西北农业学报 1998,7(4):1～3
Acta Agricultur ae Bo r ea li-occidentalis Sinica
获得抗虫转基因植株
孙 严1 倪万潮2 郭三堆3
(1新疆农科院核技术生物技术研究所 乌鲁木齐 830000;2 江苏农科院经济作物研究所 南京 210014;
3 中国农科院生物技术研究中心 北京 100081)
摘 要 通过花粉管通道法将人工全序合成的Bt杀虫蛋白基因导入新陆早4号和C6524两品种中，收获注射过Bt杀虫蛋白基因的棉花种子2万余粒。经棉铃虫饲喂的抗虫性生物检测，得到高抗虫的18株新陆
早4号转化苗和36株C6524转化苗；以Bt基因的一对引物进行PCR分析,54株抗棉铃虫的转化棉苗均扩 增出部分Bt杀虫蛋白基因的目标带。未转化的对照棉苗则无此条带，证实Bt杀虫蛋白基因已整合到转化
抗
虫棉株的染体上，首次获得了新疆转目的基因的高效抗虫棉。
关键词 棉花;Bt杀虫蛋白基因；棉铃虫；花粉管通道法
棉铃虫(Helicoverpa armigera)是我国棉花生产的重要致灾害虫，可使棉花损失15%～20%。每年用于棉花害虫防治的杀虫剂量占杀虫剂使用总量的一半，致使主要棉花害虫抗药性快速增长，防效下降，严重制约了棉花生产的持续稳定发展。生物技术的发展使不同物种间基因转移得以实现，将Bt (Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白基因导入棉花，培育抗虫转基因棉花新品种，是解决棉花受棉铃虫危害的一条重要途径。1990年Perlak[1]、1991年谢道昕[2]相继报道已将Bt毒蛋白基因导入棉花，但却难以达到控制棉铃虫的水平。美国M onsanto公司对Bt毒蛋白基因结构进行了改造，使其适应于在植物体内的表达,Bt蛋白的表达量因而提高了100倍[3]，具备了实用价值。本研究采用花粉管通道法，拟将中国农科院生物技术研究中心按照高等植物优选密码子原则人工全序合成的Bt杀虫蛋白基因，导入新疆棉花栽培品种，以期获得抗棉铃虫的转基因棉花新种质。
1 材料与方法
蜂窝不粘锅1.1 Bt杀虫蛋白基因 Bt杀虫蛋白基因由中国农科院生物技术研究中心按照高等植物优选密码子原则设计，经人工全序合成，构建在以GU S基因为标记基因的质粒载体pBI121.1上。
碱法提取质粒，氯化铯密度梯度离心提纯[4]，作为转化棉花的外源目的基因。
1.2 受体棉花品种 选用新陆早4号和C6524两品种，棉花种子由新疆农科院经济作物研究所提供。
1.3 Bt杀虫蛋白基因导入棉花的方法 采用授粉后外源基因导入植物受精胚囊的方法(花粉管通道法)[5]。1997年10月在海南省三亚南繁基地将新陆早4号和C6524两品种以宽窄行种植。棉花盛花期间，在棉花自花授粉24h后，用微量注射器沿子房顶部将Bt杀虫蛋白基因注入，每朵花注射量为10μl。
1.4 生物检测 采用整株饲喂法。将导入Bt杀虫蛋白基因后收获的种子分批播种在温室苗床上，播种前用多菌灵和链霉素浸种过夜，预防或减轻苗期病害。待第1片真叶露出后，接种人工孵育的1龄棉铃虫。将粘有大量已孵化1～2d棉铃虫的纱布放在白大瓷盘上，用蘸湿的毛笔尖粘上棉铃虫，在每株棉苗上接种棉铃虫6～8头，几天后观察结果。拔除心叶被咬烂的不抗虫棉苗，将抗虫棉株移栽入大花盆。
收稿日期 1998-06-22 修回日期 1998-07-09
*国家高技术研究与发展计划和国家九五重大科技攻关资助项目
1龄棉铃虫由江苏农科院植物保护研究所提供。
1.5 分子检测 参照Saiki 的方法[6]，取抗虫棉苗叶片，提取其基因组DN A ，以所用Bt 基因的一对引物进行PCR 分析(这2个引物分别可与35S 启动子和Bt 杀虫蛋白基因内部杂交，含盖约900碱基)。PCR 反应在92℃1min 、55℃1min 和72℃2min 的条件下进行，共循环30次。
2 结果与分析
2.1 Bt 杀虫蛋白基因对棉花的遗传转化
对新陆早4号和C6524两品种进行Bt 杀虫蛋白基因导入的花各2000朵，结果各收获1000多个棉桃。注射导入后的结铃率达50%以上，与通常约11%～65%的棉花转化结铃率相比[7]，转化结铃率较高。两品种共收获注射过的棉花花朵所结的种子2万余粒，比1997年6月底在新疆精河县利用花粉管通道法进行的Bt 杀虫蛋白基因导入棉花的研究结果大为提高。当时导入了新陆早4号生产田中的1000朵花，绝大部分注射过的棉铃均脱落，只得到4个棉桃,70粒种子，导入注射后的结铃率仅0.4%。因此认为，利用花粉管通道法转化棉花，在新疆应该选用稀植的棉花试验田，以减少棉铃脱落；尽量选棉花盛花前期开的花朵进行导入，并采取多种办法使注射过的棉铃都能成熟，以提高成铃率。
2.2 抗棉铃虫生物检测
护肩路基经棉铃虫饲喂的抗虫性检测实验,5～7d 后可观察到大部分棉苗叶片被采食严重，个别棉苗叶片上有几
个针尖大小的孔洞，且心叶完好，表现出对棉铃虫良好的抗性。经过大量选择最终得到了高抗虫的18株新陆早4号转化苗和36株C6524转化苗，以转化的棉花花朵计算，转化率分别为0.9%和
1.8%。由于直接采用生物检测方法，有一些已转化的棉苗由于Bt 杀虫蛋白表达量不高、
表现为不抗虫 1：分子量标准 M olecular w eigh t s tandard,5：对照CK 2～4,6～8：转化抗虫棉株 Transformed bollw orm -resis tan t cotton plan ts 图1 抗虫棉株PCR 分析结果Fig .1 The PCR result of bollworm -resistant cotton plants
而被淘汰，因此实际的转化率应比此
转化率高。花粉管通道转化不同于农
杆菌介导转化，它可以得到大量的未
射线灯
经初步筛选的种子，因此建立一种准
确、快速、有效的生物检测方法就成
为非常关键的技术。本研究使用的抗
棉铃虫生物检测方法，经实验证明是
珊瑚姜非常有效的，它可以准确、快速地从
大量转化过的棉花种苗中检测出抗
棉铃虫棉株。这不仅提高了效率，并
且大大减轻了分子检测和后期选育
