• 56 •毒理学杂志2021 年2 月第35 卷第1期J Toxicol February 2021 Vol. 35 No. 1中图分类号：R614;R99;R114文献标识码：A 文章编号：1002-3127( 2021)01-0056-06•实验研究•
右美托咪定通过IncRNA H19介导香烟提取物诱导的
夏延贞，王龙珍，莫靓，商雄跃
(江苏省人民医院浦口分院重症医学科，江苏南京211800)
【摘要】目的探索右美托咪定（Dexmedetomidine, D E X)通过长链非编码RNA (long noncoding RNA , IncRNA) H19 对香烟烟雾提取物（cigarette smoke e x tra ct,C S E)诱导的RAW264. 7巨噬细胞活力、凋亡和自噬的影响。方法制备CSE 及C S E干预巨噬细胞模型，运用体外细胞培养，D E X以不同浓度（2、4和8p m o l/L)作用于C S E诱导的巨噬细胞，采用 M T T法检测细胞存活率，流式细胞术检测模型细胞的凋亡率，采用蛋白质印迹法（Western blot)检测细胞中凋亡相关蛋干涉光刻
白B a x和B c l-2及自噬相关蛋白LC3 I I和A T G7表达情况，实时荧光定量P C R(q R T-P C R)检测H1 9表达水平；为了进一步验证D E X对C S E诱导的巨噬细胞增殖、凋亡和自噬影响，运用双酶切法构建pcDNA3. 1-H19表达载体。结果一定
剂量的D E X可明显拮抗C S E诱导的巨噬细胞活力下降作用（P<0.05)，具有浓度依赖性；D E X抑制C S E诱导的巨噬细
胞凋亡，且细胞中凋亡蛋白B a x明显下调（P<0.05)，抗凋亡蛋白B d-2上调（P<0.05)，自噬相关蛋白LC3 I I和A T G7表 达上调（P<0. 05)，H19表达下调（P<0. 05)；成功构建pcDNA3. 1-H I9表达载体，D E X作用于C S E诱导的巨噬细胞，细胞活力明显降低（P<〇. 05)，且细胞中凋亡蛋白B a x上调（P<0. 05)，抗凋亡蛋白B c l-2下调（P<0. 05)，自噬相关蛋白LC3
I I和A T G7表达下调（P<0. 05)。结论D E X抑制H19表达，增强C S E诱导的巨噬细胞活力，抑制细胞凋亡和自噬。
【关键词】右美托咪定；IncRNA H19；香烟烟雾提取物；凋亡；自噬
The cellular effects of dexmedetomidine in cigarette smoke extract-induced
macrophages via IncRNA H19
XIA Yan-zhen, WANG Long-zhen, MO Jing, SHANG Xiong-yue
(Department of critical medicine ,Pukou branch , Jiangsu Peopled Hospital, Nanjing Jiangsu211800, China) 【A b s tra c t】O b jective To investigate the effects of dexmedetomidine (D E X)on the viability, apoptosis and autophagy of PAW264. 7 macrophages induced by cigarette smoke extract (C S E) through long noncoding RNA (IncR NA) H19. M ethods CSE and CSE intervention model of macrophages were prepared. Cells were cultured in vitro, and DEX was applied to CSE-induced macrophages at different concentrations (2,4and 8|xm ol/L). MTT method was used to detected the cell survival ra te, and the apoptosis rate of model cells was detected by flow cytometry. Western blot was used to detected the expressions of apoptosis-related proteins Bax, Bcl-2, autophagy- related proteins LC3 II and ATG7 in cells. Real-time fluorescence quantitative PCR (q R T-P C R) was used to detect the expression level of H 19；in order to further verify the effect of DEX on CSE-induced macrophage proliferation and apoptosis, a double enzyme digestion method was used to construct the pcDNA3. 