一种生产靛蓝素的工程菌的制作方法

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1.本发明涉及生物技术、食品添加剂及染料制造技术领域，具体涉及一种生产靛蓝素的工程菌。

背景技术：

2.靛蓝是在我国已经具有几千年历史的传承经典，从不衰退。只是社会在前进。科技在进步，如今的靛蓝素绝大部分来自于化学合成，只有极少数来自于植物生产天然靛蓝，也只有极少数人能享受到由天然靛蓝素加工而来绿产品。大部分人在生活中穿着含有苯胺、硝基苯、邻苯二甲酸酐等有毒成分的化学合成靛蓝染料染而成的衣服，吃着化学合成素染的食物，虽然这些素的使用及其有毒物质含量在国家文件规定及政策许可的范围，但是，长期使用会对人体造成危害，甚至致病，严重影响人类身体健康。随着人们生活水平的提高和健康意识能力的增强，寻求更健康、更环保的绿天然靛蓝素，回归自然的健康原生态，已经成为人们的企盼。
3.绿天然靛蓝素既可以来自木蓝、菘蓝、蓼蓝、马蓝等植物，又可以来自pseudomonassp.，acinetobacter sp.，bacillus megatreium等微生物。来自于植物的靛蓝具有古老、经典等特，其产量较低，提取出来的天然靛蓝产量仅仅是原材料的1％-2％不等。即使许多学者在提取技术方法上不断改进，以及应用分子生物学技术对植株进行转基因研究，其效果也不尽人意，最终的产量还是保持原有的现状。人们只能通过大规模种植相应植物，以此增加生物量来换取更多的天然靛蓝素，但是，这种方式带来的经济效益又大打折扣。研究者和企业家将目光转向了微生物，微生物如何合成靛蓝素深受研究者们的青睐，微生物合成靛蓝素的文献被大量报道，目前已知晓微生物生成靛蓝的大概路径，并且研究了许多微生物中的加氧酶，如萘双加氧酶、苯酚羟化酶、二甲苯单加氧酶、黄素蛋白单加氧酶、细胞素p450单加氧酶、铜依赖单加氧酶等等，以及多种酶的作用及其作用机制。同时，也有一些研究者构建工程菌进行合成靛蓝素方面的研究，利用代谢工程手段对合成途径及关键基因进行了优化改造，并取得了一定的效果，但终因资源、成本及技术等多方面因素的限制，微生物合成靛蓝工业化最终未能实现。
4.从实验室研究的角度，根据已报道的文献及专利来看，有研究以吲哚为底物合成靛蓝素的，也有研究以氨酸为底物合成靛蓝素的，却未见有经过基因组dna改造，直接利用培养基中的营养成分(如碳源、氮源等)合成靛蓝素的工程菌。
5.综上所述，急需一种生产靛蓝素的工程菌以解决现有技术中存在的问题。

