3D细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片及制备方法

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3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片及制备方法
技术领域
1.本发明涉及高通量3d细胞制备与药物药效评价方法，尤其涉及一种3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片及其制备方法。

背景技术：

2.目前化疗是癌症最常用的方法，通常会给患者带来许多副作用，因此化疗药物的临床前药效和副作用的早期评价对于药物开发具有重要意义。在药物开发周期中，临床前药物评价主要有细胞实验和动物实验，其中细胞实验较动物实验操作更为简便，经济实惠。
3.微流控芯片主要优点有消耗试剂量少、通量高、样本需求量少等，其非常适合与细胞培养相结合实现高通量药物评价。在已发表的文献及公开的技术中已经实现运用微流控芯片对2d细胞进行高通量药物评价。如中国专利cn101629143b公开了一种用于高通量药物筛选的微流控细胞阵列芯片、制备方法及应用。所述的芯片从上向下依次为阀控制通道层，流体通道层和适合细胞贴壁生长的玻璃层。该芯片可用于不同浓度药物并行作用多种细胞，进行高通量细胞药物筛选。所述的芯片采用多次曝光，一次显影的su-8负性光刻胶工艺以及多层pdms键合，制作了具有高深宽比的多层结构的芯片。本发明提供的微流控细胞阵列芯片可以实现低试剂消耗、高通量的多种细胞共培养，并行分析不同药物浓度对不同细胞的刺激作用及其在片的实时观察与检测。其中运用微阀技术实现了多种2d细胞共培养进行不同药物浓度梯度的药物筛选。但2d细胞缺乏三维微环境，无法准确反映药物对于在体细胞的作用情况。在一些运用2d细胞进行药物开发的过程中会存在细胞实验表现出了良好药效，但动物实验时药效不佳的情况。
4.针对二维细胞与在体差异较大的问题，近年来采用三维培养的细胞进行药物筛选以减少细胞实验与在体细胞之间的差异。通常三维细胞的培养有多孔板培养法，悬滴培养法及离心培养法等，这些方法操作繁琐，效率低且只能测试单一种类的三维细胞球为目标的体外细胞药物评价实验，无法模拟实际给药时药物经过多个器官的药物作用。因此，在药物筛选领域，急需一种结合微流控芯片的优势，能简便、高通量制备三维细胞，且评估药物流经多器官给药药效评价的装置及方法。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片及制备方法，该药物高通量评价微流控芯片可自由组合并批量构建多种由细胞系或者类器官构成的体外药物评价模型，并可同时进行多种药物或者不同药物浓度梯度的药物评价测试。
6.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
7.一种3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片，其从上至下依次
包括pdms微阀控制层、pdms薄膜流路腔室层和pdms微槽层；
8.所述的pdms微阀控制层内设有多个横向压力阀和多个纵向压力阀；横向压力阀和纵向压力阀交叉排列设置；横向压力阀和纵向压力阀通过向下层的薄膜流路腔室层输出压力进行开闭控制；
9.所述的pdms薄膜流路腔室层内设有多条横向流路和与多个纵向流路，横向流路的两端分别与药物进液口和药物出液口连通，纵向流路的两端分别与细胞进样口和细胞出样口连通；横向流路与纵向流路交错处形成培养腔室；
10.所述的pdms微槽层内设有与培养腔室一一对应的微槽。
11.优选地，所述的横向流路的入口依次通过进液除泡微柱和进药除泡腔室与药物进液口连通，纵向流路的入口通过细胞均匀微柱与细胞进样口连通。
12.优选地，所述的横向压力阀设有4个，纵向压力阀设有5个，横向压力阀的压力入口和纵向压力阀的压力入口均设于pdms微阀控制层的上表面，每个横向压力阀由5个横向微阀排列组成，每个纵向压力阀由4个纵向微阀组成；所述横向微阀的尺寸长1-4mm，宽1-2mm，纵向微阀的尺寸为长1-5mm，宽1-2mm。
13.优选地，所述的pdms微阀控制层通过输入气压或液压控制。
