-亚硝胺类遗传毒性杂质，为盐酸雷尼替丁胶囊合理设计生产工艺、贮存环境、运输条件和包装等提供参考，为保障盐酸雷尼替丁胶囊质量控制提供依据。
附图说明
[0026]
图1为采用对比例1测定n-亚硝基二甲胺(ndma)对照品溶液(500ppb)tic图；
[0027]
图2为本发明实施例一同时测定11中基因毒性对照品溶液(500ppb)tic图；
[0028]
图3为采用对比例1测定n-亚硝基二甲胺(ndma)对照品质荷比图；
[0029]
图4为本发明实施例一测定对照品溶液(50ppb)n-甲基-n-亚硝苯胺(ndela)质荷比图；
[0030]
其中：保留时间：3.273、峰面积：364199、浓度50.722；
[0031]
#m/z强度准确度1135.20＞56.152856636.29
[0032]
图5为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-甲基-n-亚硝苯胺(npip)质荷比图；
[0033]
其中：保留时间：13.228、峰面积：372314、浓度49.091；
[0034]
#m/z强度准确度1115.10＞41.1084861107.21
[0035]
图6为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-甲基-n-亚硝苯胺(nmor)质荷比图；
[0036]
其中：保留时间：7.235、峰面积：143904、浓度54.220；
[0037]
#m/z强度准确度1116.95＞45.1016194100.34
[0038]
图7为本发明一实施例测定a对照品溶液(50ppb)(2s)-n-亚硝基降烟碱(nnn)质荷比图；
[0039]
其中：保留时间：6.931、峰面积：781190、浓度51.651；
[0040]
#m/z强度准确度1178.10＞120.1039890110.18
[0041]
图8为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-亚硝基二甲胺(ndpa)质荷比图；
[0042]
其中：保留时间：14.883、峰面积：315768、浓度48.667；
[0043]
#m/z强度准确度1131.15＞43.1586379137.30
[0044]
图9为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-亚硝基二甲胺(ndba)质荷比图；
[0045]
其中：保留时间：16.797、峰面积：374206、浓度53.569；
[0046]
#m/z强度准确度1159.30＞102.904312451.07
[0047]
图10为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-亚硝基二甲胺(ndma)质荷比图；
[0048]
其中：保留时间：4.532、峰面积：219399、浓度52.043；
[0049]
#m/z强度准确度174.95＞58.20690120.05
[0050]
图11为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-亚硝基二乙胺(neipa)质荷比图；
[0051]
其中：保留时间：13.632、峰面积：713901、浓度50.512；
[0052]
#m/z强度准确度1117.00＞47.202048415.17
[0053]
图12为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-亚硝基二乙胺(ndea)质荷比图；
[0054]
其中：保留时间：12.457、峰面积：221689、浓度53.769；
[0055]
#m/z强度准确度1103.00＞47.001254633.31
[0056]
图13为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-甲基-n-亚硝苯胺(nmpa)质荷比图；
[0057]
其中：保留时间：15.188、峰面积：153272、浓度52.128；
[0058]
#m/z强度准确度1137.20＞107.00957935.44
[0059]
图14为本发明一实施例测定对照品溶液(50ppb)n-亚硝基二甲胺(ndipa)质荷比图；
[0060]
其中：保留时间：14.451、峰面积：215592、浓度52.218；
[0061]
#m/z强度准确度1131.00＞47.104072887.92
[0062]
图15为本发明一实施例测定供试品溶液质谱图；
[0063]
图16为对比例1测定供试品溶液质谱图。
具体实施方式
[0064]
实施例1
[0065]
一种采用液相谱-大气压化学离子化-三重四极杆质谱联用法(lc-apci-ms/ms)测定雷尼替丁胶囊中ndma、ndea、ndipa、neipa、nnn、ndba、ndela、nmor、npip、ndpa和nmpa等11种n-亚硝胺类遗传毒性杂质，包括以下步骤：