1-H19 expression vector. R esults DEX can significantly promote the proliferation of CSE-induced macrophages (P<0. 05) , with concentration-dependent m annar；the apoptosis of CSE-induced macrophages was inhibited by DEX, and the apoptosis protein Bax in the cells was significantly down-regulated ( P<0.05) , anti-apoptosis protein Bcl-2 was significantly up-regulated (P<0.05) , the expressions of autophagy-related proteins LC3 II and ATG7 were significantly up-regulated (P<0. 05) , and the expression of H19 was significantly down-regulated (P<0. 05) ；the pc
DNA3. 1-H19 expression vector was successfully constructed, while CSE-induced macrophages were treated by D E X, the cell viability of the cells was significantly reduced ( P<0. 05 ) , and the apoptosis protein Bax was significantly up-regulated (P<0. 05) , and the anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly down-regulated ( P<0. 05 ). The expressions of phage-related proteins LC3 II and ATG7 were significantly down-regulated (P<0. 05).C o nclusion DEX can inhibit expression of H19, enhance CSE-induced macrophage viability, and inhibit its apoptosis and autophagy.大功率led天花灯
【Key w o rd s】Dexmedetomidine; IncRNA H19；Cigarette smoke extract；Apoptosis；Autophagy
作者简介：夏延贞，硕士，主治医师，研究方向：慢性阻塞性肺疾病。
通讯作者：商雄跃，硕士，主任医师，研究方向：慢性阻塞性肺疾病。
慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,C O P D)是主要的公共卫生问题之一，常与有毒 颗粒或气体的显著暴露引起的气道和肺泡异常有关，主要临床症状表现为慢性咳嗽、咳痰或呼吸困难m。在临床预防和方面面临巨大挑战，巨噬细胞可分 泌大量细胞因子以调节局部免疫反应，从而在气道慢 性炎症过程中发挥重要作用[2]。C0P D的药物 有糖皮质激素、抗胆碱药物、P类受体激动剂和茶碱类 药物等。右美托味定（Dexmedetomidine,D E X)属于a2 肾上腺受体激动剂，具有镇静、镇痛和催眠等作用，常 用于全身麻醉的手术患者气管插管和机械通气时的镇 静:'1]。研究
发现，D E X对香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract,C S E)诱导的C O P D大鼠模型具有保护作用，可降低肺泡腔扩大，抑制中性粒细胞浸润和
N L R P3炎性体表达[4]。非编码R N A参与调控机体的 多种炎症反应，其中l n c R N A H19在脂多糖(Lipopolysaride,L P S)诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中表达明显增加，可参与内毒素诱导的急性肺损伤，C S E可通过上调巨噬细胞m i R-21的表达和增强自噬，诱导巨噻细胞凋亡及增殖减少[5<。D E X对C O P D的具有较为明显的效果，但具体作用机制尚不 明确。本研究构建了C S E诱导巨噬细胞模型，探索 D E X通过IncRNA H19对C S E诱导的巨噬细胞增殖、凋亡和自噬的影响以期阐明其作用机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞：R A W264. 7巨噬细胞株（鼠源性）购自中 南大学湘雅医院细胞库。
