霉菌试验培训教程
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实验部分
实验一 霉菌试验室常用的器皿
微生物学实验室所用的玻璃皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。 一、器皿的种类、要求和应用
1.试管
微生物学实验所用的玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口，不然，微生物容易从棉花与管口进入试管而造成
污染。棉塞可用棉花塞、试管帽，橡胶塞等。
试管的大小常选用中试管(约13～15×100～150mm)。
2.玻璃吸管(又称移液管)
霉菌试验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管，与化学实验室所用的不同，其刻度指示的容量往往包括管尖的液体体积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有时称为“吹出”吸管。
3.培养皿
常用的培养皿，皿底直径90mm，高15mm。培养皿一般为玻璃皿盖。在培养皿内倒入适量培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种以及微生物计数等。
4.三角烧瓶与烧杯
三角烧瓶有100、250、500、1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和摇瓶发酵等。常的烧杯有50、100、250、500、1000ml等，用来配制培养基和药品。
5.载玻片与盖玻片
普通载玻片大小为75×25mm，用于微生物涂片、染，作形态观察等。盖玻片为18×18mm。
6.双层瓶
由内外两个玻璃瓶组成，内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，外层瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。
7.滴瓶
用来装各种染料、生理盐水等。
8.接种工具
接种工具有接种环、接种针、接种钩、接种铲、玻璃涂布器等。接种环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复烧灼，又易冷却。
9.容量瓶
常见的容量瓶有100、250、500、1000ml等不同的大小，常用来定容溶液体积。
二、玻璃器皿的清洗方法
清洁的玻璃器皿是实验室得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。
1.新玻璃器皿的洗涤方法
新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2%的盐酸或洗涤液。浸泡后用自来水冲洗干净。
2.使用过的玻璃器皿的洗涤方法
(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。玻璃器皿经洗涤后， 内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全冼净，若挂有水珠，则还需要洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。
装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。长有霉菌的培养物先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。 (2)玻璃吸管 吸过菌体或孢子悬浮液的玻璃吸管使用后应立即投入盛有2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液或巴斯消毒液的量筒或标本瓶内，24小时方可取出冲洗。吸取其它溶液的吸管应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，以免干燥后难以洗净。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。
(3)载玻片与盖玻片 用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5～10分钟，用软布或脱脂棉花擦轼，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡0.5～2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。
检查过活菌的载玻片和盖玻片应先用2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液浸泡24小时，然后按上述方法洗涤与保存。
3.洗涤液的配制与使用
（1）洗涤液的配制
洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下：
浓溶液：或重铬酸钾(工业用) 50g
自来水 150ml
浓硫酸(工业用) 800ml
稀溶液：或重铬酸钾(工业用) 50g
自来水 850ml
浓硫酸(工业用) 100ml
配法都是将或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐徐加入浓硫酸，边加边搅动。配好后洗涤液呈棕红或桔红，长期使用后变成墨绿即为失效。贮存于有盖容器内。使用时注意安全。
三、玻璃器皿的包装
略。
实验二 消毒与灭菌
灭菌与消毒是有区别的。灭菌是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌与消毒的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。
在霉菌试验过程中有许多步骤是要求无菌操作的，因此灭菌是整个试验中的重要环节。灭菌的彻底与否将直接影响试验结果的准确程度，能否确切地反映霉菌试验的真实情况，也是关系到试验结果的可靠性。常用灭菌方法有加热法灭菌、紫外线灭菌、化学药品灭菌。
一、加热灭菌
1.干热灭菌
