免疫荧光(24孔板)
1) 处理盖玻片:75%乙醇浸泡10min,酒精灯上过火。 2) 铺无菌盖玻片于24孔板,铺入一定密度的细胞(5×104/孔) 3) 细胞贴壁后转染,6~8h后换液,2d后收样
4) 细胞上清吸去,用PBS洗一次,500uL/孔
5) 微电解填料
固定:4%多聚甲醛(现配现用:1.6g溶于40mL去离子水,50uL 10mM NaOH促溶,NaOH勿多加,否则影响固定效果)500ul/孔,常温避光15min 6) 电压互感器柜PBS洗3次,500ul/孔,每次3min,摇床
7) 通透:PBST(PBS+0.3%TritonX100) 500ul/孔,通透10min
8) PBS洗3次,2mL/孔,每次3min,摇床
9) 羊血清封闭1h:把一张封口膜拉平固定在细胞培养板盖上,每点30μl 左右羊血清。用弯针 头将铺有细胞的盖玻片掀起,镊子夹住,细胞面朝下盖在滴有封闭液的膜上,放入湿盒。
10) 将盖玻片按原孔放回24孔板中,细胞面朝上,PBS洗3次,500uL/孔,每次3min,摇床
11) 加一抗反应1h,事先用2%BSA以1:200稀释(每孔30μL左右,一抗浓度根据不同抗体反应性不同预先确定)。一抗孵育方法与封闭相同,一抗反应1h。(以下所有反应都在湿盒中,方法同上) 12) 双顶置凸轮轴PBS洗3次,1mL/孔,每次3min,摇床
13) 升降机构加二抗反应30min,避光湿盒。二抗现配,不重复使用。GAM-FITC 用2%BSA以1:500稀释,二抗孵育方法同一抗。
14) PBS洗3次,2mL/孔,每次3min,摇床避光
粉底原料15) DAPI核染,避光5min(用PBS以1:2000稀释),孵育方法同一抗。
16) PBS洗3次,2mL/孔,每次3min,摇床避光
17) 封片:将封片剂(4℃冰箱 棕小瓶)25μl 左右滴于擦净的载玻片上,盖上有细胞的盖玻片(细胞面向下,注意不要产生气泡),尽量吸净多余的封片剂使盖玻片不滑动,指甲油封闭边缘,避光晾干。
18) 荧光显微镜观察
手机受话器19) 拍照