14.优选地，所述药物进液口的内径为0.7-2mm，药物出液口的内径为0.7-2mm，细胞进样口的内径为0.7-2mm，细胞出样口的内径为0.7-2mm，进液除泡微柱的内径为0.05-0.3mm，细胞均匀微柱的内径为0.1-0.3mm，培养腔室的尺寸为长2-3mm，宽2-3mm，横向流路的宽度为0.1-1mm，纵向流路的宽度为0.1-1mm。
15.优选地，每个微槽阵列包括19个微槽，微槽的的直径为0.15-0.5mm，深度为200-600mm。
16.一种3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片的制备方法，其特征是，其包括以下步骤：
17.pdms微阀控制层制备：将硅片用氧等离子体预处理清洗，在清洗过后的硅片上旋凃一层负性光刻胶，将旋凃了光刻胶的硅片真空处理以去除胶体内部的气泡；将去除气泡后的样品放置于热板机上进行前烘烤；将前烘烤后的样品放置于紫外曝光机样品盘中，将含有微阀控制层微结构图案的掩膜装载于掩膜支架上，调整样品与掩膜相对位置并升高样品至与掩膜接触后进行紫外曝光；将紫外曝光后的样品放置于热板机上进行后烘烤；将后烘烤之后的样品浸没于显影剂中直至微阀的微结构出现后清洗样品；将pdms混合溶液倒至上述制备好的硅片模具之中，加热固化后从模具中剥离，切割并于各个控制输入口打孔，获得pdms微阀控制层；
18.pdms薄膜流路腔室层制备：将硅片用氧等离子体预处理清洗，在清洗过后的硅片上旋凃正性光刻胶，将旋凃了光刻胶的硅片真空处理以去除胶体内部的气泡；将去除气泡后的样品放置于热板机上进行前烘烤；将前烘烤后的样品放置于紫外曝光机样品盘中，将含有流路腔室层微结构图案的掩膜装载于掩膜支架上，调整样品与掩膜相对位置并升高样品至与掩膜接触后进行紫外曝光；将紫外曝光后的样品放置于热板机上进行后烘烤；将后烘烤之后的样品浸没于显影剂中直至流路腔室的微结构出现后清洗样品；将上述样品放至温度适宜的热板机上进行加热软化微结构；将pdms混合溶液旋凃于上述制备好的硅片样品上，加热固化后获得pdms薄膜流路腔室层；
19.pdms微槽层制备：将硅片用氧等离子体预处理清洗，在清洗过后的硅片上旋凃负性光刻胶，将旋凃了光刻胶的硅片真空处理以去除胶体内部的气泡；将去除气泡后的样品放置于热板机上进行前烘烤；将前烘烤后的样品放置于紫外曝光机样品盘中，将含有微槽层微结构图案的掩膜装载于掩膜支架上，调整样品与掩膜相对位置并升高样品至与掩膜接触后进行紫外曝光；将紫外曝光后的样品放置于热板机上进行后烘烤；将后烘烤之后的样品浸没于显影剂中直至微槽的微结构出现后清洗样品；将pdms混合溶液倒至上述流程制备好的硅片模具之中，加热固化后从模具中剥离，获得pdms微槽层。
20.多层pdms键合组成高通量药物评价微流控芯片：将pdms微阀控制层与仍处于模具上的pdms薄膜流路腔室层同时进行氧等离子处理；将pdms微阀控制层与仍处于模具上的pdms薄膜流路腔室层对准键合，随后将两层样品从模具上剥离并将流路腔室层的入口和出口打孔；将上述键合后样品与pdms微槽层同时进行氧等离子处理，随后对准键合。
21.优选地，流路出入口及微阀控制源入口插入钢针并连接软管。
22.本技术与现有技术相比，至少具有以下明显优点和效果：
23.本发明的高通量药物评价微流控芯片，可以通过内部微阀隔离各个腔室，同时把液路改变成细胞进样和药物进液两种不同模式。在进样模式下，培养腔室底部的高通量微槽阵列可使根据不同流路注入的不同细胞沉积并聚团成3d细胞球或类器官，从而构建用于体外口服药物高通量药物评价多种3d细胞球模型；在进液模式下，可同时注入不同药物或不同药物浓度，高效完成多种药物维度筛查。
附图说明
24.图1为本发明中的高通量药物评价微流控芯片整体外观示意图；
25.图2为本发明中的高通量药物评价微流控芯片整体透视示意图；
26.图3为本发明中pdms微阀控制层结构示意图；
27.图4为本发明中pdms薄膜流路腔室层结构示意图；
28.图5为本发明中pdms微槽层结构示意图；
29.图6为本发明根据一个或多个实施方式制备的3d细胞球。
30.示意图中的标注说明：
