3、结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 1）离子键结合法：
通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法
所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2）共价键结合法
载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：
（1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；
（2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等
（3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：
Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：
（1）重氮化法
（2）叠氮法
（3）溴基化法
（4）烷基化法等。
4、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法
借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2， 0发布任务℃下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法
共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，
可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。
5、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。
只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。
压屏机严格控制加热温度和时间。
细胞的固定化方法
(1) 吸附法
利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。
用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。
(2) 包埋法
包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。
凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。
凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。
固定化酶的新方法
1、新型固定化材料的应用
2、（多酶系统）共固定化技术
3、基因工程重组菌的固定化技术
4、定向固定化新技术
大型设备包装箱新型固定化材料
随着材料科学迅速发展，固定化酶的新材料日益增多；如藻酸铬代替藻酸钙固定化米曲霉β-葡萄糖苷酶，稳定化大为提高；戊二醛硬化后的藻酸盐和明胶；丙烯酸大孔树脂，磁性载体等。
共固定化
共固定化技术已经广泛应用，有酶-酶、酶-辅酶、酶-细胞、细胞-细胞共固定化于同一载体上，例如共包埋于同一凝胶内，参与两步以上的酶催化反应。
基因工程重组菌的固定化技术
重组菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有很大提高。
在游离重组菌系统中常用抗生素、氨基酸等选择性压力稳定质粒，在大规模生产应用中因费用太高往往难以接受。
采用固定化方法后，这种选择压力可被省去。
定向固定化技术
固定化酶的存在问题：由于酶蛋白可以通过几种氨基酸残基附着在固定化载体上，酶和载体可以产生多点的结合，因固定化酶的位阻障碍而妨碍底物进入酶的活性中心，严重影响酶活力。 近来，已经寻求到几条不同途径，使酶蛋白能够以有序方式附着在载体的表面，实现酶的定向固定化，使酶在载体表面按一定的方向排列，使它的活性位点面朝固体表面的外侧排列，这样就能有利于底物进入到酶的活性位点里去，而使酶活性的损失降到最小。
酶的定向固定化方法
定向固定化方法主要有：
（1）借助化学方法的位点专一性固定化；
（2）磷蛋白的位点专一性固定化；
（3）糖蛋白的位点专一性固定化；
（4）抗体（免疫球蛋白）的位点专一性固定化；
（5）利用基因工程的位点专一性固定化等等。
这种有序、定向的固定化技术已经应用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究。
第二节 固定化酶的特性
一、固定化酶的特性
影响酶催化活性的因素
1. 构象改变或立体屏蔽以及微扰
2. 分配效应和扩散限制效应
（一）酶的活性
通常低于天然酶（有例外）。
（二）酶的稳定性
固定化后，一般来说酶的热稳定性、贮藏稳定性和使用稳定性普遍增加。
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。
可能的原因：
固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；
抑制酶的自身降解。
固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。
（三）酶的最适温度
最适温度与酶稳定性有关。
多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。
（四）酶的最适pH
将酶固定于多聚阳离子性载体上时，最适pH向酸性一侧移动；将酶固定于多聚阴离子性载体上时，最适pH向碱性一侧移动；
酶催化的产物为酸性时，固定化酶的最适pH将升高；反之产物为碱性时，固定化酶的最适pH将降低。
（五）酶的动力学特征
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。
固定化载体与底物电荷相反，促进底物扩散，固定化酶的表观Km值降低。
固定化载体与底物电荷相同，有扩散阻力，固定化酶的表观Km值显著增加。
（六）底物特异性
酶固定化后，由于形成立体障碍，当底物为高分子时，高分子底物难以接近酶分子。固定化酶对大分子底物作用速度降低。
小分子底物不受影响。
二、固定化酶的酶活力测定
1、常用的酶活测定方法：
振荡测定法
酶柱测定法
连续测定法
2、固定化酶的比活力单位定义
在固定化酶中，一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。即：为每克干
重固定化酶每分钟转化底物(或生成产物)的μmol量，表示为μmol/(min·mg)。
若是固定化酶膜、酶管、酶板，则可用单位面积的酶活力单位表示，即酶活力单位/cm2。
需注明测定条件：温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件、用于固定化的游离酶含量或蛋白质含量、及用于固定化的游离酶的比活力。
3、固定化酶的评价指标及其测定
主要指标：固定化酶的活力，结合效率或相对活力，半衰期等。
另外，载体活化程度和固定化配基密度等也是固定化常用的考察指标 。
酶结合效率、相对活力和活力回收
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酶结合效率或相对活力用以表示固定化过程中引起的酶失活，以及影响固定化酶性质诸因素的综合效应。
酶结合效率 = (加入的总酶活力-未结合的酶活力）
÷ 加入的总酶活力× l00%
相对活力 = 固定化酶总活力 ÷(加入的总酶活力-未
结合的酶活力) × 100%
酶活力回收率 = 固定化酶总活力 ÷用于固定化的总
酶活力 × l00%
固定化酶的半衰期t1/2
半衰期是衡量固定化酶稳定性的重要指标，即固定化酶活力下降为初始活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2 表示。
直接测定
通过较短操作时间后酶活力变化，由下式推算：
在没有扩散限制时，固定化酶活力与时间成指数关系：
t1/2=0.693/Kd
Kd=2.303/t ×Log(Eo/E)
Kd：衰减常数；Eo：初始酶活；E：t时间后酶活力
t1/2=0.693/2.303×t/log(Eo/E)=0.3009×t/log(Eo/E)
第三节 固定化技术的应用
废旧电池的回收与利用
固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。
自学
第九章 酶的非水相催化
第一节 酶非水相催化的研究概况
酶只有在水溶液中才具有催化活性吗?
1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。
开辟了酶工程领域新的研究方向—非水酶学。
促进了生物催化反应的溶剂工程。
已发现有十多种水解酶和氧化还原酶在有机溶剂中具有催化活性。
非水介质：有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质、低共熔混合介质等。
拓展了酶在工业生物转化中的应用，尤其是在不对称合成转化光化学纯度的医药、农药、精细化工、新材料、手性化合物或手性模块物质方面的应用。
1、有机介质中的酶催化
有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。
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适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。
酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。
酶在有机介质中起催化作用时，酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和热稳定性等都有所改变。
2、气相介质中的酶催化
气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。
适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。
由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。
干燥状态的脱硫弧菌氢化酶可以活化氢分子，进行反应，而水质子不参于反应。
3、超临界流体介质中的酶催化
用于酶催化反应的超临界流体应具有的特性：
对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响；
良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；
超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；
超临界压力不能太高，节约压缩动力费用；
超临界流体要容易获得，价格要便宜等
4、离子液介质中的酶催化
离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。