1.1.2主要试剂：右美托咪定注射液（1m l含有 100 JJLg右美托咪定）购自江苏恒瑞公司；南京牌香烟 (五星红杉树）；鼠人抗Bcl-2和B a x购自美国Cellsignaling公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔lgG (H+ L)、微管相关蛋白1轻链 3 (microtubuleassociatedproteinl lightchain 3 alpha I I ,L C3 I I )、自噬
相关蛋白 7 (autophagyrelated 7, A T G7 )抗体 和G A P D H单克隆抗体购自英国A b e a m公司；P V D F 膜和蛋白酶抑制剂P M S F购自中国Biosharp公司；R I P A裂解液购自美国Proteintech公司；T B S T和D M S0购自上海Aladdin公司；D E M E培养基、胎牛血 清、双抗（青霉素-链霉素混合液）、Trizol试剂盒、p c D N A3. 1载体和Lipofectamine1M 3000转染试剂盒购 于美国 Thermo Fisher Scientific公司；噻哩蓝（M T T)试剂盒购于美国Sigm a公司；B C A蛋白测定试剂盒和AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购自美国Bio- Rad 公司；PrimeScriptT M RT Master Mix 和 SYBR Premix Ex Taq I I试剂盒购自日本T a k a ra公司；H19和 GAPDH引物购自北京擎科生物公司。
1.2 方法
1.2.1细胞培养及分组：采用含有体积分数为10% 的胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基培养细胞，培 养条件37 T： ,5% C02细胞培养箱中培养。实验分为 对照组、C S E干预巨噬细胞（C SE组）和D EX处理CSE 诱导的巨噬细胞组（CSE+DEX组）。
贝雷梁
1.2.2 C E S的制备及C S E干预巨噬细胞：按照Chen 等[7]设计的装置制备C SE，首先除去香烟的过滤嘴并点燃，然后采用负压吸引器对香烟进行连续抽吸，将香 烟烟雾收集于无菌瓶中，最后用0.22 p m的微孔滤膜 过滤。每4只香烟鼓泡通过40 m l细胞生长培养基，并将该溶液（作为100%浓度的C S E原液）p H值调节 至7. 45，巨噬细胞培养过程中添加2.5% C SE，干预时 间为48 h。
1.2.3 M T T实验：将5x 1〇4/孔接种细胞于96孔板 中，培养24 h后，分别加人D E X，使得培养孔终浓度为 2、4和8 mniol/L，每组9个平竹。经过48 h后，弃上 清液，每孔加人0.2 g/L的M T T试剂200 m l，继续培养 4 h，弃上清液，每孔加人200 j j i I D M S0，涡混振荡
2 m i n，用酶标仪检测波长为570 n m时吸光度（/I)值。计算细胞存活率=实验组A570/对照组A570X100%。1.2.4 流式细胞实验：D E X处理细胞48 h，使细胞重 悬至浓度l x l O V m l，取100 i xl(lxl〇5细胞）于5 m l培 养管中。加人10 fig重组模联蛋白V后，摇匀，室温孵 育 20 min。然后分别加人 5 FITC Annexin V 和 5 j x l 碘化丙啶（PI)，室温黑暗条件下孵育20 m i n，再加人 400 |j l11x结合缓冲液。采用流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）进行分析并米集数据，用Flow Jo _X_10. 0.7_R2软件进行分析
1.2. 5 Western blot实验：取各组对数生长期的细胞，使用细R1P A裂解液，按照蛋白裂解步骤提取总蛋白，采用B C A法进行蛋白定量，确定蛋白浓度，依次S D S-P A G E凝胶电泳，电转膜至P V D F膜、室温封闭2 h, T B S T洗膜，根据需要加人人鼠抗Bcl-2( 1: 500)、Bax (1: 500)、L C3 I I( 1:1000)、A T G7 ( 1:1000 )和 G A P D H(1: 2 000),4 t下孵育过夜，洗膜加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) ( 1: 2 000)，室温 孵育2 h；再用E C L化学发光显示，采用凝胶图像分析
系统对比条带强弱。
