目录
污水填料引言 (1)
第一章材料与方法 (3)
1.1 实验材料 (3)
1.1.2 主要试剂及耗材 (3)
1.1.3 主要试剂配制方法 (3)
1.1.4 主要仪器 (5)
1.2 研究方法 (5)
1.2.1 细胞培养及传代 (5)
1.2.2 细胞冻存与复苏 (6)
1.2.3 细胞干预与分组 (6)
1.2.4 倒置显微镜下观察肾小管上皮细胞形态 (6)
红外扫描仪1.2.5 Real-time PCR法检测HK-2细胞α-SMA、TGF-β1、FN mRNA的表达 (6)
1.2.6 Western blot法检测HK-2细胞α-SMA、TGF-β1、FN 蛋白的表达 (9)
1.2.7 ELISA法检测HK-2细胞上清液中TGF-β1的表达 (11)
1.2.8 统计学分析 (12)
第二章实验结果 (13)
1. SCF对HK-2细胞形态学变化的影响 (13)
2. SCF对HK-2细胞α-SMA、TGF-β1、FN mRNA的表达水平的影响 (13)
3. SCF对HK-2细胞α-SMA、TGF-β1、FN 蛋白的表达水平的影响 (14)
4. SCF对HK-2细胞上清液中TGF-β1分泌的影响 (16)
电镀马赛克第三章讨论 (17)
第四章结论 (20)
参考文献 (21)
综述参考文献 (31)
中英文对照名词表 (35)
攻读学位期间的研究成果 (36)
致谢 (37)
学位论文独创性声明和学位论文知识产权权属声明 (38)
引言
2012年，我国慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）流行病学研究发现，我国成年人慢性肾脏病的患病率高达10.8%，且呈逐年上升趋势；而其知晓率仅为12.5%[1]。慢性肾脏病患者常常合并骨矿物质代谢紊乱、心脑血管疾病、贫血等全身多器官系统的并发症；美国的一项前瞻性研究[2]证实，慢性肾脏病与卒中发生的风险增加相关。Zhang等[3]研究发现，合并慢性肾脏病的妊娠期妇女，其发生先兆子痫、早产儿、低体重儿或胎儿死亡等不良妊娠结局的风险比肾功能正常的妊娠期妇女明显增高。目前慢性肾脏病的发病机制尚不明确，但多项研究证实，在肾脏疾病进展中，肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)与慢性肾功能不全的进程关系密切，且肾小管间质病变比肾小球病变更有意义[4,5]。因此，明确肾小管间质纤维化机制，并有效预防或延缓其发生发展具有非常重要的科研及社会意义。
肾间质纤维化是多种细胞、细胞因子、炎性介质、趋化因子等共同参与、相互作用的过程。多项研究报道显示[6,7]，肾小管上皮-间充质转分化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）、细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）过度沉积、转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）等促纤维化因子的过表达均在肾间质纤维化过程中发挥重要作用。
转分化是指在一定的病理生理条件下，一种已分化成熟的细胞类型转变为其他细胞类型的过程，主要涉及胚胎发育[8]、肿瘤的浸润与转移[9,10]以及组织纤维化[11,12]。肾小管上皮细胞转分化的发生发展主要涉及以下四个方面：1.细胞极性消失。2.细胞间紧密连接消失。E-cadherin的表达和小管上皮基
底膜的完整性在维持肾小管上皮细胞极性和结构完整性方面发挥着重要作用。当转分化发生时，E-cadherin表达下调，基底膜出现断裂，细胞间极性和紧密连接消失。3.表达波形纤维蛋白（Vimentin）。肾小管上皮细胞转分化发生时细胞骨架肌动蛋白微丝将重新组合，细胞特异性中间纤维蛋白表达减少甚至消失，而Vimentin表达上调。4.表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。在正常肾脏组织中，α-SMA仅见于平滑肌源性细胞；在病理情况下，肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞等间质细胞可被激活并表达α-SMA，进而由间质细胞转化为肌成纤维细胞，最终可通过促进ECM沉积等途径参与纤维化的发生发展[13]。目前认为，E-cadherin表达减少和/或α-SMA表达增加是肾小管上皮细胞转分化的重要标志。多项研究证实，转分化与ECM沉积可以相互作用，共同促进肾间质纤维化的进程[14]。
