11月13日
4.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用 | 引物长度要求 | 纯度级别要求 |
一般PCR扩增 | <45 base | OPC |
一般PCR扩增 | >45 base 摄像机机芯 | PAGE |
诊断PCR扩增 | < 40base 陶瓷防静电活动地板 | OPC, PAGE |
DNA测序 | 20base左右 | OPC |
| 根据实验要求定 | OPC, PAGE，HPLC |
基因构建（全基因合成）
| 根据实验要求定 | PAGE |
反义核酸 | 根据实验要求定 | PAGE |
修饰引物
|
根据实验要求定
| PAGE, HPLC |
| | |
8.如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.
9.如何计算引物的Tm值？
答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。
11.如何溶解引物？
答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。整流罩溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。12.如何保存引物？答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。13.合成的引物5’端是否有磷酸化答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高 退火温度。
16.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？
答：下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆在引物的5’端避免使用G。
◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。
有用的荧光染料参数
Name |
吸收波长
|
发射波长
| colors |
6-FAM （6-carboxy-fluorescein） | 494nm | 518nm | Green |
TET （5-tetrachloro-fluorescein） | 521nm | 538nm | Orange |
HEX （5-hexachloro-fluorescein） | 535nm | 553nm | Pink |
TAMRA（tetramethyl-6-carboxyrhodamine） | 560nm | 582nm | Rose |
ROX （6-carboxy-x-rhodamine） | 587nm | 607nm | Red |
Cy3 （Indodicarbocyanine） | 552nm | 570nm | Red |
Cy5（Indodicarbocyanine） | 643nm | 667nm | Violet | 7bbuu
| | | |
20.Primer设计的基本原则是什么？
答：引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。防误闭锁
◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：引物应该全是DNA，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个插销螺母20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比
值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
