-538-J Shanxi Med U/ie,Map2021,Vh52No5
上调IncRNA OIP5-AS1通过靶向miR-181d-5p减少脂多糖诱导的心肌细胞损伤陈健佳，张小梅，马文斌，黄玉梅，赵强*(广州医科大学附属顺德医院心内科，佛山52831；通讯作者,E-mxi：326400975®qq) 摘要：目的探讨长链非编码(loxg/ox-coUing RNA,l/cRNA)OI/5-XS(在脂多糖诱导心肌细胞损伤中的作用及内在机制。 方法将大鼠原代心肌细胞分为两组，分别感染空载慢病毒(对照组)和载有OI/5-AS(序列的慢病毒(实验组)，实时定量聚合酶链反应(qRT-LCR)验证感染效率。对照组和实验组细胞分别滴加30pi浓度为10pmol/P脂多糖诱导心肌细胞损伤，采用ELISA法检测培养基中肿瘤坏死因子a(TNFx)和白细胞介素1B(I/XB)的表达水平。采用CCK-C法和流式细胞术分别检测OI/5-AS(对大鼠原代心肌细胞的活力和凋亡的影响。生物信息学技术和双荧光素酶报告基因实验分别预测和验证OI/5-XS(的靶基因。qRT-PCR检测靶基因的表达。Western blot法检测凋亡相关蛋白BhL、Bcx、CasyaseL的表达。结果与对照组比较，实验组细胞中OI/5-XS(表达显著增加(P<0.01。脂多糖处理后，与对照组相比，实验组培养基中TNF-p 和ILlp的表达明显降低(均P<0.05)。与对照组相比，实验组细胞活力明显增加(P<0.0()，细胞的凋亡明显降低(P< 0.01。OI/5-XS(的靶基因可能是miRXKdLp,OIP5-AS(可与mib-UdLy互补配对(P<0.01。与对照组 相比，实验组细 胞中mibX81dLu的表达明显降低(P<0.01)。与对照组相比，实验组细胞中Bcl-6蛋白表达增加，Box和Caspase-C蛋白表达 降低。结论上调OI/5-XS(可通过靶向抑制mib-Hd-ay表达，减少脂多糖诱导的心肌细胞损伤。
关键词：OIP5LS1；miRX81dXh；细胞活力；细胞凋亡
中图分类号：R542.2文献标志码：A 文章编号：1027-671(250125-2588-25DOI：12.1753/j.issu.1027-6611.292、.25.21
Up-regulation of IncRNA OIP5-AS1reduces lipopolysaccharide-induced cardiomyocyte damage by targeting miR-Hld-lp CHEN JCnjia,ZHANG Xiaomei,MA WexViu,HUANG Yumei ,ZHAO Qixp*(Department of Cardiology,Shunde Hospital,Guangzhou Medical Unwersitm,FosPat528315,COOr；*Corresponging autmor,E~i^it■)
AbstrecC:Objectier Tv explore trie role of loxg/ox-coUing RNA(lvcRNA)OIP5-XS(iu lidouolysaccharide-inUuceX cardiomyocyte damage and its unUerlying mechanism.MetioOi The primam mt cardiomyocytes were infected witri trie empty-loaOed leutivirus iu coxtroi group and trie leutivirus loaPeX witri OIP5-XS(sequehce iu experimeptoi pmup.Reol-Cme quantitative polymerase chaiu reoc-tiox(qRT-PCR)was used to verify trie infectiox ehicieucy.Cells were dripped witri140pi of li
douolysaccharidg at a coxceutra/ox of 14pmol/P to induce cardiomyocyte damaye iu coxtroi group and experimeutoi pmup.The expressiox levels of tumor vecmsis factor-p (TNF-p)and interlexUib10((LL0)iu trie cylturo medium were detected bp ELISA.CCK-8metriof and Oow cytometrg were used to detect trie ehects of OIP5-AS(ox trie viaOi/ty and trie apoptosis of primarg rot cahiomyocytes.Bioinformatics tech/olopp and dual luciferase reporteo peue were used to predict and verCp trie target peue of OIP5-AS1.The qRT-PCR was used to detect trie expressiox of target pe/e.Western blot metriof was used to detect trie expressiox of apoptosisxemteX protei/s Bcl-6,Box and CaspaseA.Resulo Compared witri coxtroi group,trie expressiox of OIP5-AS(was i/cmased significantly iu experimehtyi group(P<0-01).After lipopv-lysacchariUg treatmeot,compared witri coxtroi group,trie expressiox of TNF-p and ILA0iu trie cylturo medium was significantly reduced iu experimehtyi group(botri P<0.05).Compared witri coxtroi group,trie cell viaPility was significantly i/cmased iu experimehtyi gmup(P<0.01),while trie cell apoptosis was significantly reduced(P<0.01).The target peue of OIP5-AS(might be mib-11d-5p,and OIP5-AS1coPU pair with miRA81ULp(P<0.01).Compared witri coxtroi group,the expressiox of miR-18IdAp iu the ce/s was significantly reduced iu experimehtyi pmup(P<0.01).Compared witri coxtroi group,trie expressiox of Bcl-6proteiu iu trie cells was increased iu experimehtyi group,while trie expressiox of Bcx and Caspase-C proteins was decmased.Conclusioo Up-regula/ox of OIP5-AS(can reduce trie myocardial cell damaye induced bp liuouolysacchariUe bp targe/ng and indibiCng trie expressiox of miR-112X0.