[0066]
步骤1：配制盐酸雷尼替丁供试品溶液：取本品内容物适量(约相当于雷尼替丁300mg)，至适宜容器中，精密加入水10ml，涡旋混匀1分钟，再振摇40分钟，离心，取上清液过滤，取续滤液即得；
[0067]
步骤2：配制盐酸雷尼替丁对照品溶液：精密称取n-亚硝基二甲胺对照品适量，配制浓度为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml的线性溶液，作为对照品溶液；
[0068]
步骤3：确定质谱条件：采用流动注射法，通过全扫描确定待测11种基因毒性杂质的母离子，再执行仪器优化程序确定mrm优化参数，最终确认质谱检测的相关参数如下：
[0069][0070]
步骤4：确定谱条件使11种基因毒性杂质能实现有效分离，确定液相方法为：以0.1％甲酸的水溶液为流动相a，以0.1％甲酸的甲醇溶液为流动相b，按下表进行梯度洗脱；柱温40℃，进样量为5μl；流速是0.8ml
·
min-1
。
[0071][0072][0073]
采用三重四级杆串联质谱检测器，apci源，正离子模式，接口电压为4.5kv，接口温度为300℃，dl管温度为180℃，加热块温度为200℃，干燥器流速为5l/min，采用模式为多反应监测(mrm)，碰撞能量：20v(m/z 74.95
→
m/z 43.05)，14v(m/z 74.95
→
m/z 58.10)。
[0074]
步骤5：为排除盐酸雷尼替丁对质谱检测的干扰和因其浓度过大和制剂中杂质引起的质谱污染，在ms端配备六通阀，并设置切阀程序为：0
→
0.8min，进入废液；0.8min
→
7.5min，进入ms；7.5min
→
12min，切换至废液；12min
→
18min，进入ms；18min后切换至废液。
[0075]
步骤6：采用确认方法进行方法学验证，得到以下结果：
[0076]
6.1标准曲线与线性关系，精密量取线性对照溶液5μl，注入液相谱-质谱联用仪，记录液相谱-质谱图。以浓度(ng/ml)为x轴，峰面积为y轴，进行线性回归，结果下表，
结果显示11种基因毒性杂质在本方法中呈良好的线性关系。
[0077]
化合物名称校准曲线rnmpay＝2930.49x+510.9590.9992223ndelay＝7169.46x+547.0940.9998254npipy＝7557.25x+1320.280.9999022nmory＝2649.98x+221.9560.9999233nnny＝15123.4x+55.98070.9998534ndpay＝6492.65x-211.5590.9993194ndbay＝6930.21x+2962.520.9997791ndmay＝4166.22x+2575.930.9995174ndeay＝4122.41x+32.97770.9997659neipay＝14136.0x-132.8290.9996411ndipay＝4103.51x+1315.740.9997716
[0078]
6.2精密度试验，精密量取浓度为10ng/ml对照溶液5μl，注入液相谱-质谱联用仪，连续进样6针，记录液相谱-质谱图。ndma、ndea、ndipa、neipa、nnn、ndba、ndela、nmor、npip、ndpa和nmpa峰面积rsd为2.10％、3.51％、2.75％、2.32％、2.94％、2.34％、1.58％、3.27％、3.58％、4.48％和0.77％，表明该方法精密度良好。
[0079]
6.3稳定性试验，供试品溶液于10℃放置0小时、2小时、4小时、6小时、8小时，10小时后，12小时、16小时、18小时、20小时、24小时，分别进样测定，记录谱图。ndma、ndea、ndipa、neipa、nnn、ndba、ndela、nmor、npip、ndpa和nmpa峰面积rsd为1.87％、2.43％、4.84％、2.78％、1.65％、1.00％、3.87％、2.67％、0.39％、2.88％和1.57％，结果表明供试品溶液至少在24小时内稳定。
[0080]
6.4回收率试验分别精密称取供试品约300mg，置10ml量瓶中，平行称取6份，分别精密量取浓度为500ng/ml线性溶液0.2ml，用水稀释至刻度，再振摇40分钟，离心，取上清液滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别进样测定，记录谱图，结果表明ndma、ndea、ndipa、neipa、nnn、ndba、ndela、nmor、npip、ndpa和nmpa回收率依次为98.43％、89.33％、85.37％、85.58％、79.50％、98.95％、101.41％、100.22％、91.77％、88.80％和103.88％，结果表明该方法准确可靠。
[0081]
6.5定量限和检测限精密量取浓度为1ng/ml适量，逐级稀释后进样分析以信噪比约为10︰1时的溶液浓度作为定量限溶液，以信噪比约为3︰1时的溶液浓度作为检测限溶液。
