黄金海;刘业兵;丁伯良;张健;王东
【摘 要】应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的新城疫病毒(NDV),经triton X-100处理并反复冻融制备新城疫 ELISA抗原.应用抗鸡Ig轻链单抗1B7辣根过氧化物酶结合物建立了定量检测NDV抗体水平的ELISA方法.确立了将鸡血清100倍稀释检测ELISA效价(ET)的回归方程y=0.941 28 x+0.206 77,r=0.981 63,可用于定量测定.血凝抑制(HI)方法与ELISA方法的比较试验表明,ELISA法的敏感性是HI方法的3倍以上.应用建立的ELISA方法比较了卵黄、气管及胆汁中局部抗体与血清抗体的差异. 轴套与轴承
【期刊名称】《中国兽药杂志》
【年(卷),期】2005(039)006
【总页数】5页(P22-26)
【关键词】鸡新城疫;抗体;ELISA
【作 者】黄金海;刘业兵;丁伯良;张健;王东
【作者单位】天津大学农业与生物工程学院,天津,300072;天津市畜牧兽医研究所,天津,300112;中国兽医药品监察所,北京,100081;天津市畜牧兽医研究所,天津,300112;天津市畜牧兽医研究所,天津,300112;天津市畜牧兽医研究所,天津,300112
【正文语种】中 文
【中图分类】S854.43
鸡新城疫（ND）在OIE的规定中属I类传染病，具有高度接触性传染特性给全球养鸡业造成了巨大的经济损失。新城疫抗体的检测主要应用血凝抑制（HI）试验和间接酶联免疫吸附试验（ELISA）［1～4］。ELISA具有可批量检测及自动化检测的优势，目前全病毒包被的商品化ELISA诊断试剂盒已广泛应用于实验室诊断（如IDEXX Labora-tories，Westbrook，ME等）。本实验应用抗鸡Ig轻链单抗酶结合物建立新城疫抗体定量检测的ELISA方法，用于鸡抗体水平的监测及免疫效力评价。
1.1 毒种 NDV La sota种毒，本课题组保存。ups检测
捕鱼网具
1.2 血清 新城疫病毒标准阳性血清，SPF鸡阴性血清、减蛋综合征病毒（EDSV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）标准阳性血清，购自中国兽医药品监察所。禽流感病毒（AIV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）标准阳性血清，购自哈尔滨兽医研究所。
1.3 实验动物 AA肉鸡，1日龄，购自北京爱拨益加肉鸡公司；罗曼蛋鸡（110日龄时应用NDV油苗免疫），200日龄，购自天津海成鸡场。立式升降机
1.4 ELISA抗原的制备 采用红细胞吸附释放法［5］。
1.4.1 健康鸡红细胞的制备和醛化 将健康鸡新鲜抗凝红细胞用PBS液洗涤5次，配制成25%的红细胞悬液200 mL，置于锥形瓶中，然后将含有50 mL 38%甲醛溶液（pH 5.5～6.0）的透析袋放入锥形瓶，室温下缓慢搅拌3 h；刺穿透析袋使甲醛溶液混入细胞悬液，继续搅拌12 h；细胞悬液用100目铜网过滤，滤液用PBS洗涤5次，加入0.2 mol/L的Tris-甘氨酸缓冲液悬浮沉淀细胞，再加入硼氢化钠溶液至1 mmol/L；用PBS洗涤2次，配成25%的细胞悬液，加入0.01%硫柳汞防腐，置4℃保存。
1.4.2 病毒的纯化 将病毒接种鸡胚，数天后收获尿囊液，10 000×g离心10 min，上清液中加入醛化红细胞至终浓度5%，4℃磁力搅拌1 h，1 000× g离心10 min后，分别收集上清和沉淀：①沉淀中加入5%NaCl溶液（pH 6.8）作用30 min，离心后收集上清；②上清用HA检测血凝价，如果病毒吸附量低于90%，可进行再次吸附，按步骤①重复1次。将两次所得上清合并，加入1%Triton X-100作用30 min，透析除盐即为ELISA抗原。测定蛋白含量为2.96 mg/mL。
1.5 ELISA工作条件的选择数字家庭影院
1.5.1 抗原包被量的确定 以0.5‰鞣酸鞣化40孔或96孔酶标板，然后用不同含量的NDV ELISA抗原包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜；甩干，PBS洗涤，以3%马血清（HS）-PBST液37℃封阻30 min；洗涤后加入用2%PEG 6000-1.5 mol/L NaCl -PBST稀释50倍的鸡阳性血清，37℃作用30 min；洗涤，加入HRP-1B7酶结合物37℃作用30 min，洗涤；加底物OPD作用10～15 min，加2 mol/ L H2SO4终止反应；用酶联免疫检测仪测其 OD值。同时设阳性、阴性对照。