Key words：OIP5-AS(；miR-11dLp；cell vROilSp；cell apoptosis
基金项目：佛山市科学技术局科技计划项目(120001000533,1920001000740)
作者简介：陈健佳，男,183-11生，学士，主治医师,
收稿日期：2021-01-23
山西医科大学学报，222）年5月，第52卷第5期-539-
心肌炎是一种会导致心脏功能障碍的心肌炎症性疾病，病因包括免疫损伤、感染等，可显著影响心脏的收缩和舒张功能，导致心律失常［］。心肌炎的诊断主要依赖于免疫学、免疫组织化学及组织病理学⑵。心肌炎的具体发病机制目前并不明确，探究心肌炎的分子靶向具有重要意义。长链非编码RNA（Unq nod-codinx RNA,1ncRNA）是一类超过204个核苷酸组成的内源性小分子RNA，属于单链非编码RNA［］。lucRNA参与调控血管生成、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡等各种细胞功能"5］。ln-cRNA广泛参与各种心脏疾病的发生、发展过程⑷。研究表明是一种lucRNA，其可通过抑制线粒体介导的细胞凋亡，降低急性心肌梗死后的心肌缺血再灌注损伤［］。OIC0-AS1对细菌性心肌炎时心肌细胞损伤的研究尚未见报道。本研究旨在观察OIC0-AS1对脂多糖诱导细菌性心肌炎时对大鼠原代心肌细胞的作用及可能的作用机制。
1材料和方法
扎把机H细胞与试剂
用于分离原代心肌细胞的3d新生SD大鼠购于武汉万千佳兴生物科技有限公司。载有OIC7-AS1序列的GFP慢病毒、空载GFP慢病毒、miR-NC、miRA81dCp、OIP5-AS1野生型及突变型荧光报告载体购于广州锐博生物技术有限公司。工具223细胞、ELISA试剂盒和CCK-8试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM培养基购于美国HycUna公司。Annexin V-FIDC细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司。转染试剂Lipofectamine™13204购于美国Invitppex公司。胶原酶I购于美国Sigma公司。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购于日本Tadara公司。一抗和二抗购于美国Cell Sipnalinq TechnoUgy公司。
1.2细胞分离、培养和分组
采用胶原酶I将3d新生SD大鼠的心脏组织解离为单细胞悬液，加入含22%胎牛血清的DMEM 培养基中，在37°C、5%CO/条件下培养。将大鼠
原代心肌细胞分为两组：分别感染空载GFP慢病毒和载有OIP5-AS1序列的GFP慢病毒，感染复数（MOI）均为20，命名为对照组和实验组。12h后荧光显微镜下观察细胞状态。每组细胞分别滴加160以浓度为16pnol/L脂多糖,24h进行后续实验。1.3qRT-CCR检测OIC0-AS1和miW-1316C2的表达
TRIzoi法提取细胞总RNA，逆转录为cDNA进行qRT-CCR检测。反应参数：96C预变慄3min,96C 变性20s,66C退火22s,74C延伸20-,35个循环。OIC0-AS1的表达以p-PcUn为内参，miRA81d-5/的表达以U6为内参。引物序列如下:miW-181d-5/正向弓|物为AACAUUCAUUGUUGUC，反向弓|物为CGACGTGTAGTGTTTCCTA；U6正向引物位CTCGCTTCGGCAGCACA，反向弓|物为ACGCT-TCACGAATTTGCGT o0-actR正向引物为TGTCAC-CAACTGGGACGATA，反向弓|物位GGGGTGTT-GAAGGTCTCAAA；OIC0-AS1正向弓|物为GTGTTGT-GGAGATTGAGGCAGGAG，反向弓|物为GGCAAGGT-GAAGGACAGACAGC o以2皿法计算OIC0-AS1和miRA81d-5p的相对表达。
1.4E liza法检测肿瘤坏死因子a（TNF-c）和白细胞介素10（（LC0）含量
大鼠原代心肌细胞经脂多糖处理24h后，收集各组细胞的上清，根据ELI3A试剂盒说明书进行操作，在酶标仪450nm波长处检测每孔吸光度（4）值，比较每组细胞上清液中TNF-c和ILC0的含量。
1.5CCK-8法检测细胞活力
将经脂多糖处理后的大鼠原代心肌细胞以每孔1X165个细胞接种于99孔板，设置4个复孔。29h 后，每孔加入22pi CCKC试剂，继续培养9h，在酶标仪450nm波长处检测每孔吸光度（A）值，比较各孔的细胞活力。
