15minutes of antibiotic exposure.angew.chem.int.ed.2016,55,9557-9561.
10.[5]zhou j,chizhik ai,chu s,jin d,single-particle spectroscopy for functional nanomaterials.nature 2020,579,41-50.
技术实现要素：
[0011]
本发明所要解决的技术问题是：目前检测
细菌的相关方法存在仪器设备复杂昂贵、检测步骤繁杂费时、可靠性不高等问题，不能满足快速、低成本且灵敏的细菌检测需求和临床需求。
[0012]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器，包括炔烃功能化金
纳米探针和叠氮功能化
基底；该化学传感器的检测原理为：在外源性cu
2+
存在的条件下，首先，cu
2+
被待检细菌捕获并还原为cu
+
，其中cu
+
随后作为催化剂触发叠氮功能化基底和炔烃功能化金纳米探针之间的点击化学反应，从而使金纳米颗粒结合在基底上，通过暗场显微镜计数，便可实现细菌定量检测。
[0013]
优选地，所述炔烃功能化金纳米探针为alkyne-peg
1000-sh修饰的金纳米探针，所述金纳米探针为：利用柠檬酸钠还原氯金酸的水热合成法制备的球状金纳米颗粒，或利用种子介导的生长方法制备的棒状或星状金纳米颗粒。
[0014]
优选地，所述叠氮功能化基底是通过如下方法制备而成：将玻片经过等离子体清洗使其表面带负电，再利用静电相互作用将pll
1600-peg
1000-nhs化合物修饰在玻片上；然后，利用nhs和nh2的相互作用，将胺基-叠氮化合物共价结合在玻片基底上；最后，经牛血清白蛋白bsa封闭活性位点后，即得叠氮功能化基片。
[0015]
优选地，所述的玻片为硼硅酸盐玻片，所述的胺基-叠氮化合物为11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺。
[0016]
优选地，所述叠氮功能化基底的表面通过硅胶构建成阵列微孔结构。
[0017]
本发明还提供了上述用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器的应用，包括在制备检测细菌的试剂盒或检测仪器中的应用，或在非诊断与目的的检测细菌中的应用。
[0018]
优选地，所述检测包括定量检测，所述检测的样本包括体液。
[0019]
本发明还提供了一种用于定量检测体液中细菌的试剂盒，其特征在于，包括上述用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器和cu
2+
溶液。
[0020]
优选地，所述试剂盒中还包括针对特定
菌株的特异性的核酸适配体修饰磁珠，用于捕获和富集体液中的目标菌株，以及核酸限制性内切酶，用于切割核酸适配体链，从而释放得到目标菌株，实现对目标菌株的检测。
[0021]
优选地，所述试剂盒中还包含使用说明书，所述使用说明书记载了如下检测方法：
[0022]
通过磁分离获取待测体液中目标菌株，将目标菌株、炔烃功能化金纳米探针和cu
2+
在叠氮功能化基底上共孵育，在暗场显微镜下观察单粒子的数目n，代入如下线性方程式中可计算出目标菌株的浓度c：
[0023]
n＝301log
10
c-32；
[0024]
从而实现对体液中目标菌株的定量检测。
[0025]
本发明还提供了一种非诊断与目的定量检测体液中细菌的方法，采用上述用
于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器进行检测，包括：
[0026]
通过磁分离获取待测体液中目标菌株，将目标菌株、炔烃功能化金纳米探针和cu
2+
在叠氮功能化基底上共孵育，在暗场显微镜下观察单粒子的数目n，代入如下线性方程式中可计算出体液中待测目标菌株的浓度c：
[0027]
n＝301log
10
c-32；
[0028]
从而实现对体液中目标菌株的定量检测。
[0029]
本发明的技术原理：
[0030]
本发明提出了细菌指导点击化学的单粒子成像策略，通过计数视野下目标反应纳米粒子的数目，实现目标细菌无需耗时培养、超灵敏及快速检测。在该策略中，外源性cu
2+
首先被待检细菌捕获并还原为cu
+
，其中cu
+
随后作为催化剂触发叠氮功能化基底和炔烃功能化金纳米颗粒之间的点击化学反应，从而使金纳米颗粒结合在基底上。通过暗场显微镜计数，便可实现细菌定量检测(如图1所示)。结合特异性适体磁分离技术，可以实现体液中目标细菌的定量检测。
[0031]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0032]