31.1-pdms微阀控制层；2-pdms薄膜流路腔室层；3-pdms微槽层；4-横向压力阀；5-纵向压力阀；6-横向流路；7-纵向流路；8-药物进液口；9-药物出液口；10-细胞进样口；11-细胞出样口；12-培养腔室；13-微槽阵列；14-横向微阀；15-纵向微阀；16-进液除泡微柱；17-进药除泡腔室；18-均匀微柱。
具体实施方式
32.为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
33.参照图1和图2，本实施例涉及一种3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片，其从上至下依次包括pdms微阀控制层1、pdms薄膜流路腔室层2和pdms微槽层3；
34.所述的pdms微阀控制层1内设有多个横向压力阀4和多个纵向压力阀5；横向压力
阀4和纵向压力阀5交叉排列设置；横向压力阀4和横向压力阀5通过向下层的pdms薄膜流路腔室层2输出压力进行开闭控制；
35.所述的pdms薄膜流路腔室层2内设有与多条横向流路6和与多条纵向流路7，横向流路6的两端分别与药物进液口8和药物出液口9连通，纵向流路7的两端分别与细胞进样口10和细胞出样口11连通；横向流路6与纵向流路7交错处形成培养腔室12；pdms薄膜流路腔室层2主要提供细胞进样及药物进液的流入流出口以及3d细胞培养的腔室，
36.所述的pdms微槽层3内设有与培养腔室12一一对应的微槽阵列13，用于提供细胞沉积并聚团成3d细胞球的高通量。所述的pdms微阀控制层1、pdms薄膜流路腔室2层及pdms微槽层3分别制备完成后用氧等离子体键合成为高通量药筛微流控芯片。
37.如图3所示，为本实施例中的pdms微阀控制层1，所述的横向压力阀4设有4个，纵向压力阀5设有5个，横向压力阀4的压力入口和纵向压力阀5的压力入口均设于pdms微阀控制层1的上表面，每个横向压力阀4的压力入口控制5个横向微阀14，每个纵向压力阀5的压力入口控制4个纵向微阀15；所述横向微阀14的尺寸为3.1x1 mm，纵向微阀15的尺寸为4.1x1 mm。横向微阀14和纵向微阀15的控制可以由气压或液压完成，控制气压采用300-500mbar，纵向控制阀压力入口5可控制4个纵向微阀。横向微阀14和纵向微阀15的横纵排列组成阵列结构。本实施例中共包含横向微阀14和纵向微阀15各20个，分别位于每个培养腔室12的左右及上下，用于改变流经培养腔室12的液路。
38.如图4所示，为本实施例中的pdms薄膜流路腔室层2，pdms薄膜流路腔室层2共有4条纵向流路7为细胞进样流路，4条横向流路6为药物进样流路，共计16个培养腔室12。所述的横向流路6的入口依次通过进液除泡微柱16和进药除泡腔室17与药物进液口8连通，纵向流路7的入口通过细胞均匀微柱18与细胞进样口10连通。所述药物进液口8的内径为1mm，药物出液口9的内径为1mm，细胞进样口10的内径为1mm，细胞出样口11的内径为1mm，进液除泡微柱16的内径为0.1mm，细胞均匀微柱18的内径为0.2mm，培养腔室12的尺寸为2.7x2.7mm，横向流路6的宽度为0.3mm，纵向流路7的宽度为0.3mm。
39.如图5所示为本实施例中的pdms微槽层，其包含16个微槽阵列13，每个微槽阵列13包含19个直径为0.25mm，深度为200mm的微槽。
40.实施例2
41.本实施例涉及一种于药物高通量评价的3d细胞集成阵列微流控芯片的制备方法，其包括模具加工及倒模键合两个部分。
42.模具加工步骤具体包括：
43.(1)微阀控制层：用压缩空气清洁一个4英寸的硅片，然后在硅片中心涂抹2-3ml负性光刻胶su8-3025，并以500rpm,10秒以及1200rpm,30秒的旋凃速率以实现60μm的涂层厚度。在95℃的热板机上进行15分钟的前烘。然后将硅片移动到紫外曝光掩模对准器的卡盘上，通过控制层掩模进行曝光，总能量沉积为250mj。然后在65℃下进行1分钟及在95℃下进行5分钟的后烘。然后将硅片直接浸入su-8显影剂中约8分钟，直到出现明显的微观结构；
44.(2)薄膜流路腔室层：采用az40xt-11d光刻胶，以500rpm，10s；2000rpm，30s的旋凃速率以达到35μm涂层厚度。将硅片置于125℃的热板机上7分钟完成前烘步骤，然后用总能量为400mj的剂量对样品进行曝光。在105℃下进行1分钟后烘。随后，样品在室温下静置10分钟后直接浸入az300mif显影剂中显影，直到出现微结构。样品干燥后将其移至热板机上，
