过氧化氢酶(CAT)活性测定

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过氧化氢(CAT)活性测定
高锰酸钾滴定法
(李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育出版社.2000165-167)
一、原理
过氧化氢酶(catalaseCAT)普遍存在于植物的所有组织中,其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系,它属于血红蛋白酶,含有铁,能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
因此,可以根据H2O2的消耗量或者O2232的生成量测定该酶活力的大小。
在该体系中加入一定量(反应过量)H2O2溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O编织布2,即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2+2KMnO4+4H2内裤加工SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
免蒸加气砖二、材料、仪器设备及试剂
()材料
压花设备  植物器官(花瓣、叶片等)
()仪器设备
冰箱、离心机、微量加样器 (1ml20μl100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管
    ()试剂
      (1)10% H2SO4
(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液
(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液:称取KMnO4(AR)3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制   
1000mL,再用0.1mol/L草酸溶液标定
(4) 0.1mol/L H2O2:取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL,稀释至1000mL,用     
0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定
(5) 0.1mol/L草酸:称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g,用蒸馏水溶解后,定溶1000mL       
三、试验步骤
()酶液提取
  取植物材料2.5g,加入PH7.8的磷酸缓冲液少量,研磨成匀浆,转移至25mL容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转至容量瓶中,用同一缓冲液定溶,4000r/min离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
()50mL三角瓶4(两个测定,另两个为对照),测定瓶加入酶液2.5mL,对照加煮死酶液2.5mL,再加2.5mL0.1mol/LH2O2,同时计时,于30恒温水浴中保温10min,立即加入10% H2SO4静态管理2.5mL
()0.1mol/L高锰酸钾标准液滴定,直至出现粉红(30min内不消失)为终点。
四、结果计算
酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示:
过氧化氢酶活性=[(A-B)×(VT/VS)×1.7]/(W×t)  [mg/(g.min)]
式中:A为对照KMnO4滴定毫克数;B为酶反应后KMnO4滴定毫克数VT为提取酶液总量,mLVs为反应时所用酶液量,mLW为样品鲜重,gt为反应时间,min1.71mL 0.1mol/L高锰酸钾,相当于1.7mg H2O2
五、注意事项
    所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

本文发布于:2023-06-04 10:56:35,感谢您对本站的认可!

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