本发明针对当下迫切需要一种便携式、无需耗时培养及高灵敏度的细菌定量技术，结合单粒子显微成像可视化、高通量和灵敏度高的优势及细菌指导点击化学发生这一原理来实现细菌定量检测；本发明的单粒子点击化学传感器及检测试剂盒用于检测细菌时，具有灵敏度高、无需体外耗时培养、高通量、可视化、超灵敏、快速出结果及成本低的优点，可以满足临床检验需求。
附图说明
[0033]
图1为本发明基于铜稳态的单粒子生物正交成像技术即时检测细菌的工作原理图；
[0034]
图2为棒状金纳米颗粒、星状纳米颗粒和球状纳米颗粒的tem、uv-vis分光光度吸收曲线和粒径分布统计图；
[0035]
图3为炔烃peg修饰的棒状金纳米颗粒、星状纳米颗粒和球状纳米颗粒的作为成像探针时可行性分析；
[0036]
图4为生物正交单颗粒成像技术用于目标细菌定量检测(以炔烃peg功能化的星状金纳米颗粒作为探针：(a)不同浓度细菌参与生物正交反应时的暗场显微成像图；(b)目标菌株浓度从0到108cfu/ml，对应的散射信号数目的变化曲线；(c)在10
2-106cfu/ml浓度范围内，散射信号数目与目标菌株浓度对数值之间的线性关系图。
具体实施方式
[0037]
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0038]
实施例1：单粒子点击化学传感器的构建及检测试剂盒
[0039]
1、炔烃功能化金纳米探针的合成和表征
[0040]
通过经典的柠檬酸钠还原氯金酸的水热合成法制备球状金纳米颗粒，或利用种子介导的生长方法制备棒状和星状金纳米颗粒。应用tem、uv-vis和zeta-nano电位仪等表征纳米颗粒的物理化学性质，棒状金纳米颗粒平均长度是50nm(zeta电位值18.6mv)、星状纳
米颗粒平均粒径是60nm(zeta电位值-14.2mv)和球状纳米颗粒平均粒径是62nm(zeta电位值-27.1mv)，三者的紫外可见光谱特征吸收峰也佐证了纳米颗粒的等离子体共振性能符合暗场成像的需求(如图2所示)。在此基础上，将alkyne-peg
1000-sh修饰纳米颗粒表面，进一步优化等离子体纳米颗粒的形貌、粒径和peg化合物修饰浓度，以获得不同性能的单粒子光散射探针。最终考察颗粒物理参数对实验结果的最后影响。
[0041]
2、叠氮基功能化玻片基底的构建
[0042]
首先使用等离子体清洗仪清洗和处理硼硅酸盐玻片，使其表面带负电，利用静电相互作用将pll
1600-peg
1000-nhs化合物修饰在玻片上；利用nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和nh2相互作用，将11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺共价结合在基底上。经牛血清白蛋白(bsa)封闭活性位点后，4℃储存备用。
[0043]
进一步地，上述构建的叠氮功能化基底的表面通过硅胶构建成阵列微孔结构，可同时作为微孔阵列反应器，方便检测时使用，也避免了采用外源反应容器引入不必要的杂质或细菌，具体地，利用硅胶围栏粘合到基底上，构成微升容量的多微孔反应阵列储存备用，作为反应器孵育细菌时，可采用pdms膜进行覆盖，进一步避免外界污染源。并根据后续实验结果可进一步优化硅胶围栏构建的孔径大小和高度，从而保证高效稳定的生物正交反应发生。优化该反应器中反应物体积，并进一步优化硅胶围栏孔径大小和高度、用于pdms膜的厚度等参数，以保证微阵列反应器中最高效生物正交反应的发生，提高检测性能。
[0044]
基于上述构建的单粒子点击化学传感器，进一步制备成检测试剂盒用于体液中细菌的定量检测，该检测试剂盒包括：上述得到的炔烃功能化金纳米探针、叠氮基功能化玻片基底、cu
2+
溶液、特异性的核酸适配体修饰磁珠和核酸限制性内切酶，特异性的核酸适配体修饰磁珠用于捕获和富集体液中的目标菌株，用核酸限制性内切酶切割核酸适配体链，释放得到目标菌株，将目标菌株、炔烃功能化金纳米探针和cu
2+
在上述叠氮基功能化玻片基底上共孵育1小时后，在暗场显微镜下观察单粒子的数目，可实现目标菌株的定量检测。
[0045]
实施例2：单粒子点击化学传感器用于定量检测体液中的细菌的方法的构建
[0046]
1、基于叠氮化物-和炔烃-aunps之间的细菌指导点击化学构建检测体系
[0047]
将实施例2构建的微阵列反应器、实施例1制备的炔烃功能化金纳米探针、大肠杆菌atcc 25922(106cfu/ml)和cu
2+
共存并孵育1小时，启动生物正交反应的发生，在暗场显微视野下才能观察到单个纳米颗粒的散射信号。而不含cu
2+
时没有观察到暗视野下的散射信号，表明在细菌指导的点击反应中铜源存在的必要性(如图3所示)。
[0048]
2、评估检测限
[0049]
以炔烃peg功能化的星状金纳米颗粒为成像探针，以叠氮peg功能化玻片为基底。随着体系中cu
2+
和细菌的加入，cu
2+
不断被还原为cu
+
