[收稿日期] 2010-05-05;2010-07-14修回
[基金项目] 贵州大学研究生创新基金项目/利用猪粪养殖蚯蚓与蚯蚓小肽加工利用技术开发研究0(2009003)；贵州省农业攻关计划项目 /无公害饲料添加剂的研制与产业化示范0[黔科合NZ(2007)3006]
[作者简介] 覃 麟(1983-)，女，在读硕士，研究方向：动物营养与饲料科学。E -mail: *通讯作者：施晓丽(1971-)，女，副教授，从事猪动物营养与饲料科学的研究。E -mail:shx
[文章编号]1001-3601(2010)08-0531-0160-04
Alcalase 碱性蛋白酶制备蚯蚓肽的酶解参数研究
覃麟，施晓丽*
，夏先林
(贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)
[摘 要]为解决畜禽养殖污染问题及开发蛋白质饲料资源提供理论依据，以Alcalase 碱性蛋白酶为工
具，采用单因素(温度、酶解时间、pH 值、酶用量及底物浓度比)试验考察了蚯蚓蛋白酶的酶解效果，再通过正交试验优化酶解参数。结果表明:1)单因素试验：蚯蚓蛋白水解度随酶解时间的延长而呈上升趋势,5h 后上升趋于平缓；随着温度的升高和pH 值的增大均呈先上升后下降的趋势,60e 和pH 值达8.0时达最大值；随酶用量的增加和底物浓度的增大均呈先上升后下降的趋势，酶用量超过4%和底物浓度达6%后开始下降。正交试验：酶解温度、时间、pH 和加酶量对蚯蚓蛋白的酶解度有显著或极显著的影响,4个因素作用的主次顺序为：酶用量>温度>pH >时间；最优组合为温度65e 、时间4h 、pH 值8.0、加酶量5%。Alca -lase 碱性蛋白酶制备蚯蚓小肽的最佳工艺参数为底物浓度6%、温度65e 、时间4h 、pH 值8.0、加酶量5%。 [关键词]蚯蚓；蚯蚓肽;Alcalase；酶水解[中图分类号]S852.612[文献标识码]A
Stu dy on En zymatic Technology of Earthworm Peptides Produced by Alcalase
QIN Lin,SH I Xiao -li *
,XIA Xian -lin
(College of Animal Science,Guizhou U niversity ,Guiy ang,Guizhou 550025,China)
Abstract:Enzym atic hy drolysis effect of earthw orm proteinase w as deter mined using Alcalase as t
he to ol based on different sing le factor tests,w hich included temperatur e,hy dro lysis time,pH ,enzy me dosage and substrate concentration,and the enzy matic param eters w ere optimized by the orthogo nal test to pro vide theo retical basis for so lving breeding pollution and developing protein feed resource.T he r esults show ed that the hydroly sis degr ee o f earthw orm protein r aised w ith prolong of hydroly sis time and the ascend trend w as slow 5h later,the hy dro lysis deg ree o f earthw orm pro tein fir st increased and then decreased w ith the increase o f temperature and pH and the m aximum value appeared at 60e and pH 8.0,the hydroly sis degr ee o f earthw orm protein first increased and then decr eased w ith the increase o f enzy me dosage and substr ate concentration and the hydrolysis degree o f earthw orm protein began to decline w hen enzy me dosag e and substr ate co ncentratio n w as m ore than 4%and 6%respectively,the enzy matic temperature,hydroly sis tim e,pH and enzyme dosag e all had very significant or sig nificant effect on enzy matic deg ree of ear thw orm protein and the effect w as enzym e dosage>temperature>pH >hy dro lysis tim e.T he o ptimum com bination for hydr olysis of earthw orm included 65e ,4h,pH 8.0and 5%enzy me dosage and the optimum technolog ical parameters for production o f ear thw orm peptides are 6%substr ate concentration,65e ,4h,pH 8.0and 5%enzyme dosag e.
