共聚焦激光扫描显微镜在药剂学中的应用
赖丽芳，郭红霞*
（山东大学药学院药物制剂研究所，济南 250012） 摘要：目的介绍共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)的基本原理和CLSM在药剂学研究中的应
用。方法参阅具有代表性的最新文献，分析和讨论CLSM在药剂学领域的应用。结果与结
论CLSM是一项新的、近年来发展较快的对样品无损害的成像技术，它在药学研究领域必
将得到更加广泛和深入的应用。
关键词：共聚焦激光扫描显微镜；经皮和粘膜吸收；细胞水平；微粒结构；药物成型机制和 释药机制梭织机
The application of confocal laser scanning microscope in pharmaceutics
Lai Lifang, Guo Hongxi a*
燕尾槽铣刀自从1980年Petran等[1]发明共聚焦激光扫描显微镜以来，CLSM受到了广泛的关注，其在
医学、生物学、药学研究等方面得到了广泛应用。CLSM的主要原理[2,3]是：利用激光扫描束
通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针
孔到达光电倍增管(PMT)，再经过信号处理，在计算机监视屏上形成图像，其结构图见图1。CLSM采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个带有小孔的挡板，平面以外的杂散光被
塑料拖把头挡住，消除了球差，并进一步消除了差，且可将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十
分细小的激光束(点光源) 逐点逐行扫描成像，再通过微机组合成一个平面的或立体的图像。
CLSM的主要优点有[4]：共聚焦图像具备高反差、高清晰度、定位准确的优点，克服了荧
鱼笼光显微镜照射面积大、层面不清、定位不准等缺点。使用共聚焦激光扫描显微镜不会损坏样品，可用于活细胞的研究，不需进行样品前预处理，能很好地再现样品的真实情况。而且CLSM对于相对较厚的样品可以逐层地获得物体光学横断面的图像，得到样品的三维图像，提
供比传统显微镜更详尽的样品信息。目前在药剂学领域主要应用于药物经皮和粘膜吸收的研究、粘膜吸收促进剂作用机制的研究、药物的细胞摄取、穿透性能及与细胞相互作用的机制金属接线盒
研究和载药微粒结构观察、药物成型机制及释药机制等方面的研究。
作者简介：赖丽芳，女，硕士研究生
*通讯作者：郭红霞，女，教授，硕士生导师Tel:(0531)88382007E-mail:******************
图1 CLSM工作原理图：（1）激光（2）双向镜（3）物镜（4）样品（5）共聚焦针孔（6）光电倍增管
1 CLSM用于药物剂型经皮和粘膜吸收的研究
早在19世纪80年代，Mezei等人就进行了脂质体局部给药的研究。由于脂质体的结构与生物细胞膜相似，皮肤吸收好且有很好的生物相容性，因此有很好的局部用药前景。但是，皮肤中的毛孔大小通常为0.3nm, 最大可到20 40nm, 所以很难理解完整的脂质体是如何通过皮肤参与经皮转运的。Cevc等[5]则认为具变形性的混合脂质囊泡能穿透皮肤。为证明此假设，他们用两种不同的荧光标记物标记了脂质囊泡，将囊泡混悬液应用于完整的小鼠皮肤上。应用CLSM观察该皮肤后发现在角质层中两种荧光物的分布很难区分，从而证实了他们的假设。通过CLSM他们还发现变形性囊泡与普通囊泡的穿透行为大不相同。变形性囊泡能完整地穿过半透性生物屏障，而普通囊泡在通过屏障时易被阻塞或中断。 影响药物皮肤吸收的因素很多，包括分子大小、组分的亲脂性、处方组成、渗透促进剂的使用及皮肤角质层的物理状态等。Verma 等[6]研究了两种荧光标记脂质体的大小对皮肤吸收的影响，实验中将亲水性荧光复合物CF和亲脂性荧光复合物DiI包裹入脂质体，应用Franz 扩散池和标准皮肤洗提技术进行人体腹部皮肤的体外渗透试验，以到脂质体局部用药的最佳粒径。他们应用CLSM观察脂质体渗透
能力，发现DiI脂质囊泡粒径为71nm时在皮肤中荧
