项目名称 | 从小麦叶片中提取过氧化氢酶 | ||||||||
经 费 | （元） | 起止时间 | 年 月至 年 月 | ||||||
负责人 | 学号 | 姓名 | 年级 | 专业 | E-mail | ||||
34090378 | 尹炳谦 | bq_yin@sina | |||||||
参加成员 | 培训台 | ||||||||
指导教师 | 姓名 | 职称 | 职务 | ||||||
E-mail | 签名 | ||||||||
一、项目申请理由（包括项目背景及自身具备的知识、素质、能力和已参加过的研究等条件） 酷基(一)项目背景 近几年，过氧化氢酶在各个行业都得到广泛的应用，特别是在纺织印染业。纺织印染业传统的去除氧漂后织物上残留双氧水的工艺是高温热洗加水洗，使双氧水分解挥发，这势必要耗费很多时间和大量的水、电、汽，同时也增加了污水处理的负担和前处理过程的成本。过氧化氢酶由于作用专一，反应条件温和，作用时间快，而目具有节能节水、减少环境污染等特点。 但是，目前纺织印染企业生产所用的过氧化氢酶产品几乎都依赖进口，市场为外商垄断。因此国内高品质过氧化氢酶制品的研制是市场的需要，也是企业降低成本的需要。在国内，发酵法尚处于实验室研究阶段，并无工业化生产。从动物原料中提取过氧化氢酶的研究于近几年才得到重视，而植物材料杂蛋白含量较动物原料少，分离纯化更简单。 （二）自身具备的知识等 通过学习生物化学、有机、无机、分析化学、生理学、医用物理、微生物、药用化学及物理化学的相关知识以及查的相关文献，为实验顺利进行提供了基本的理论基础。通过学习有机、无机、分析化学实验、生理实验、医用物理实验，、生物化学实验，具备了一定的的实验操作基础。 | |||||||||
二、项目研究内容（目前研究的现状、主要研究内容，重点和难点及创新点，研究思路和方法等） （一）目前研究的现状 在国内，发酵法尚处于实验室研究阶段，并无工业化生产。大多是从动物原料中提取过氧化氢酶，而以植物为原料提取的很少，由于植物原料中杂蛋白含量较动物原料少，分离纯化更简单。 （二）主要研究内容 本实验旨在研究一种从植物小麦叶片中分离纯化过氧化氢酶的方法，为规模化生产该过氧化氢酶制品提供参考。 （三）重点和难点 如何通过尽可能简单的提纯方法得到较纯的过氧化氢酶，而且不影响酶的活性 （四）创新点 在国内大多是从动物组织中提取过氧化氢酶，而本实验。运用所学的生化实验操作技术从小麦叶片中提取过氧化氢酶，寻一种方便、有效、系统的提纯方法。 （五）研究思路 新鲜小麦叶片 ↓ 组织捣碎 ↓ 离心 ↓ 弃沉淀，留上清(粗提液) ↓ 加入固体硫酸铵至不倒翁玩具30% 饱和度 ↓ 离心 ↓ 硫酸铵分级沉淀 弃沉淀，留上清 ↓ 再加入硫酸铵至40% 饱和度 ↓ 离心 ↓ 弃上清，留沉淀 ↓ 磷酸缓冲液溶解沉淀 ↓ 透析 ↓ 离子交换层析 ↓ 凝胶过滤柱层析 ↓ 氧化氢酶活性和蛋白质含量的测定 （六）具体实验方法： （查阅文献确定试剂及样品的用量） 1.过氧化氢酶粗品的制备 称取一定量的新鲜小麦叶片，剪碎，加入0.05mol/L 的磷酸缓冲液(pH7.2)。匀浆后4℃下溶液离心8000r/min,7min。收集上清并量取体积。 2.硫酸铵的分级沉淀和透析 硫酸铵分级沉淀的原理： 酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 第一次硫酸铵分级： 粗提液加入固体硫酸铵至30% 饱和度，4℃冰箱静置2h 后，12000 r/min离心30min，弃沉淀留上清。量取上清体积。 第二次硫酸铵分级： 再加入硫酸铵至40% 饱和度，4℃冰箱静置2h，12000 × g离心30min，弃上清，留沉淀。 3.透析： 沉淀用0.05mol/L 的磷酸缓冲液(pH7.2)溶解，4 ℃用0.05mol/L、pH7.2 的磷酸缓冲液透析过夜。 4.DEAE-Sepharose离子交换层析： 装柱：除死体积将DEAE-Sepharose离子交换树脂用起始缓冲液搅匀后连续加入，柱内的DEAE-Sepharose离子交换树脂应非常均匀地分布，防止出现截面和气泡，床面要平整，床高至黑标记处；用起始缓冲液洗柱,控制好流速。 连接仪器：连接紫外检测器(与柱相连)与记录仪，并调试，紫外检测波长为280nm。 平衡、上样。 洗柱：当样品接近柱床面时，加入0.05mol/L pH7.2磷酸起始缓冲液，洗出未吸附的杂蛋白。 洗脱：用0～1.0mol/L 线性梯度的NaCl 溶液(内含0.05mol/L，pH7.2 的磷酸缓冲液)进行梯度洗脱 最后需测定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量，收集活性较高的各管酶液 (七)过氧化氢酶活力的测定 以过氧化氢为底物，采用钼酸铵终止法进行测定。钼酸铵与过氧化氢反应生成黄复合物（钼黄），在一定范围内，过氧化氢的含量和OD值成正比。 用过氧化氢标准品，制作标准曲线，这样就可以计算出样品中的过氧化氢酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气，从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力。以每分钟催化分解1μmol过氧化氢所需的酶量为一个酶活力单位。 钼酸铵终止法测定过氧化氢含量的标准曲线的制作
室温下在波长405nm处测定其OD值。 (八)蛋白含量的测定： 1.选择考马斯亮兰法原因 （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍。因为蛋白质与染料结合后产生的颜变化很大，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合后在5分钟至20分钟之间，颜的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 2.实验操作 （1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。第8、9、10管加入提取的样品，经过查相关资料确定加入样品的量。如下表： 考马斯亮兰法实验表
(2)加完试剂2~5分钟后，即可开始用比皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。 注意：不可使用石英比皿（因不易洗去染），可用塑料或玻璃比皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染。塑料比皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
本文发布于:2023-06-04 10:31:42，感谢您对本站的认可！
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