的工作量，为尽快选育出新疆抗虫棉
新品系打下基础。
2.3 PCR 分析
长春密刺
错位匹配两个品种的54株抗虫棉株均扩
增出部分Bt 杀虫蛋白基因的目标
带，长度约为900碱基，得到PCR 阳性反应；而未转化的对照棉株则无此条带，证实Bt 杀虫蛋白基因已整合到转化抗虫棉株的染体上，转基因获得了成功(图1)。
3 讨论
花粉管通道转化法有效地利用了植物自然生殖过程，避开了棉花植株再生等难题，且不受基因型控制，没有种属限制；操作简单，转化成本也较低。不足之处是转化技术不太完善，对转化机制缺乏系统的研究，操作过程带有一定的盲目性，转化效率还有待提高。
·2·西 北 农 业 学 报7卷
生物技术途径在抗虫机制上不同于形态抗性和小分子物质的化学抗性,Bt 杀虫蛋白被棉铃虫幼虫采食后，
专一地与幼虫中肠上皮细胞的特殊受体互相识别并结合，在细胞膜上形成微孔，水分外泄，细胞膨胀破裂，造成幼虫死亡。这种毒杀作用具有专一性，由单价基因控制，在遗传操作和育种应用上容易控制，只要在抗虫性良好的棉株中进行产量和品质的筛选，很快就能得到既抗棉铃虫，又具有较好农艺性状的棉花新种质或新品种。
参考文献
1 Perlak F J,Deaton R W ,Arms trong T A.Insect resistant cotton plants.Bio /Technolog y,1990,(8):939～943
2 谢道昕，范云六，倪万潮等.苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因导入棉花获得转基因植株.中国科学(B 辑),1991,(4):367～373
3 Perlak F J,Reynaerts A.M odification of the coding sequence ench ances plant ex pres s of ins ect control protein gen es.Proc Natl Acad Sci.(US A),1991,88:3324～3328
4 萨姆布鲁克J ，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南(第二版).金冬雁，黎孟枫等译，北京：科学出版社,1992:19～305 Zh ou G Y.Introduction of exogenous DN A into cotton em bryos.M eth ods in Enzymolog y,1983,101:433～488
6 Saiki P K .Amplification of genomic DN A :A g uide to m ethods and applications .Acad emic Press Inc .,1995
:13～207 周光宇.农业分子育种研究进展.北京：中国农业科技出版社,1993:114～117
The Acquirement of Transgenic Bollworm -Resistant Xinjiang
Cotton Plants with the Synthetic Gene Coding Bacillus
Thuringiensis Insecticidal Protein
Sun Yan 1,N i Wanchao 2,and Guo Sandui
3(1 Institute of Nuclear and Biotechnologies,Xin j iang Ag ricultu ral Academy,Urumqi 830000;
2 Ins titute of Indus trial Crops ,J iangs u Acad emy of Agricultural Sciences ,Nanjing 210014;
3 Research Center of Biotech nology ,Chinese Academy of Agricultural Sciences ,Beijing 100081)
Abstract By the pollo n tube pa thway ,the a rtificially synthesized Bacillus thuringiensis insectici-da l protein gene w as transform ed into the elite Xinjiang co tton (G ossypium hirsutum L.)cultiv ars nam
ely Xinluzao No .4a nd C 6524,and 20thousa nd injected cotto n seeds w ere obtained .After the bi-olo gical inspection by raised bo llw orm (Helicoverpa armigera ),18Xinluzao No.4plants and 36C6524plants resisting to bo llw orms were g ot.With a pair of primers o f Bt g ene,the results o f PCR analysis indica ted that the Bt gene did integ rate w ithin the g eneno me of the to tal 54transfo rmed boll-w o rm -resistant cotton plants .We primarily g ot the transg enic bollw o rm -resistant Xinjiang cotton plant.
Key words Co tto n;Bollw o rm;Po llon tube pathw ay;Bacillus thuringiensis insecticidal pro tein g ene ·3·4期孙 严等 Bt 杀虫蛋白基因导入新疆棉花获得抗虫转基因植株