在125℃下使微结构软化3分钟。
45.(3)微槽层：采用su8-2075光刻胶，以500rpm，10s；1200rpm，40秒的旋凃速率达到220μm的涂层厚度。将硅片放置于65℃的热板机上7分钟，然后放置到95℃的热板机上45分钟完成前烘步骤，随后以350mj的能量曝光样品。随后的后烘步骤为在65℃下烘烤5分钟，在95℃下烘烤15分钟。最后用su8显影剂显影约17分钟完成微槽层模具的制作。
46.倒模键合的加工步骤具体如下：
47.以10:1的固化剂比例制备44g pdms，然后将其倒入微阀控制层模具上，以相同固化剂比例将30g pdms倒入微槽层模具上。然后将10g的20:1固化剂比例的pdms倒到薄膜流路腔室层模具上分别以500rpm，10s；1500rpm，10s的转速进行pdms旋凃。对于微阀控制层和微槽层，将pdms连同模具放入烘箱在80℃下烘烤1.5h以完全固化。对于薄膜流路腔室层，将pdms连同模具放入烘箱在80℃下烘烤20分钟以完全固化。固化pdms后，将pdms从三层模具上剥离出来，随后用0.75mm直径的打孔器进行打孔。随后将三层pdms按照之前的设计利用氧等离子体进行键合。键合完毕后打孔处插入0.6x0.9mm尺寸的钢针完成一块药筛微流控芯片的倒模键合。
48.在本实施例中，多种细胞进样培养成3d细胞球首先用1％质量体积比的pluronic-f127通入芯片后室温下静置过夜以完成芯片低黏附处理以促进沉积的细胞聚团成3d细胞球。
49.将药筛微流控芯片用pbs清洗后，将微阀切换至纵向细胞进样模式，随后将将培养好的肠细胞系fhs 74int、肝脏细胞系thle-2、心肌细胞系hl-1及a549癌细胞系制备成细胞悬液后，用注射泵以1μl/m的流速将细胞悬液通入芯片，细胞会在重力作用下落入微槽中。完成进样后将微阀切换至横向流动状态，以10μl/h的流速进行培养基灌注培养。
50.细胞经过三天的灌注培养会聚团成3d细胞球如图6所示，由此构建由小肠、肝、心肌、目标肺癌细胞的模拟口服抗癌药物的多种3d细胞球体外药筛模型。
51.对于建立的多种3d细胞球体外药筛模型，使用顺铂，培美曲塞和吉西他滨进行为期2天的药物灌注，随后进行活死荧光染以评估多种抗癌药物对于不同器官的副作用及对于目标癌细胞的药效，或者采用不用浓度的同种药物进行不同药物浓度的副作用及药效同时测试评估。
52.上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

技术特征：

1.一种3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片，其特征在于，其从上至下依次包括pdms微阀控制层、pdms薄膜流路腔室层和pdms微槽层；所述的pdms微阀控制层内设有多个横向压力阀和多个纵向压力阀；横向压力阀和纵向压力阀交叉排列设置；横向压力阀和纵向压力阀通过向下层的pdms薄膜流路腔室层输出压力进行开闭控制；所述的pdms薄膜流路腔室层内设有多条横向流路和与多条纵向流路，横向流路的两端分别与药物进液口和药物出液口连通，纵向流路的两端分别与细胞进样口和细胞出样口连通；横向流路与纵向流路交错处形成培养腔室；所述的横向流路的入口依次通过进液除泡微柱和进药除泡腔室与药物进液口连通，纵向流路的入口通过细胞均匀微柱与细胞进样口连通；所述的pdms微槽层内设有与培养腔室一一对应的微槽阵列。2.根据权利要求1所述的3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片，其特征在于，所述的横向压力阀设有4个，纵向压力阀设有5个，横向压力阀的压力入口和纵向压力阀的压力入口均设于pdms微阀控制层的上表面，每个横向压力阀由5个横向微阀排列组成，每个纵向压力阀由4个纵向微阀组成；所述横向微阀的尺寸长1-4mm，宽1-2mm，纵向微阀的尺寸为长1-5mm，宽1-2mm。3.根据权利要求1所述的3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片，其特征在于，所述的pdms微阀控制层通过输入气压或液压控制。4.