并触发生物正交反应，暗场显微视野下散射信号数目(n)与细菌浓度(c)对数值呈线性正相关(在102～106cfu/ml浓度范围内)，线性方程式为：n＝301log
10
c-32，相关系数r2＝0.989，并且低至100cfu/ml时仍可观察到散射信号，证明生物正交策略确实提高了纳米颗粒和基底的结合效率，大大提高了检测的灵敏度(图4所示)，而且避免假阴性结果的出现，这能够满足大多数体液样品中致病性细菌的检测。
[0050]
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出
若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器，其特征在于，包括炔烃功能化金纳米探针和叠氮功能化基底；该化学传感器的检测原理为：在外源性cu
2+
存在的条件下，首先，cu
2+
被待检细菌捕获并还原为cu
+
，其中cu
+
随后作为催化剂触发叠氮功能化基底和炔烃功能化金纳米探针之间的点击化学反应，从而使金纳米颗粒结合在基底上，通过暗场显微镜计数，便可实现细菌定量检测。2.如权利要求1所述的用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器，其特征在于，所述炔烃功能化金纳米探针为alkyne-peg
1000-sh修饰的金纳米探针，所述金纳米探针为：利用柠檬酸钠还原氯金酸的水热合成法制备的球状金纳米颗粒，或利用种子介导的生长方法制备的棒状或星状金纳米颗粒。3.如权利要求1所述的用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器，其特征在于，所述叠氮功能化基底是通过如下方法制备而成：将玻片经过等离子体清洗使其表面带负电，再利用静电相互作用将pll
1600-peg
1000-nhs化合物修饰在玻片上；然后，利用nhs和nh2的相互作用，将胺基-叠氮化合物共价结合在玻片基底上；最后，经牛血清白蛋白bsa封闭活性位点后，即得叠氮功能化基片。4.如权利要求3所述的用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器，其特征在于，所述的玻片为硼硅酸盐玻片，所述的胺基-叠氮化合物为11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺。5.如权利要求1所述的用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器，其特征在于，所述叠氮功能化基底的表面通过硅胶构建成阵列微孔结构。6.权利要求1～5中任意一项所述的用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器的应用，其特征在于，包括在制备检测细菌的试剂盒或检测仪器中的应用，或在非诊断与目的的检测细菌中的应用。7.一种用于定量检测体液中细菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5中任意一项所述的用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器和cu
2+
溶液。8.如权利要求7所述的用于定量检测体液中细菌的试剂盒，其特征在于，还包括针对特定菌株的特异性的核酸适配体修饰磁珠，用于捕获和富集体液中的目标菌株，以及核酸限制性内切酶，用于切割核酸适配体链，从而释放得到目标菌株，实现对目标菌株的检测。9.如权利要求7或8所述的用于定量检测体液中细菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含使用说明书，所述使用说明书记载了如下检测方法：通过磁分离获取待测体液中目标菌株，将目标菌株、炔烃功能化金纳米探针和cu
2+
在叠氮功能化基底上共孵育，在暗场显微镜下观察单粒子的数目n，代入如下线性方程式中可计算出体液中待测目标菌株的浓度c：n＝301 log
10
c-32；从而实现对体液中目标菌株的定量检测。10.一种非诊断与目的定量检测体液中细菌的方法，其特征在于，采用权利要求1～5中任意一项所述的用于快速检测细菌的单粒子点击化学传感器进行检测，包括：通过磁分离获取待测体液中目标菌株，将目标菌株、炔烃功能化金纳米探针和cu
2+
在叠氮功能化基底上共孵育，在暗场显微镜下观察单粒子的数目n，代入如下线性方程式中可计算出目标菌株的浓度c：n＝301 log
10
c-32；
从而实现对体液中目标菌株的定量检测。
技术总结
本发明公开了一种单粒子点击化学传感器用于体液中细菌的快速检测。本发明首先构建了一种单粒子点击化学传感器，其包括炔烃功能化金纳米探针和叠氮功能化基底；在外源性Cu
技术研发人员：
田彤彤 郭玮 王蓓丽 潘柏申
受保护的技术使用者：
复旦大学附属中山医院
技术研发日：
2022.08.29
技术公布日：
2022/11/25
