一、实验目的
掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。 二、实验材料
2.1菌株
黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。
2.2 实验试剂
糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。
2.3 实验设备
DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；液压冷却系统SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius 分析天平。
三、角蛋白酶液态发酵实验
3.1 工艺流程
（1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH 7.0，121oC 灭菌15 min。将斜面菌种接种于含有100 mL种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34oC，180 r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。
(2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34oC，静置培养72 h，取出麸皮种子40 oC烘干备用。
3.2.2发酵培养基及培养方法
发酵培养基：糊精信号采集1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH 7.0GATAL歌词翻译。培养基121oC灭菌20 min，将种子液按5%euht终端（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34oC，500 r/min的条件下发酵72 h。
3.3 检测方法
3.3.1菌体浓度的测定
干重法。
3.3.2还原糖的测定
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。
(1) 标准曲线的绘制：配制1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25 mL比管编号，按表1加入试剂。向9支比管中加入0.5 mL DNS，摇匀，于沸水浴中加热5 min，取出置于自来水中冷却，加入4 mL蒸馏水，以管“1”为空白在540 nm波长处测定OD值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5 mL 待测样于比管中，再加入0.5 mL
DNS无糖糖浆；在沸水浴中加热5 min，然后冷却；最后加入4 mL蒸馏水，540 nm下测
定OD值。结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。
表1 葡萄糖标准曲线的制作
管号 | 葡萄糖溶液/mL | 蒸馏水/mL | 最终浓度/(mg/mL) |
1 | 0 | 0.5 | 0 |
2 | 0.05 | 0.45 | 0.1 |
3 | 0.1 | 0.4 | 0.2 |
4 | 0.15 | 0.35 | 0.3 |
5 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
6 | 0.25 | 0.25 | 0.5 |
7 | 0.3 | 0.2 | 0.6 |
8 | 0.35 | 0.15 | 0.7 |
9 | 0.4 | 0.1 | 0.8 |
| | | |
3.3.3酸性蛋白酶活力的测定
Folin-酚法。
16led支架周 实验日程安排
1、 6.11日 （周日）
种子培养基的准备
（1） 固体麸皮种子：实验室研究生事先准备
（2） 液体种子：周日9:00接种，研究生事先准备。
2、 6.12日 （周一）
（1）下午14:30：实验准备、种子培养基、发酵培养基的配制
（2）发酵罐操作、电极校正现场培训(第一组15:30；第二组16:30)
3、6.13 日（周二）
（1）9:00 发酵罐接种培养(两组同时进行)
（2）安排同学值班，每8 h取样一次
（3）大肠杆菌质粒提取、酶切、电泳
3、6.14日（周三）
（1）取样分析检测各项指标
（2）安排同学值班
4、6.15日（周四）
（1）取样分析检测各项指标
（2）安排同学值班、测酶活试剂准备
5、6.16日（周五）
（1）9:00 上罐结束，完成清洁卫生
（2）完成发酵各项参数的测定
需要准备的材料：
1. 种子培养基：液体，4瓶（50mL/500mL）；固体，25g(干重)
2. 发酵培养基：3.5 L
发酵罐灭菌、电极校正：牛皮纸、棉线、无水亚硫酸钠、pH缓冲液、打火机、酒精、相关药品试剂等。
酸性蛋白酶发酵实验值班表(第一组)
组 长： ：
小组成员：
日期 | 值班人 | 签字 | 设备运行情况 | 取样时间 | 取样人签字 |
6月13日(星期二) |
9:00 接种 | 全体组员 | | | (0 h) 9:00 | |
9:00-21:00 | | | | (8 h) 17:00 | |
21:00-8:00 (夜班) | | | | (16 h) 1:00 | |
6月14日(星期三) |
8:00-21:00 | | | | (24 h) 9:00 (32 h) 17:00 | |
21:00-8:00 (夜班) | | | | (40 h) 1:00 | |
6月15日(星期四) |
8:00-21:00 | | | | (48 h) 9:00 (56 h) 17:00 | |
21:00-8:00 (夜班) | | | | (64 h) 1:00 | |
6月16日(星期五) |
8:00-9:00 | 全体组员 | | | (72 h) 9:00 | |
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酸性蛋白酶发酵实验值班表(第二组)
组 长： ：
小组成员：
日期 | 值班人 | 签字 | 设备运行情况 | 取样时间 | 取样人签字 |
6月13日(星期二) |
9:00 接种 | 全体组员 | | | (0 h) 9:00 | |
9:00-21:00 | | | | (8 h) 17:00 | |
21:00-8:00 (夜班) | | | | (16 h) 1:00 | |
6月14日(星期三) |
8:00-21:00 | | | | (24 h) 9:00 (32 h) 17:00 | |
21:00-8:00 (夜班) | | | | (40 h) 1:00 | |
6月15日(星期四) |
8:00-21:00 | | | | (48 h) 9:00 (56 h) 17:00 | |
21:00-8:00 (夜班) | | | | (64 h) 1:00 | |
6月16日(星期五) |
8:00-9:00 | 全体组员 | | | (72 h) 9:00 | |
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