根据权利要求1所述的3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片，其特征在于，所述药物进液口的内径为0.7-2mm，药物出液口的内径为0.7-2mm，细胞进样口的内径为0.7-2mm，细胞出样口的内径为0.7-2mm，进液除泡微柱的内径为0.05-0.3mm，细胞均匀微柱的内径为0.1-0.3mm，培养腔室的尺寸为长2-3mm，宽2-3mm，横向流路的宽度为0.1-1mm，纵向流路的宽度为0.1-1mm。5.根据权利要求1所述的3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片，其特征在于，每个微槽阵列包括19个微槽，微槽的的直径为0.15-0.5mm，深度为200-600mm。6.一种如权利要求1-5中任一所述的3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片的制备方法，其特征是，其包括以下步骤：pdms微阀控制层制备：将硅片用氧等离子体预处理清洗，在清洗过后的硅片上旋凃一层负性光刻胶，将旋凃了光刻胶的硅片真空处理以去除胶体内部的气泡；将去除气泡后的样品放置于热板机上进行前烘烤；将前烘烤后的样品放置于紫外曝光机样品盘中，将含有微阀控制层微结构图案的掩膜装载于掩膜支架上，调整样品与掩膜相对位置并升高样品至与掩膜接触后进行紫外曝光；将紫外曝光后的样品放置于热板机上进行后烘烤；将后烘烤之后的样品浸没于显影剂中直至微阀的微结构出现后清洗样品；将pdms混合溶液倒至上述制备好的硅片模具之中，加热固化后从模具中剥离，切割并于各个控制输入口打孔，获得pdms微阀控制层；pdms薄膜流路腔室层制备：将硅片用氧等离子体预处理清洗，在清洗过后的硅片上旋凃正性光刻胶，将旋凃了光刻胶的硅片真空处理以去除胶体内部的气泡；将去除气泡后的样品放置于热板机上进行前烘烤；将前烘烤后的样品放置于紫外曝光机样品盘中，将含有流路腔室层微结构图案的掩膜装载于掩膜支架上，调整样品与掩膜相对位置并升高样品至
与掩膜接触后进行紫外曝光；将紫外曝光后的样品放置于热板机上进行后烘烤；将后烘烤之后的样品浸没于显影剂中直至流路腔室的微结构出现后清洗样品；将上述样品放至温度适宜的热板机上进行加热软化微结构；将pdms混合溶液旋凃于上述制备好的硅片样品上，加热固化后获得pdms薄膜流路腔室层；pdms微槽层制备：将硅片用氧等离子体预处理清洗，在清洗过后的硅片上旋凃负性光刻胶，将旋凃了光刻胶的硅片真空处理以去除胶体内部的气泡；将去除气泡后的样品放置于热板机上进行前烘烤；将前烘烤后的样品放置于紫外曝光机样品盘中，将含有微槽层微结构图案的掩膜装载于掩膜支架上，调整样品与掩膜相对位置并升高样品至与掩膜接触后进行紫外曝光；将紫外曝光后的样品放置于热板机上进行后烘烤；将后烘烤之后的样品浸没于显影剂中直至微槽的微结构出现后清洗样品；将pdms混合溶液倒至上述流程制备好的硅片模具之中，加热固化后从模具中剥离，获得pdms微槽层；多层pdms键合组成高通量药物评价微流控芯片：将pdms微阀控制层与仍处于模具上的pdms薄膜流路腔室层同时进行氧等离子处理；将pdms微阀控制层与仍处于模具上的pdms薄膜流路腔室层对准键合，随后将两层样品从模具上剥离并将流路腔室层的入口和出口打孔；将上述键合后样品与pdms微槽层同时进行氧等离子处理，随后对准键合。7.根据权利要求6所述的3d细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片的制备方法，其特征在于，流路出入口及微阀控制源入口插入钢针并连接软管。

技术总结

本发明公开了一种3D细胞自动化培养与多维度药效评价的高通量微流控芯片及制备方法，其从上至下依次包括PDMS微阀控制层、PDMS薄膜流路腔室层和PDMS微槽层；所述的PDMS微阀控制层内设有多个横向压力阀和多个纵向压力阀；横向压力阀和纵向压力阀交叉排列设置；所述的PDMS薄膜流路腔室层内设有多条横向流路和与多个纵向流路，横向流路的两端分别与药物进液口和药物出液口连通，纵向流路的两端分别与细胞进样口和细胞出样口连通；横向流路与纵向流路交错处形成培养腔室；所述的PDMS微槽层内设有与培养腔室一一对应的微槽本发明构建的高通量药筛微流控芯片可以快速高通量搭建多种3D细胞球体外药筛模型并同时完成多种药物的测试。测试。测试。