[0082]
采用本技术方法测定a企业盐酸雷尼替丁胶囊中11种亚硝基类基因毒性杂质进行检测，测定结果显示，该企业盐酸雷尼替丁胶囊中n-亚硝基二乙醇胺(ndela)量为0.970ng/g、n-亚硝基二乙醇胺(ndba)量为0.054ng/g、n-亚硝基二甲胺(ndma)为1.737ng/g，其余杂质未检出。
[0083]
对比例1
[0084]
对比例1与实施例1的区别在于以0.1％甲酸的甲醇溶液为流动相，通过全扫描确定ndma杂质的母离子，再执行仪器优化程序确定mrm优化参数，最终确认质谱检测的相关参数如下：
[0085][0086]
对比例1仅能测定n-亚硝基二甲胺(ndma)为小于定量限。
[0087]
实施例2
[0088]
如图15所示，收集新出厂的盐酸雷尼替丁胶囊，按本发明实施例1处理测定，测定结果显示该盐酸雷尼替丁胶囊检品中，检出三种基因毒性杂质，依次为n-亚硝基二乙醇胺(ndela)量为0.970ng/g、n-亚硝基二乙醇胺(ndba)量为0.054ng/g、n-亚硝基二甲胺(ndma)为1.737ng/g。
[0089]
对比例2
[0090]
如图16所示，采用对比例1测定方法对实施例2中样品进行测定，仅能检测出n-亚硝基二甲胺(ndma)，其含量为1.502ng/g，其他杂质无法测定。

技术特征：

1.液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于包括以下步骤：s1、配制盐酸雷尼替丁供试品溶液；s2、配制盐酸雷尼替丁对照品溶液，绘制标准曲线；s3、将s1中的盐酸雷尼替丁供试品溶液利用液相谱-质谱联用法进行测定，液相谱条件为：以0.05-0.15％甲酸的水溶液为流动相a，以0.05-0.15％甲酸的甲醇溶液为流动相b，进行梯度洗脱，测得盐酸雷尼替丁供试品溶液中杂质的含量；s3中质谱参数确定的方法为：利用质谱仪采用流动注射法，通过全扫描确定待测遗传毒性杂质的母离子，再执行仪器优化程序确定mrm优化参数。2.根据权利要求1所述的液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，s3中梯度洗脱时间、流动相a和流动相b的比例具体为：时间(min)a％b％1:0093-973-72:0090-946-106:5090-946-1010:0060-7030-4011:0030-5050-7018:00010021:00010021:1093-973-726:0093-973-73.根据权利要求1所述的液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，s3中液相谱柱的柱温35-45℃，进样量为5-10μl；流速是0.5-1ml
·
min-1
。4.根据权利要求3所述的液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，s3中液相谱柱的柱温40-45℃，进样量为5μl；流速是0.5-1ml
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min-1
。5.根据权利要求1所述的液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，s3中质谱的参数如下：
6.根据权利要求1所述的液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，s3中，液相谱-质谱联用法采用液相谱仪和质谱仪联用，在质谱仪这端上配置有六通阀。7.根据权利要求6所述的液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，六通阀控制每隔0.5min-18min通入s1中的盐酸雷尼替丁供试品溶液。8.根据权利要求1所述的液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，s1中配制盐酸雷尼替丁供试品溶液需进行过滤，滤膜微孔直径为0.1-0.5μm。9.根据权利要求8所述的液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，其特征在于，滤膜微孔直径为0.1-0.3μm。

技术总结

本发明公开了一种液质联用法测定盐酸雷尼替丁中遗传毒性杂质的方法，包括以下步骤：S1、配制盐酸雷尼替丁供试品溶液；S2、配制盐酸雷尼替丁对照品溶液，绘制标准曲线；S3、将S1中的盐酸雷尼替丁供试品溶液利用液相谱-质谱联用法进行测定，液相谱条件为：以0.05-0.15％甲酸的水溶液为流动相A，以0.05-0.15％甲酸的甲醇溶液为流动相B，进行梯度洗脱，测得盐酸雷尼替丁供试品溶液中杂质的含量。本发明可以同时盐酸雷尼替胶囊中对11种亚硝基类基因毒性杂质进行检测，能更加全面反映原料及制剂中N-亚硝胺类遗传毒性杂质的控制情况，从而有效提高盐酸雷尼替胶囊用药安全性，为保障雷尼替丁胶囊质量控制提供依据。尼替丁胶囊质量控制提供依据。