1.2.6 q R T-P C R实验：使用Trizol试剂提取总R N A，使用 PrimeScriptTM R T Master Mix 对 R N A 样品进行反 转录。然后使用S Y B R Premix Ex Taq I丨试剂盒进行 q R T-P C R分析。作为内参基因，采用2 AACT法 相对表达量，使用的引物如下：H19：正向5'- A T C G G T G C C T C A G C G T T C G G-3,,S f S]S^C T G T C C T C G C C G T C A C A C C G J'j G A P D H：正向 5，-A G C C A C A T C G C T C A G A C A C-3,，反向 5"-G C C C A A T A C G A C C A A A T C d〇1.2.7 构建 pcDNA-H19 过表达载体：用 PrimeScript™R T Master M i x试剂盒合成人///9基因c D N A，通过 P C R扩增//79的c D N A，并将其搭载至p c D N A3. 1载 体；以空载体作为阴性对照，使用Lipofectamine 3000 试剂盒进行转染，48 h后q R T-P C R检测表达
水平。
1.3统计学方法数据采用SPSS 21.0进行统计分析，所有数据均采用均数±标准差表示，多组间 比较采用单因素方差分析，P<0. 05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1D E X拮抗C S E对巨噬细胞活力的抑制作用不同浓度的D E X处理C S E干预的巨噬细胞，M T T法检测细胞活力（表1)，D E X对C S E诱导的巨噬细胞增殖 有明显的促进作用（P<0. 05)，且具有浓度依耐性。当8 iJimol/L D E X处理C S E诱导的巨噬细胞时，细胞存 活率由34. 62%增长至74. 36%，说
明在该浓度条件下，D E X能一定程度上拮抗C S E对诱导的巨噬细胞活 力的抑制作用。本研究选择D E X浓度为8 |x m〇l/L。
表1不同浓度D E X对C S E诱导的巨噬细胞增殖的
影响（i±s)
分组细胞存活率（％)
对照组100. 00±8. 17
CSE34. 62±5. 23*
CSE + 2 jimol/L DEX41.03±3. 85#
CSE + 4 |xmol/L DEX58. 97±4. 26#&
CSE+8 pmol/L DEX74. 36±5. 98#&'
F90.68
P<0.001
注：与对照组比较/P<0. 05；与C SE组比较/f<0. 05；与CSE + 2 (unol/L DEX 组比较，S P<0.05；与CSE + 4 |xmol/L DEX 组比较，P<0.05 ；n = 9〇
2.2 D E X抑制C S E诱导的巨噬细胞凋亡 D E X处理
C S E诱导的巨噬细胞，流式细胞实验证实
D
E X可明显 抑制细胞凋亡（6.54%，/><0.05，图1和表2);\^816〇1 blot显示凋亡蛋白B a x表达明显下调（P<0. 05)，抗凋 亡蛋白Bcl-2的表达明显上调（P<0. 05，图2)。表明 D E X抑制C S E诱导的巨噬细胞凋亡。
图1D E X对C S E诱导的巨嗟细胞凋亡的影响
表 2 D E X对C S E诱导的巨噬细胞凋亡的影响（i±s)
分组凋亡率/%凋亡相关蛋白表达量Bax Bcl-2
对照组 2. 53±0. 370• 24±0_ 040. 87±0. 09 CSE21. 61±3. 09*0. 90±0. 07 _0. 19±0. 03* CSE+DEX 6. 54±0. 72#0. 46±0. 05#0. 51±0. 07# F267. 8338. 8224. 8
P<0. 001<0.001<0.001
图 2 D E X对C S E诱导的巨噬细胞凋亡相关蛋白表达的影响
注：与对照组比较/P<0.05；与CSE组比较//><0.05;« = 9。
2.3 D E X抑制自禮相关蛋白表达 Western blot实验 可知，相较C S E组，C S E+ D E X组的自噬相关蛋白L C
3
II和A T G7表达明显下调（P<0.05，图3和表3)。表 明D E X可抑制C S E诱导的巨噬细胞中自噬相关蛋白 的表达。(P<0. 05)；相较C S E组，C S E+ D E X组H19表达明显 下调（P<0.05)。表明D E X抑
制C S E诱导的巨噬细胞 H19表达。
LC3 I LC3 II
ATG7 GAPDH
表 4 q R T-P C R检测D E X对C S E诱导的巨噬细胞
H19表达的影响U±s)
分组H19
对照组1. 00±0. 14
CSE 3. 58±0. 28*
CSE+DEX1. 57±0. 21#
F349. 0
P<0. 001
注：与对照组比较，•尸<0.05；与CSE组比较//»<0. 05 ;n = 9、
图3 D E X对C S E诱导的巨噬细胞自噬相关蛋白表达的影响
表3 Western b l o t检测D E X对C S E诱导的巨噬细胞
自噬相关蛋白表达的影响
分组LC3 II /LC3 I ATG7对照组 2. 07±0. 230. 24±0. 04