1.2流式细胞术检测细胞凋亡率
胰酶消化经脂多糖处理后的大鼠原代心肌细胞，采用预冷的PBS溶液洗2次，采用缓冲液重悬，分别取10P细胞悬液加入流式管，分别加入7p Annexin V-CIPC试剂和7p i PI试剂，混匀后避光孵育27mR o加入10pl缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.5生物信息学方法预测和双荧光素酶报告基因实验验证OIC0-AS1的靶基因
采用生物信息学软件Stardasa预测OIC0-AS1的潜在靶向基因。采用Lipofectamine TM3000转染试剂，将OIC7-AS1野生型和突变型荧光报告载体分别和miW-NC或miW-181dCp共转染工具223细胞,24h 后根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作，检测每组细胞的相对荧光素酶活性。
1.5Western blvi法检测凋亡相关蛋白Bct-2、Bax 、
-594-J Shanxi Med Unia,Moy2021,Vol52No5
Caspaso-3的表达
对照组和实验组细胞分别滴加140j t浓度为
14jmol/B脂多糖诱导心肌细胞损伤,24h后采用
预冷的PBS溶液洗2次，采用细胞裂解液提取总蛋
白。蛋白变性后，采用十二烷基聚丙烯酰胺凝胶电
泳分离蛋白，转至硝酸纤维素膜，采用5%脱脂牛奶
进行封闭，在4兀冰箱内采用一抗Bd-P(稀释度
C2000)、Bax(稀释度1：1004)A Caspaso-3(稀释度
1：004)孵育过夜，在室温下采用二抗孵育2h o均
匀滴加增强型化学发光试剂，在凝胶成像系统中曝光、拍照。
1.5统计学方法
采用SPSS18.4统计学软件分析，计量数据以均数土标准差(兀±P表示，采用t检验比较两组间差异，以P<4.45为差异有统计学意义。
2结果砭石枕
2.1两组细胞中OIL5-DS1的相对表达
对照组和实验组细胞均显著表达绿荧光蛋白(见图1)，提示细胞感染成功。对照组和实验组细胞中OIL5-DS1相对表达分别为041±4.47和9.22土
对照组实验—
图1对照组和实验组细胞绿荧光蛋白表达Figure1The expression of greex Cuoresce/t protein in
control group and expePme/tot group
2.2高表达OIL5-DS1对TNF-t和IL-1p含量的影响
ELISA法结果显示，脂多糖处理后对照组和实验组培养基中TNF-p含量分别为(39.45±215)pg/ml 和(34.26±1.85)pa/mt，两组间比较差异有统计学
图4对照组和实验组细胞中OIL5-DS1的相对表达Figure4The relative expression of OIL5-DS1in coxtrot groxp anh expe/mexto-group
意义(PV4.05)；对照组和实验组培养基中AD p含量分别为(22.49±054)pg/mi和(12.34±077)pg/mi，两组间比较差异有统计学意义(PV4.01)。与对照组相比，实验组培养基中TNF-p和IL-i p含量均明显降低。
2.2高表达OIL5-DS1对细胞活力的影响
CCK-3法结果显示，脂多糖处理后的对照组和实验组细胞活力分别为004±0.02和5.89±4.61，与对照组相比，实验组细胞的活力明显较高(P<4-01)o 2.4高表达OIL5-DS1对细胞凋亡率的影响
流式细胞术显示，脂多糖处理24h后，实验组和对照组细胞凋亡率分别为(22.74±1.88)%和(48.64±2.35)%；与对照组比较，实验组高表达OIL5-DS1明显抑制细胞的凋亡，差异具有统计学意义(PV4.01，见图3)o
与对照组比较，*P<2.01
图3流式细胞术检测OIL5-AS1对细胞凋亡率的影响Figure3The e/ect of OIL5-DS1on celt apoy/sis rate was Uetectef by Cow cytometp
2.5生物信息学方法预测OIL5-DS1的靶基因
采用生物信息学软件Stardaso预测OIL5-AS1可靶向结合miW-131d-dy(见图4)
。
山西医科大学学报，2021年5月，第52卷第5期-571-
OIP5-AS15'augguugcACAGCAGUAUGAAUGUa3'
lll：ll IIIIIIII
miR-181d-5p31uggguggcUGUUGU—UACUUACAa5'