1.5.2 血清最佳稀释度的确定 用1.5.1项得出的最佳抗原包被量包被鞣化酶标板，并按所述
步骤做间接ELISA测定，但封阻后分别加入用2%PEG 6000-1.5 mol/L NaCl-PBST稀释液系列稀释的待检血清，用所测得的OD值按下述公式计算P/N值：
P/N值=（被检血清OD值-空白对照OD值）/（阴性血清OD值-空白对照OD值）。
1.6 交叉性试验 按1.5项下ELISA操作步骤，用AIV、IBV、EDSV、IBDV、ILTV阳性鸡血清取代NDV血清做交叉试验，测定OD值。
1.7 鸡血清ELISA效价的测定 以P/N值为纵坐标，稀释倍数的自然对数为横坐标，作点图，回归分析，建立回归方程y=a+b x。结果判定，依据对健康鸡血清的检测结果，当P/N≥2.1时为阳性，P/N＜2.1时为阴性。当y=2.1（P/N=2.1）时的血清稀释度为该血清的ELISA效价（ET值）。令y= 2.1，通过方程y=a+b x求出x（即lgET），求反对数得ET。
1.8 P/N-ET相关方程的建立 按上述方法，测定不同血清样品的ET，取各血清1∶100稀释度的OD值与SPF鸡血清（1∶100）的OD值之比（即P/ N值）为横坐标，lgET为纵坐标，作点图，应用Origin7.0软件做回归分析，建立方程y=a+b x，从而建立P/N-ET法。
待检血清作1∶100稀释，在最适条件下进行ELISA试验，测其P/N值（即x），将其P/N值
带入方程y=a+b x，即可算出y（即lgET），求反对数得ET，实现定量测定。
1.9 ELISA与HI抗体检测方法的比较 血清HI效价的测定按美国“家禽改良计划”方法进行［6］。
1.10 局部抗体水平与血清抗体的比较
1.1 0.1 气管分泌抗体IgA与血清抗体的比较将AA肉鸡分为3组，A组（A1～A10分别为不同厂家NDV活疫苗免疫组）在2、10、20日龄分别免疫3次，在42日龄采血检测血清抗体，同时制备气管PBS匀浆液（1∶100，W/V）检测IgA；B组（B1～B5分别为不同厂家的NDV活疫苗免疫组）在2日龄免疫一次，10天后做血清、气管内抗体检测；C组为不免疫对照组。
1.1 0.2 卵黄抗体、胆汁抗体与血清抗体的比较同时对应检测罗曼蛋鸡血清及其卵黄（氯仿法制备）中抗体，比较血清与胆汁抗体的差异。二者均在100倍稀释下检测。
2.1 抗原最佳工作浓度的确定 不同浓度ELISA抗原包被后，从图1可看出，在5～80倍系列稀释ELISA抗原，随着包被量的变化，OD值呈降低趋势。本试验确定NDV的包被量为2μg/
孔。
2.2 血清稀释度的选择 不同稀释度下检测10份鸡血清的P/N值变化见图2。
由图2看出，在12.5～400倍稀释时，各血清P/N值与血清的稀释度呈明显的剂量依赖关系。本试验确定100倍稀释的血清浓度为检测浓度。
2.3 交叉试验 将NDV、AIV、IBV、EDSV、ILTV、IBDV标准阳性血清分别与 NDV抗原作交叉ELISA试验，结果NDV与SPF鸡血清、异种抗血清检测OD值均低于0.18，说明该法具有较好的特异性，见表1。
2.4 鸡血清 NDV ELISA效价测定结果 不同NDV阳性血清样品效价测定回归方程参数与各血清100倍稀释所得P/N值与ET值见表2。
2.5 被检血清ET值与P/N值的关系 测定30份血清稀释100倍时的 P/N值，将其与各自的lgET作点图，求回归方程。各血清lgET与P/N值的关系见图3。所得ET检测的回归方程：
y=0.941 28 x+0.206 77，r=0.981 63。
2.6 ELISA检测与HI检测结果比较 分别取数份血清测定其HI效价，并与各样品所测定ET值进行比较，结果见表3。
由表3可知，所建立的检测NDV抗体水平的ELISA法的敏感性是常规HI法的3倍以上。
2.7 局部抗体水平与血清抗体的比较
2.7.1 卵黄抗体与血清抗体的比较 同时对应检测罗曼蛋鸡血清及其卵黄中抗体，结果（图4）表明，卵黄抗体与血清抗体呈明显的相关性，滴度也相当。
2.7.2 气管分泌抗体IgA与血清抗体的比较 结果见图5。结果表明，A组经多次免疫后，血清与气管内抗体水平趋势一致，相关性较好（A3未检测到IgA），气管局部抗体水平升高；而B组经一次免疫后，局部抗体比血清抗体低，差别较大。