光强度最大，CF脂质体粒径为120nm时能更好地促进皮肤的吸收。Verma等[7]在研究以脂质体为载药系统将药物运载至皮肤的机制中，将脂质体用羧基荧光素（CF）标记后，用CLSM 技术可得到CF经过预定的时间到达表皮及皮肤深层的量。CLSM不用对样品进行冻结固定就能直接观察，且能穿透皮肤深层进行观察，所以被广泛地应用于亲水和亲脂标记物在皮肤中的显像及标记物强度的分析中。
1.2 CLSM应用于微粒及纳米粒粘膜吸收研究
近年来，胶体载药系统由于能延长药物在血液中的循环时间而备受关注。其中将生物可降解的纳米粒用PEG包衣是一很有前景的载药系统。与未包衣的PLA微粒相比，PEG长循环微粒被单核巨噬细胞摄取的量有所降低。PEG长循环纳米粒不仅能延长药物循环时间，Tobío 等[8，9]发现它还能影响PLA纳米粒与生物膜表面诸如鼻粘膜及肠粘膜的相互作用，是粘膜给药的良好载体系统。为研究PLA-PEG纳米粒粒径及PEG包衣密度对鼻粘膜转运的影响，Vila 等[10]用不同分子量的PLA-PEG聚合物及不同的制备方法制备了不同粒径、不同PEG包衣密度的PLA-PEG纳米粒，将这些荧光标记的微粒注入小鼠体内，应用CLSM技术研究它们与鼻粘膜的相互作用及其转运过程。CLSM结果显示PLA-PEG纳米粒在鼻粘膜中的荧光强度远高于PLA纳米粒，表明PEG包衣对促进鼻上皮细胞转运有较大影响。同时小鼠鼻粘膜CLSM结果表明PLA-PEG粒子能穿透粘膜，其穿透能力不仅受粒子粒径影响，也与PEG包衣密度有关。
CLSM在考察某种聚合物能否作为粘膜吸收的载体材料时也发挥了重要作用。Vila等[11]应用CLSM考察了低分子量壳聚糖（CS）纳米粒能否作为一种长效鼻用疫苗的载体。他们将破伤风毒素（TT）用离子交联法包裹入低分子量CS纳米粒中，FITC-BSA标记后应用CLSM 观察纳米粒与小鼠鼻粘膜的相互作用。CLSM结果表明CS纳米粒能穿透鼻上皮细胞，从而可以运载抗原。研究结果表明低分子量CS是一较有前景的鼻用疫苗运输载体。
1.3 CLSM应用于口服疫苗肠粘膜吸收的研究
口服疫苗在很多方面优于注射剂，但疫苗在消化道易降解且较难进入胃肠道的淋巴组织，限制了口服疫苗的发展。Van der Lubben等[12]用CLSM技术研究了壳聚糖微粒被鼠类Peyer's片段摄取的情况，CLSM结果显示模型抗原卵白蛋白被包裹于壳聚糖微粒中，结合体内试验证明了荧光标记的壳聚糖微粒能被小鼠Peyer's片段的上皮组织吸收。同时进行的其它实验表明所制备的壳聚糖微粒的释放行为适合用于口服，而Peyer's片段的吸收是口服疫苗的关键过程，这些结果表明壳聚糖微粒是一很有前景的疫苗转运载体。
2 CLSM应用于粘膜吸收促进剂作用机制的研究
对于甲基β－环糊精促进鼻粘膜吸收的作用机制，有人认为是通过打开鼻上皮组织紧密连接达到细胞增渗作用的。Marttin 等[13]用透射电子显微镜研究了甲基β－环糊精对鼠鼻上皮组织紧密连接的影响，
用CLSM研究了甲基β－环糊精对鼠上皮组织细胞骨架的影响，并将甲基β－环糊精的作用与吸收促进剂牛磺二氢甾酸霉素钠（STDHF）做比较。经研究发现，向小鼠体内注射2％甲基β－环糊精后细胞支架肌动蛋白的分布与未处理的对照组相同，说明甲基β－环糊精并不是通过对细胞支架的作用以打开细胞的紧密连接。而注射1％STDHF的小鼠肌动蛋白分布发生了改变，鼻上皮组织也被严重破坏，通过CLSM发现STDHF会使细胞肿胀及粘液外渗，说明STDHF并不是暂时打开紧密连接，它损坏了上皮组织破坏了细胞紧密连接的完整性。因此Marttin等推断甲基β－环糊精的促吸收机理是通过提高膜流动性以打开细胞紧密连接的。
3CLSM用于药物在细胞水平上的研究
Win等[14]用Caco-2细胞体外模型研究了纳米粒的细胞摄取情况，以达到生物可降解纳米粒应用于口服化疗的目的。他们考察了荧光聚苯乙烯纳米粒、PV A包衣的PLGA纳米粒及维生素E- d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（Vit E-TPGS）包衣的PLGA纳米粒的定位及细胞摄取情况。使用荧光光谱法定量地研究了纳米粒粒径及粒子包衣对细胞摄取的影响。CLSM、扫描电子显微镜及透射电子显微镜的图像显示纳米粒能被Caco-2细胞摄取，而Vit E-TPGS包衣的PLGA纳米粒能最显著地提高细胞摄取量。