Key words:ear thw orm ;earthwo rm peptides;Alcalase;enzym atic hydr olysis 近年来我国畜禽养殖业
有了快速的发展，但由其排放的大量粪便引起的环境污染已成为急待解决的问题。据国家环境保护总局2000年对全国23个规模化畜禽养殖场集中的省、市调查显示,1995年全国当年工业废水的化学需氧量(COD)排放总量为768.37万t，而畜禽养殖业的废弃物排放量折算成COD 为728.6万t，接近全国工业废水的COD 排放总量[1]。1999年，我国畜禽养殖废弃物的产生量约为19亿t，是工业固体废物的2.4倍[2]。2000年，全国畜禽粪便年产生量已达到约17.3亿t，是工业废弃物的2.7倍[3]。随世界各国畜禽业和水产养殖业的迅速发展，蛋白饲料已越来越不能满足养殖业发展的高要求。据统计，全球每年动物生产耗用
粗蛋白(CP)2亿t 以上，若按动物全用配合饲料计算，尚差2亿t 标准豆粕。因此，开辟蛋白质饲料的新来源及如何提高蛋白质的利用率已成为研究热点。
蚯蚓是一种杂食性的环节动物，它在自然生态中具有促进物质分解转化的功能[4-5]，其独特的生活方式和强大的消化能力为粪便生态处理提供了可行性[6-10]。同时，蚯蚓又是一种新型动物源性高蛋白
质源，蛋白质含量丰富，氨基酸平衡[11]
。研究表明,
小肽具有提高能量[12]及蛋白沉积率[13]
、提高矿物质[14]氨基酸吸收率及生理调节[15]
等营养优势，而对蚯蚓肽的研究报道较少，赵淑琳等[16]用胰蛋白酶和胃蛋白酶联合酶解制取蚯蚓肽，结果表明，利用蚯蚓为原料制备蚯蚓小肽是可能的，但所用水解酶还需
贵州农业科学 2010,38(8):160~163 Guizho u A g ricultur al Sciences
做进一步选择。考虑到酶成本问题，本试验以蚯蚓为原料，以A lcalase碱性蛋白酶为工具，筛选Alca-lase碱性蛋白酶提取蚯蚓小肽酶解条件，旨在为解决畜禽养殖污染问题及蛋白质饲料资源开发提供理论依据，同时为提高蚯蚓蛋白质利用提供理论指导。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1蚯蚓蚯蚓，贵阳花溪生态园提供。
1.1.2试剂Alcalase碱性蛋白酶，丹麦诺维信(NOVO)公司提供。
1.1.3主要仪器与设备DSY-1-2孔型恒温水浴锅，北京国华医疗器械厂;Sartorius BS210S型电子分析天
平，德国赛多利斯股份公司;PH S-3C精密pH 计，上海雷磁仪器厂；离心机，北京医用离心机厂。1.2试验设计
1.2.1单因素试验考虑对酶解试验影响的主要因素，先进行温度、酶解时间、pH值、酶用量及底物浓度比的单因素试验，拟考察温度、酶解时间、pH 值、酶用量及底物浓度比对水解度的影响，以水解度确定各因素参数的适宜范围。同时分析各因素对指标的影响大小，筛选影响最大的4个指标进行正交试验。
1)酶解时间。考察酶解时间分别为3h、4h、5h、6h、7h、8h、10h后胰蛋白酶对蚯蚓蛋白水解度的影响，其他酶解条件(根据诺维信公司推荐)：温度55e,pH值8.0，酶用量1%，底物浓度8%。
2)酶解温度。酶解时间根据以上试验结果，其他酶解条件按照诺维信推荐条件：即底物浓度8%, pH值8.0，酶用量1%。分别考察45e、50e、55e、60e、65e、70e和75e条件下水解度的差异。
3)酶解pH值。时间和温度根据以上试验结果；其他酶解条件：酶用量1%，底物浓度8%。考察pH值梯度为6.5、7.0、7.5、8、8.5、9.0时对水解度的影响。
4)酶用量。考察酶用量为1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%时水解度的变化，酶解时间、温度和pH值根据以上单因素实验结果，酶用量和底物浓度分别为1%和8%(诺维信推荐)。
5)底物浓度。考察底物浓度梯度为4%、6%、8%、10%和12%时对水解度的影响，其他酶解条件根据以上单因素实验结果。
1.2.2正交试验根据单因素试验结果，确定底物浓度为6%。再选择温度(A)、时间(B)、pH值(C)和酶用量(D)4个因素进行正交试验，按表1安排正交试验，每个试验号做3个重复。
1.3试验方法
将蚯蚓洗净后在清水中浸泡4~5h，让其尽量吐出体内的食物残渣，沥水晾干，于65e烘干，趁热粉碎，过80目筛，取部分蚯蚓粉测定总氮含量后将样品于4e下保存备用。酶解步骤如下：准确称蚯蚓粉y用蒸馏水调其浓度，使底物蛋白浓度达到所需量y用0.1mo l/L的H Cl或NaOH调节pH y加入所需酶量y酶解一定时间y100e恒温水浴锅下
表14因素正交试验设计
T able1T he or thog onal design of4factor s
序号N o.A B C D 11111
21222
31333
42123
52231
62312
73132
83213
93321
灭酶10m in y4000r/m in的高速离心机离心15min，取上清液测定其中的氨基氮含量。
1.4测定
氨基氮采用甲醛滴定法测定，总氮采用凯氏定氮法测定。微生物检查
水解度/%=(氨基氮/总氮)@100
2结果与分析
2.1不同因素对Alcalase碱性蛋白酶酶解蚯蚓蛋白效果的影响
2.1.1酶解时间从图1可知，随着时间的延长蛋白的水解度不断上升，当酶解5h以后，水解度的曲线斜率明显下降。考虑到实际生产中，时间越长能耗越大。因此，在本研究的条件下，初步确定反应时间4~5h为最适酶解时间，最佳酶解时间为5h
。