有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊
子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。通常说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气160℃～170℃下保温2小时进行灭菌。
2.高压蒸气灭菌
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。高压湿热蒸汽灭菌有较大的渗透力，容易使蛋白质凝固和变性，是一种可靠的灭菌方法。它能杀死一切微生物。其特点是杀菌可靠、经济、快速、无臭、无味和无毒性，能达到安全有效。
灭菌时，先取出灭菌桶，再向外层锅内加入适量的清水（水没过电阻丝），放回灭菌桶，并将待灭菌的器皿以及被霉菌污染的物品用纸（牛皮纸、旧报纸）包装好装入高压灭菌锅内，注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
打开电源加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷气完全排尽(蒸汽从气门有力的冲击)关闭排气阀，随后压力上升,直到指针到0.105Mpa，锅内温度为121.3℃为止，控制电源电压，维持压力并保持20～30min。
灭菌时间即将结束时，停止加热，让灭菌锅自行降压，等压力锅指针回到接近零时即可开启放气阀，使锅内蒸汽排空，然后揭开盖至1/3左右，利用余热烘干试管塞，再取出已灭菌的物品，如果压力未降到会位，切勿打开盖子，以免压力容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
将取出的灭菌培养基放入29℃±1℃恒温培养箱内培养24小时，经检查无杂菌生长，即可待用。
蒸汽压力与蒸汽温度换算的关系如表1所示。
表1 蒸汽压力与蒸汽温度换算的关系
蒸汽压力 大气压 | 压 力 表 读 数 | 蒸汽温度 |
千克/厘米2 (Kg/cm2) | 磅/英寸2（1b/in2） | ℃ |
1.00 | 0.00 永磁同步电机转子 | 0.00 | 100.0 |
1.25 | 0.25 | 3.75 | 107.0 |
1.50 | 0.50 | 高分子布鞋7.50 | 112.0 |
1.75 | 0.75 | 11.25 | 115.0 |
2.00 | 1.00 | 15.00 | 121.0 |
2.50 | 1.50 | 22.50 | 128.0 |
双臂电桥3.00 | 2.00 | 30.00 | 134.5 活塞销 |
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二、紫外线灭菌
紫外线灭菌是利用紫外线灯照射进行的，波长为200～300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。紫外线灯距照射物以不超过1.2米为宜，为了加强灭菌效果，在开紫外线灯之前，可先在无菌室内喷洒2%—5%的来苏儿溶液，照射时间应在0.5小时～2小时。
紫外线对人体有害，不能直视开着紫外线灯。
三、化学药品灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。即利用化学药剂进行灭菌。试验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。常用的2%来苏尔、0.25%新洁尔灭、1%、3～5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等。常用化学杀菌剂的浓度及应用范围见表2：
表2 常用化学杀菌剂的浓度及应用范围
类 别 | 杀菌剂名称 | 常用浓度 | 应用范围 |
醇 类 | 乙醇 | 50-70% | 皮肤及器械消毒 |
酸 类 | 乳酸 | 0.33-1mol/L | 空气消毒（喷雾或熏蒸） |
食醋 | 3～5ml/m3 | 熏蒸消毒空气，可预防流感病毒 |
碱 类 | 石灰水 夜尿停 | 1-3% | 地面消毒 |
酚 类 | 石炭酸 | 5% | 空气消毒（喷雾） |
来苏尔 | 2-5% | 空气消毒、皮肤消毒 |
醛 类 | 福尔马林 | 40%溶液2-6ml/m3 | 接种室、接种箱或接种房熏蒸消毒 |
重金属离子 |
| 0.1% | 植物组织（如根瘤）表面消毒 |
硝酸银 | 0.1-1% | 皮肤消毒 |
氧化剂 | 高锰酸钾 | 0.1-3% | 皮肤、水果、茶杯消毒 |
过氧化氢 | 3% | 清洗伤口 |
| 0.2-1ppm | 饮用水清洁消毒 |
漂白粉 | 对照物1-5% | 洗刷培养基、饮用及粪便消毒 |
去污剂 | 新洁尔灭 | 水稀释20倍 | 皮肤、不能遇热的器皿消毒 |
染 料 | 结晶紫 | 2-4% | 外用紫药水，浅创伤口消毒 |
金属螯合剂 | 8-羟基奎啉硫酸盐 | 0.1-0.2% | 外用、清洗消毒 |
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[甲醛熏蒸：福尔马林（40%甲醛）10ml加高锰酸钾5g/m3密封熏蒸6h以上，福尔马林12.5ml/m3加入等量的水加热蒸发，熏蒸6h以上。]
实验三 培养基的制备和灭菌
培养基是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖，并累积新陈代谢产物的混合养料。它通常含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大类成分。根据微生物种类和试验目的不同，培养基的种类和配制方法也不一样。（如按营养成分分：天然培养基（PDA）和合成培养基（Czapek）；按物理状态分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基；等等。）。
霉菌试验常用的培养基有：查氏培养基（Czapek）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、滤纸培养基、真菌培养基等。