用CLSM观察纳米载药系统如脂质体和胶束与靶向细胞的相互作用，考察纳米载药微粒进入细胞后的
情况。通过荧光显微镜已证实了抗体介导靶向的免疫载药胶束与非靶向载药胶束和直接用药相比，具有更强的癌细胞杀伤力。Torchilin[15]用CLSM观察单克隆抗体2C5修饰的PEG-PE免疫胶束与各种癌细胞的体外结合，发现该免疫胶束能识别许多癌细胞并能与
这些细胞特异性结合；而非抗体胶束在体外并未与这些癌细胞发生结合。
客户端开发
随着基因的发展，如何将核苷酸安全载入细胞内成为急需解决的问题。如何将DNA、多肽等生物药物运载至细胞内给制剂研究带来了极大挑战。近年来发展了一种新的给药方法，开发出了一种能穿透细胞，并将其中的遗传物质导入哺乳动物细胞核中的病毒。现有一组病毒蛋白质引起了广泛的关注，这种病毒蛋白能转导至细胞质中，被称为“转导蛋白”。其中的TAT蛋白已被证实能穿透多种细胞。TAT介导的大分子物质及纳米粒的胞内转运是通过细胞内吞作用进入胞内，进而从内涵体中脱离进入细胞质。CLSM可用来观察细胞穿透性肽TAT修饰的脂质体被各种细胞捕获的情况及TAT-脂质体在细胞内的运转情况。Schwarze
等[16]已成功地将TAT修饰的β－牛乳糖导入小鼠的各组织中。近来已证实粒径约200nm的脂质体经TAT修饰后能转运到不同细胞中。利用共聚焦显微镜观察TAT脂质体在胞内的定位，发现大部分脂质体定位于细胞的内部而非表面。所以只要在脂质体表面连接足够的TAT肽类分子，粒径为150－200nm的普通脂质体或长循环脂质体也能有效地转导入各种细胞内。
有假说认为细胞穿透性肽类（CPPs）能携带大分子穿透细胞质膜而不需要任何受体、运载体，也不涉及内吞作用及耗能机制。Krämer等[17]设计了一种方法以研究CPPs对双分子脂膜的穿透力。将HIV-1 TA T肽类物质与SAM共轭连接，置于含Tb3+的脂质体中。CPP
TAT(44-57)-SAM和TAT(37-53)-SAM作为阴性对照不能透过脂质体。用CLSM研究荧光标记TAT的细胞透过性，发现TAT(44-57)－荧光素不能进入MDCK细胞的完整质膜而聚集于其基面，只有在受损的质膜上才会有蓄积的TAT（44-57），由此得出TAT(44-57)肽类只能穿透受损细胞的结论。他们的发现否定了TAT能作为胞内靶向转运载体的观点。将新的脂质体分析方法与CLSM技术相结合，可进一步考察CPPs穿透双分子脂膜及完整细胞的能力。
CLSM也用于细胞吸收促进剂穿透细胞性能的研究。Kotzé[18]等发现一种部分季铵化的壳聚糖衍生物TMC具较好的水溶性，通过CLSM发现其能提高水溶物右旋糖酐及肽类药物乙基酰胺在体外Caco-2细胞单层中的穿透性。他们研究了几种不同的壳聚糖盐及TMC 提高肠道上皮细胞渗透性的能力，发现它们均可以提高大分子亲水化合物的转运能力。CLSM结果表明壳聚糖盐及TMC能打开控制细胞渗透性的紧密连接，提高药物的转运能力。研究发现较低季铵化程度的TMC能在各种pH溶液中溶解。通过他们的研究可知壳聚糖及TMC能作为有效的吸收促进剂。
总之，利用CLSM能获得诸如脂质体、胶束等靶向制剂与细胞的相互作用及进入细胞后的信息。这些信息有助于研究药物载体在机体内的转运机制，进而有利于发展载药系统。
4 CLSM应用于载药微粒的结构研究
观察微球和微囊的常用方法有光学显微镜（LM）和扫描电子显微镜(SEM)[19，20]，但LM 易受光学焦平面以外的散光的影响，SEM通常需要对样品进行预处理且不能用于观察物体的内部结构，所以需要寻一种能用于观察微粒内部结构的显微技术。Lamprecht等[21]在1999年探讨了CLSM是否能作为观察微囊结构特征的新工具。他们应用复凝聚法制备微球，然后将油相、明胶、阿拉伯胶分别进行荧光标记。通过CLSM首先成功定位了尼罗红标记的油相；其次，通过CLSM考察了FITC标记的明胶及RBITC标记的阿拉伯胶两种聚合物在囊壁材料中的分布。研究结果表明CLSM可用于评价和描述微球，观察被包封相的分布、沉积和微球表面及内部聚合物的结构，它能提供微粒的三维视图且具很高的清晰度。