图4生物信息学方法预测OIC5-AS1的靶基因
Figure4Bioinformabcv metbo/s prefictef tbe taryet gene
of OIC5-AS1
2.7OIC5-AS1与miW-131dCh的靶向关系
双荧光素酶报告基因检测结果显示，野生型
miW-NC组、野生型miWOldCp组、突变型miW-CC 组和突变型miWOldCp组的相对荧光素酶活性分别为1.02±0.08、0.30±0.24、1.08±0.15和 1.21±2.06，野生型miWOldCp组较野生型miW-NC组明显降低（P<2.01，见图5），证实OIC5-AS1与miR-131dCp之间可靶向结合。
与野生型miW-NC组比较，*P<2.21
图5双荧光素酶报告基因实验验证OIC5-AS1与miR-
⑻^!-/的靶向关系
Figure5The dual lxcifemse mpoPes gene experiment veri-Uef-Xv taryeting pUbonship between OIC5-AS1
and miRA31hCp
2.5高表达OIP5-AS1对细胞中miW-181dCh表达的影响
qRT-CCR结果显示，实验组和对照组细胞miR-131dCp的表达分别为2.^±2.06和1.21±0.06，高表达OIC5-AS1可抑制miW-181dCp的表达(P<2.21)。
2.3高表达OIC5-AS1对凋亡相关蛋白表达的影响
Westem blot结果显示，与对照组相比，脂多糖处理的高表达OIC5-AS1的细胞中，抗凋亡蛋白Bci-2表达增加，促凋亡蛋白Box、CopoeC表达下降(见图6)o
图6Western blot法检测高表达OIC5-AS1后凋亡相关蛋白的表达
Figure6Expression of apoptosis-relatef proteins after
OIC5-AS1overexpression by Western blot
3讨论
近年的研究表明,1ncRNA在各种心血管事件的发生、发展过程中具有重要调控作用b3。心肌炎导致炎性渗出，心肌细胞耗氧量增加，心肌细胞更易凋亡，导致恶性临床事件［3o IncRNA介导的心肌细胞损伤被广泛的研究。Zhang等研究发现,1n-cRNA ROR通过调节C-Mye蛋白的表达，促进病毒性心肌炎大鼠心肌的纤维化。Cox等［o］研究发现，在柯萨奇病毒B3诱导的心肌炎中，1ncRNA HIC1A-AS1的表达明显增加，沉默IncRNA HIF1A-AS1可抑制心肌细胞的凋亡，miRC38是IncRNA HIP1A-AS1的靶基因。NR等⑺研究发现,OIP5-AS1在心脏缺血再灌注心肌细胞中的表达下调，过表达OIC5-AS1可减轻活性氧引起的线粒体损伤，降低心肌细胞的凋亡。OIC5-AS1对细菌性心肌炎时心肌细胞的影响及作用机制尚不明确。
本研究显示,OIP5-AS1可增加细菌性心肌炎心肌细胞的活力，上调OIC5-AS1可抑制TNF-c和IL-4炎症因子的渗出，降低心肌细胞的凋亡率，减轻心肌细胞的损伤。越来越多的研究表明,UcRNA主要通过“海绵作用”结合微小RNA(miWNA)，降低miWNA的表达，进而抑制miWNA的功能［3-2。本研究采用生物信息学软件Stardase预测,OIC5-AS1的靶基因可能是miW-181dCp o双荧光素素酶报告基因检测显示，OIP5-AS1可配对结合miW-131dCp o 研究表明,miW-181dCp在急性病毒性心肌病患者血清外泌
体中的表达显著增加，miRA81dCp可增强心肌的炎症反应，促进心肌细胞的凋亡和不可逆损伤34。本研究显示，OIP5-AS1表达增加后，脂多
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糖处理的心肌细胞中miR-181ULy的表达降低，OIL5-AS1可明显抑制miRA81ULh的表达。本研究通过Western blot检测显示，高表达OIL5-AS1的心肌细胞中Bct-2蛋白表达增加，Bax、Cashase-3蛋白表达减少，提示OIC0-AS1抑制miR-181ULy表达后心肌细胞凋亡明显减少。
综上所述,OIP5-AS1可有效增强脂多糖处理的心肌细胞的活力并抑制其凋亡,OIC0-AS1主要通过抑制miR-181dLy表达发挥作用。本研究首次揭示OIC0-AS1可能有利于改善细菌性心肌炎心肌细胞的功能，为细菌性心肌炎的分子靶向提供了新的方向。
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