新金瓶酶CSE 3. 83±0. 29*0. 83±0. 08*
CSE+DEX 2. 81±0. 21#0.42±0. 05#
F155.2235. 1
P<0.001<0. 001
注：与对照组比较/P<〇. 05；与CSE组比较，#P<0. 05;n = 9。2.5 H19过表达逆转D E X抑制C S E诱导的巨噬细胞凋亡和自噬丨.)E X作用于H19过表达的C S E诱导的 巨噬细胞时，相较空载组，细胞凋亡率由7.03%上升 至18.26%(P<0. 05，图4和表5)；且细胞中凋亡相关蛋白胞B a x的表达上调，抗凋
亡蛋白B d-2的表达下 调（P<0. 05)，自噬相关蛋A L C3 II和A T G7表达上调 (P<0.05，图5)。结果表明H19过表达逆转D E X抑 制C S E诱导的巨噬细胞凋亡和自噬。
2.4 D E X抑制C S E诱导的巨噬细胞H19表达 3 讨论
q R T-P C R检测结果如表4,C S E组H19表达明显上调 C0P D的诱因众多，包括职业接触粉尘、有毒烟雾
图4过表达H19逆转D E X对C S E诱导的巨噬细胞凋亡的影响
表5过表达H19逆转D E X对C S E诱导的巨噬细胞的影响U t)
分组细胞存活率（％)凋亡率（％)
凋亡相关蛋白表达M自噬相关蛋内表达量Bax Bd-2LC3D/LC3I ATG7
CSE+DEX100. 00±7. 19 6. 37±0. 820. 40±0. 040. 62±0. 09 2. 81±0. 190. 37±0. 05 CSE+DEX+pcDNA98. 17±8.057. 03±0. 790. 37±0. 050. 64±0. 08 2. 70±0. 230. 39±0. 04 CSE+DEX+pcDNA-H1955. 81 ±6. 24*18. 26±2. 06*0. 78±0. 09*0. 26±0. 05* 3.42±0. 35*0. 76±0. 07 * F108. 6217.6115.672. 6425.61144. 7
P<0. 001<0. 001<0. 001<0.001<0. 001<0. 001注：与CSE + DEX+p(、DNA 组比较，• P<0.05;n = 9o
和蒸汽等；也可能与个体自身危险因素有关，包括遗传 易感性、产前孕妇暴露于有害烟气和儿童气道感染引起的损伤等，具体发病机制尚不明确；但吸烟仍然是C0P D的第一诱因和最重要的独立危险因素，C S E中含有140多种具遗传毒性成分，是导致C0P D的重要 有害物质
[8]。
LC3 I |
LC3 II |
ATG7
GAPDH
篇雄
DEX
开关柜无线测温装置图5 过表达H19逆转D E X对C S E诱导的巨噬细胞调亡
和自噬相关蛋白表达的影响
目前临床多采用有创机械通气疗法C0P D，然而大量患者出现难以耐受机械插管而产生的对抗行 为；为了避免患者肺部感染，常采用选择性a2肾上腺 素受体激动剂右美托咪定作为镇静剂，由于其半衰期 较短，患者较少出现呼吸抑制，具有较高的安全性，临床上对C0P D急性加重期患者能起到较为明显的镇静 效果[~。
本研究利用C S E诱导巨噬细胞体外实验，证实 D EX可大幅度提高该细胞模型的存活率，具有一定的 保护作用，表明D E X除了通过选择性激动a2肾上腺 素受体发挥镇静作用外，还可对C S E诱导的巨噬细胞起到保护作用。进一步研究表明，C S E诱导的巨噬细 胞中凋亡蛋白B a x表达明显下调，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达上调；并检测到自噬相关蛋白LC3 II和ATG7 表达下调；D EX可抑制C0P D肺泡巨噬细胞增殖并降低凋亡和自噬。王春艳等h°]报道D E X通过下调凋亡 蛋白CaSpaSe3表达抑制新生大鼠海马神经细胞凋亡；赵义等m]报道D E X可通过TLR4/NF-KB信号通路抑 制N9小胶质细胞炎症因子的释放并抑制细胞凋亡；表明D E X可通过多个作用靶点调节细胞功能，对机体 细胞起保护作用。
l n c R N A H19是人类发现最早的I n c R N A，在人体内 发挥着重要的生理功能，近年来研究发现H19的过表 达促进胃癌和结肠癌细胞的转移和侵袭，亦可通过调 节M A P K和N F-k B信号通路促进动脉粥样硬化；H19 通过靶向m i R-29b-3P和激活T G F-b l信号传导，促进 肌腱分化[12_15]。本研究证实H19在C S E诱导的巨噬细胞模型中高表达，D E X处理后，细胞活性增强，凋亡 和自噬均被抑制；但H19的靶向作用机制尚不清楚，需要进一步研究阐述。
综上所述，DEX可通过靶向抑制H19，增强CSE 诱导的巨噬细胞活力，抑制细胞凋亡和自噬，本研究阐 明DEXC0P D的可能作用机制，为C0P D临床治 疗提供了一定的实验依据。焦微微
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(下转第66页
）
