闪光灯柔光罩过氧化氢酶活力的测定实验报告
篇一：过氧化氢酶活性测定
实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：小麦叶片
（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.
0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤
（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮
死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红（在30min内不消失）为终点。
四、结果计算
酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×VT/(W ×VS×1.7×t)
式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；
VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）；t反应时间（min）；
1.71ml0.1mol/L KMnO4相当于1.7mgH2O2。
过氧化氢酶的活性测定
在植物体中，黄素氧化酶类的代谢产物常包含H2O2，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸
作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。H2O2的积累可导致破坏性的氧化作用，
而过氧化物酶和过氧化氢酶则可以清除H2O2，是植物体内重要的活性氧清除系统之一。其活
性还与植物的抗逆性有密切关系，本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。
一、原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，
在此过程中起传递电子的作用，H2O2则既是氧化剂，又是还原剂。
R(Fe+2)＋H2O2=====R(Fe+3OH-)2
R(Fe+3OH-)2＋H2O2===R(Fe+2)2＋2H2O＋O2
合并上式：2H2O2====2H2O＋O2
据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸
钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4
即可求出消耗的H2O2量。
二、仪器和用具：研钵、三角瓶50cm3×4、铁架、酸式滴定管、恒温水浴、容量瓶
三、试剂：
10％H2SO4；0.2mol/l磷酸缓冲液pH7.8；
0.1mol/l高锰酸钾标准液： 3.1605gKMnO4 (AR) 用新煮沸的蒸馏水配制成1000ml，用
0.1mol/l的草酸溶液标定；
0.1mol/l H2O2：市售30％H2O2大约等于17.6mol/l，取30％H2O2溶液5.68ml稀释至
1000ml，用标准0.1mol/l KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。
四、方法：
1. 酶液提取：取小麦叶片
2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml
容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm离心，
上清液即为过氧化氢酶粗提液。
2. 取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液
2.5ml；再加入2.5ml 0.1mol/l H2O2，同时计时间，于30℃恒温水浴中保温10分钟，立即加
入10％H2SO4 2.5ml。
3. 用0.1mol/l KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红（在30分钟内不消失）为终点。
4. 结果计算：
酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H2O2的毫克数表示：
(A-B)*Vt/V1*1.7
酶活（酶分解的H2O2 mg/g鲜重）＝-------------------
W
式中：Ａ-----对照用KMnO4 ml数Ｂ-----酶反应后KMnO4滴定ml数
Ｖt----酶液总量mlＶ1----反应所用酶液量mlＷ-----样品鲜重(g)
1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4相当于1.7mg H2O2
氧气袋
[注意]．所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要经过标定，0.1mol/l H2O2要新配制。
实验 48 过氧化物酶活性的测定（比法）
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密
切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
马铃薯块茎。
（二）试剂
1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。清洗篮
倒挂器2 ．反应混合液： 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 μl ，于
磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
（三）仪器设备
分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。
三、实验步骤
5g通讯模块1 ．称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r ／ min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2 ．取光径 1 cm 比杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液
3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （
如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之。也可以用每 min 内
A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
过氧化物酶活性 [u/ （ g · min ） ]=
式中：Δ A 470 ——反应时间内吸光度的变化。 W ——植物鲜重， g 。
V T ——提取酶液总体积， mL 。
眼模V s ——测定时取用酶液体积 , mL 。
t ——反应时间， min 。
蒲圻贝母Fritillaria puqiensis G.D.Yu et G.Y.Chen 是贝母属中一新种，其有效成分生物碱含量较高，止咳效果显著［1，2］。其中的蒲贝酮碱的效果与可待因相似，且无成瘾性，已被国家新药办立项进行一类新药开发。但由于蒲圻贝母以野生为主，连年的采挖已使其资源逐渐枯竭，难以为新药开发提供资源保证，为此我们对其进行了组织培养。蒲圻贝母鳞茎切块培养22d左右，可直接从切片边缘长出多个小鳞茎，以后小鳞茎逐渐长大。为了探讨鳞茎发生的机理，并为研究提高组培贝母鳞茎的生长率，诱发多鳞茎形成的方法，我们在培养的不同时期取材，对鳞茎形成过程中的可溶性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶的酶谱变化进行了分析。