图1不同时间条件下蚯蚓蛋白的水解度Fig.1Effect o f hydro lysis t ime on hydrolysis degr ee of ear thw o rm prot ein
外墙保温用锚栓2.1.2温度从图2可知，在其他酶解条件一致的情况下，水解度随温度的上升先升高，原因可能是酶于最适温度下随温度升高，反应物的能量增加，单位时间内分子间的有效解除次数增加，反映速度加快，温度达到60e时水解度达最大；温度超过60e 水解度开始下降，超过65e后水解度急剧下降，可能是因为超过酶最适温度后,
酶反应体系吸收了过
图2不同温度条件下蚯蚓蛋白的水解度
F ig.2Effect of reaction temperature o n hydro ly sis
deg ree of eart hw or m protein
#
161
#
第8期覃麟等A lcalase碱性蛋白酶制备蚯蚓肽的酶解参数研究
多的能量，引起维持酶分子结构的次级键解体，导致蛋白变性，因而使酶活减弱甚至丧失催化能力[17]。因此，本研究得出，水解温度范围在55~65e 为宜，其中以60e 最适。
2.1.3pH 值从图3可知，在pH 较低时，水解度受其影响较大，随pH 值的提高酶活迅速提高，因此，水解度也迅速增大，当pH 值达8.0时水解度达最大值；在pH 值超过8.0时，部分酶失活。因此，水解度
开始下降,pH 越高酶活越低，水解度也越低。本研究得出，该酶酶解最适pH 值为7.5~8.5，由于pH 值8.0时水解度最高，选择pH 8.0。2.1.4酶用量从图4可知，随酶用量的增加水解度也增大，这可能是因为酶的加入使得底物与酶的接触机会加大，酶可以起到充分催化的作用;
当酶
用量达3%后水解度曲线的斜率明显降低，酶用量
达4%时趋于平缓，用量超过4%时水解度有下降趋势，原因可能是酶与底物之间产生了竞争性抑制作用，而且此时酶已达饱和增加，反而增强了抑制作用，使底物的水解程度下降。因此，本研究设定酶用量适宜范围为3%~5%，同时取4%进行下一步试验。
2.1.5底物浓度从图5可知，随底物浓度的增加，水解度呈上升趋势，当底物浓度达6%时水解度上升缓慢，之后呈下降趋势。分析原因，可能是底物浓度较低时，反应体系内水分较多，虽然使底物分散更均匀，溶解度增加，但同时酶的浓度下降，水解度也较低；底物浓度过高时，底物分散不均匀，过多底物分子堆集于酶的活性中心，从而影响酶催化速度
及产物分子的扩散，故水解度也降低[18]电暧器
。因此，从原料利用率角度考虑，选6%为最适底物浓度。2.2酶解影响因素的综合分析
正交试验结果(表2)表明，不同处理间存在显著或极显著差异，说明酶解温度、时间、pH 和加酶量对蚯蚓蛋白的酶解度有显著或极显著的影响，试验各处理的水解度平均值为20.47%~25.88%。4个因素作用的主次顺序为D>A>C>B；通过比较得出A 3B 1C 2D 3组合最优，亦即当底物浓度固定为6%后，
温度65e 、时间4h 、pH 值8.0及加酶量5%
时水解度最高。
图5不同底物浓度条件下蚯蚓蛋白酶的水解度 F ig.5 Effect of subst rate concentr ation on hydro ly sis
deg ree of eart hw or m protein
表24因素正交试验结果
T able 2 T he r esult of the or thogo na l test
序号N o.
A(温度/e )Concent ratio n B(时间/h)T ime C(pH )pH D(酶用量/%)Enzyme dosage 水解度/%Hy dr olysis degr ee
15547.5322.14?0.73ADH ab 25558.0421.68?1.58A Cab 35568.5522.55?0.56A Fbc 46048.0525.88?0.79IJdf 56058.5320.47?0.50A a 66067.5422.69?0.87A Gbc 76548.5423.19?1.14BCDF GH bc 86557.5525.02?1.02BEFGI ef 96568.0323.1?1.68BDFG HJcde T 166.3772.2169.8565.71T 269.0467.1770.6667.56T 371.3168.3466.2173.45X122.1223.7423.2821.90X223.0122.3923.5522.52X323.7722.7822.0724.48极差R 1.65 1.35 1.48 2.58 注：同列不同的大、小写字母分别表示1%、5%差异显著水平。
No te:Different capit al and small let ters in the same co lumn indicated t he sig nificant levels at 1%and 5%,respectiv ely.#162# 贵州农业科学2010,38卷
3小结
本试验筛选了蚯蚓小肽的Alcalase碱性蛋白酶酶解条件。考察温度、酶解时间、pH值、酶用量及底物浓度比对酶解效果的影响，通过正交试验优化酶解参数，得出了A lcalase碱性蛋白酶制备蚯蚓小肽的最佳工艺参数为底物浓度6%、温度65e、时间4h、pH8.0和加酶量5%。
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(责任编辑：杨林)
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(责任编辑：冯卫)
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