TGF-β1[15]是目前公认的促纤维化因子，在肾小球硬化、肾小管间质纤维化的发生发展进程中发挥了重要作用，目前考虑其促纤维化作用是通过促进转分化及ECM大量沉积等途径实现。近年研究证实，瘦素、肥大细胞、骨形成蛋白-7（BMP-7）等均可促进TGF-β1表达[16,17]。
引言
研究表明，SCF是一种新型多功能细胞因子，可以通过与c-kit受体结合促进肝脏、肾脏、心脏、大脑组织重构或纤维化[18,19]。Ding L等[20]研究证实，SCF 参与招募骨髓祖细胞，后者可通过促进肺肌
成纤维细胞的分化，促进肺纤维化的进展。文献报道及本课题组的前期研究均证实[21-23]，SCF在狼疮性肾炎、ANCA 相关性肾炎、高血压肾病等多种慢性肾脏病患者肾组织中表达增加，且其表达量与肾间质纤维化程度相关，但具体机制尚不明确。Luo J等[18]研究发现，SCF可与肥大细胞的c-kit受体结合，使局部的肥大细胞大量聚集，激活并释放多种介质，促进EMT，上调α-SMA、纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ型胶原蛋白（COL-1）表达，从而间接参与间质纤维化。Marech等[24]研究已证实，正常人肾小管上皮细胞中也存在c-kit受体，提示SCF可能通过与其受体结合直接作用于肾小管上皮细胞，促使其活化、分泌促纤维化因子和细胞外基质等参与肾间质纤维化。
本研究拟用SCF刺激体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2细胞），观测HK-2细胞形态以及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和纤维粘连蛋白（FN）的mRNA和蛋白表达情况，以探讨SCF在肾间质纤维化发生发展中的作用。
可控硅触发电路
第一章材料与方法
voip网关1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞
正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）：由中山大学肾脏研究所余学清教授馈赠。
1.1.2 主要试剂及耗材
重组人干细胞因子（rhSCF）美国PeproTech公司胎牛血清（FBS）美国Gibco公司 DMEM/F12培养基美国HyClone公司双抗美国HyClone公司含EDTA的胰蛋白酶美国HyClone公司PCR引物上海生物工程公司Trizol试剂日本TaKaRa公司实时荧光定量RT-PCR试剂盒（SYBP）日本TaKaRa公司组织蛋白裂解液碧云天试剂公司
BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天试剂公司
TGF-β1ELISA试剂盒美国R&D公司
兔抗人TGF-β1抗体美国Santa Cruz公司兔抗人α-SMA抗体美国Santa Cruz公司兔抗人FN抗体美国Santa Cruz公司PVDF膜美国Millipo公司
十二烷基硫酸钠（SDS）美国Takara公司
琼脂糖美国Sigma公司
细胞培养皿美国Corning公司
15ml、50ml一次性离心管，1.0ml、1.5ml EP管，
10ul、200ul、1000ul吸头等一次性实验材料美国Corning公司1.1.3 主要试剂配制方法
（1）含10%FBS的DMEM/F12培养基：
FBS10ml
DMEM/F12培养液90ml
密封，4℃贮存备用；
第一章材料与方法
（2）PBS缓冲液(pH7.4)：
NaCl8g
KCl0.2g
Na2HPO4·H2O1.56g
KH2PO40.2g
溶解至900ml灭菌蒸馏水，PH调节至7.4后，用灭菌蒸馏水定容至1000ml，分装后高压蒸汽灭菌（注意高压消毒后补充蒸发掉的水份时，需用灭菌蒸镏水），4℃贮存备用；
（3）细胞冻存液：
DMSO 1ml
FBS 9ml
现配现用；
（4）DEPC处理水：
灭菌蒸馏水100ml
DEPC 100ul
120℃高压消毒30分钟；
（5）2%琼脂糖凝胶：
琼脂糖0.8g
电泳缓冲液50ml
混匀并煮沸，加5ul GelRed
（6）电泳缓冲液：
Tris 3g
Gly 14.4g
SDS 1g
加超纯水充分搅拌溶解，定容至1L（室温保存）；
（7）电转缓冲液：
Tris 3g
Gly 14.4g
加超纯水充分搅拌溶解，定容至800L，加入甲醇200ml，充分溶解（室温保存）；
（8）考马斯亮蓝染液：
甲醇45ml
超纯水45ml
离子风机aryang冰乙酸10ml
考马斯亮蓝R-250 0.25g；
（9）丽春红染液：