技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种生产靛蓝素的工程菌，具体技术方案如下：
7.一种生产靛蓝素的工程菌，所述工程菌为bl21 (de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp+)，获得该工程菌的具体过程为：
8.选择大肠杆菌bl21(de3)；
9.使用crispr/cas9技术，利用grna靶向trpr基因，将trpr基因序列剪断；
10.利用λred同源重组酶将供体dna通过同源重组方法插入trpr基因中，得到该工程菌；所述供体dna包括trpr上游同源臂、启动子、tnaa-opt-cyp450融合基因、amp 抗性基因、终止子以及trpr下游同源臂；所述tnaa-opt-cyp450融合基因序列如seq idno.1所示。
11.优选的，所述供体dna的制备过程具体如下：
12.将tnaa-opt-cyp450融合基因克隆构建至原核表达载体pet-22b中，获得重组表达质粒pet-22b-tnaa-opt-cyp450；
13.分别设计引物，以pet-22b-tnaa-opt-cyp450为模板，供体引物f2/r2进行pcr获取启动子、终止子、tnaa-opt-cyp450融合基因和amp抗性基因；
14.以大肠杆菌基因组为模板，供体引物f1/r1和供体引物f3/r3进行pcr获取trpr上游同源臂、trpr下游同源臂；
15.再通过pcr获得供体dna。
16.优选的，所述tnaa-opt-cyp450融合基因包括tnaa基因与opt-cyp450基因，所述 tnaa基因的genbank id为nc_000913.3；所述opt-cyp450基因为基于genbank id为 mg857655.1的马蓝细胞素cyp450mrna序列的核酸和氨基酸序列信息经过分析编码并根据大肠杆菌的密码子偏好优化后所得，所述opt-cyp450基因序列如seq id no.4所示。
17.优选的，所述opt-cyp450基因序列经过大肠杆菌的密码子偏好优化的参数具体包括：
18.1)所述opt-cyp450序列的密码子适应指数cai优化前为0.67，优化后为0.97；
19.2)所述opt-cyp450序列中的碱基gc含量优化前以及优化后均为0.5；
20.3)所述opt-cyp450序列优化前含有ncoi、xhoi、saci和ecori限制性内切酶识别位点，优化后不含ncoi、xhoi、saci和ecor i限制性内切酶识别位点；所述isdna序列的回避序列优化后移除了2个aataaa碱基序列和1个attaaa碱基序列；
21.4)删除所述opt-cyp450的重复序列；优化前重复序列的最大正向和最大反向长度均为12bp，优化后最大反向长度为14bp。
22.优选的，所述的工程菌应用于工业生产天然的靛蓝素。
23.应用本发明的技术方案，具有以下有益效果：
24.(1)本发明提供的一种生产靛蓝素的工程菌，通过以大肠杆菌bl21为底盘细胞，基于同源氨酸酶tnaa基因序列和opt-cyp450基因，通过grna和λred的组合作用，将供体dna通过同源重组方法插入trpr基因中，得到该工程菌；所述供体dna包括trpr 上游同源臂、启动子、tnaa-opt-cyp450融合基因、amp抗性基因、终止子以及trpr下游同源臂；改造后的工程菌株产生天然靛蓝素染料，为靛蓝生物合成的工业化生产提供菌种。
25.(2)本发明的工程菌可利用培养基中营养成分直接产生天然靛蓝染料；该工程菌株为实现天然靛蓝素生物合成的工业化定向设计奠定基础。
26.除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
27.构成本技术的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实
trpr下游同源臂(参见图1)。
48.(3)质粒构建及供体dna制备
49.pcas质粒：直接使用，该质粒为卡那霉素抗性，可表达用于基因剪切的cas9、促进同源重组的λred重组酶、消除ptargetf质粒的元件。
50.grna质粒构建：将靶向trpr基因的grna连接至ptargetf质粒中，该质粒为氯霉素抗性，表达用于识别dna靶点并指导cas9切割dna的grna。
51.供体dna制备：将化学合成的tnaa-opt-cyp450融合基因克隆构建至原核表达载体 pet-22b中，获得重组表达质粒pet-22b-tnaa-opt-cyp450。分别设计引物，以 pet-22b-tnaa-opt-cyp450为模板，供体引物f2/r2进行pcr获取启动子、终止子、 tnaa-opt-cyp450融合基因和amp抗性基因；以大肠杆菌基因组为模板，供体引物f1/r1 和供体引物f3/r3进行pcr获取trpr上游同源臂、trpr下游同源臂；再通过pcr(pcr 引物序列参见表2所示)获得供体dna(trpr上游同源臂
‑‑
启动子
‑‑
tnaa-opt-cyp450表达框
‑‑
amp抗性基因
‑‑
终止子
‑‑
trpr下游同源臂)所述供体dna序列如seq id no.2所示。
52.表2供体dna制备中pcr引物序列
53.引物名称序列信息供体引物f1tatcggaattaattcggatccccaaaagtgaaatcaccggtagg供体引物r1attaagcattggtaatcactattattgttgggccataatatg供体引物f2ggcccaacaataatagtgattaccaatgcttaatcagtgaggc供体引物r2acgctgttctgccatcactgcccgctttccag供体引物f3actggaaagcgggcagtgatggcagaacagcgtcacca供体引物r3ttgtcgacggagctcgaattctattgatgagattggtcgtaaggaa
54.(4)基因编辑
55.将pcas质粒转化至bl21(de3)感受态细胞中，然后用含卡那霉素的固体培养基于 30℃过夜培养。随后用含pcas质粒的bl21(de3)细胞制备电转感受态细胞，电转导入 ptargetf和线性供体dna，然后用含卡那霉素+氯霉素+阿拉伯糖固体培养基于30℃过夜培养。挑取单克隆进行pcr鉴定，引物f1设计在bl21(de3)基因组dna中(上游同源臂的第-473位碱基)，引物r1设计在供体dna中(上游同源臂的第69位碱基)。当供体dna成功插入到bl21(de3)基因组dna指定位置，用f1和r1进行pcr鉴定可获得1054bp的条带；若插入失败或者脱靶，则用f1和r1进行pcr鉴定无条带。
56.引物f2设计在bl21(de3)基因组dna中(下游同源臂的第-384位碱基)，引物 r2设计在供体dna中(下游同源臂的第187位碱基)。当供体dna成功插入到bl21 (de3)基因组dna指定位置，用f2和r2进行pcr鉴定可获得1087bp的条带；若插入失败或者脱靶，则用f2和r2进行pcr鉴定无条带。
57.当供体dna成功插入到bl21(de3)基因组dna指定位置，用f1和r2进行pcr 鉴定可获得7864bp的条带；若插入失败或者脱靶，则用f1和r2进行pcr鉴定可获得 1688bp的条带(鉴定pcr引物序列参见表3所示)。
58.表3鉴定pcr引物序列
59.引物名称序列信息鉴定引物f1aggcggatttactgctggaacg
鉴定引物r1tctgtctatttcgttcatccat鉴定引物f2aatgagggcatcgttcccactg鉴定引物r2cagaggctgatttttgggtggc
60.pcr鉴定结果参见图6所示，其中，m：dna分子标记；1：bl21 (de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
)基因组dna，f1/r1pcr产物，条带1054bp，符合预期；2：bl21(de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
)基因组dna，f2/r2pcr产物，条带1087bp，符合预期；3：bl21(de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
)基因组dna， f1/r2pcr产物，条带7864bp，符合预期；4：bl21(de3)基因组dna，f1/r1pcr产物，无条带符合预期；5：bl21(de3)基因组dna，f2/r2pcr产物，无条带符合预期； 6：bl21(de3)基因组dna，f1/r2pcr产物，条带1688bp，符合预期。
61.实施例2：适于大肠杆菌高效表达的cyp450基因序列的设计与密码子偏好优化
62.所述基因序列seq id no.3，即cyp450，genbank序列号为genbank id：mg857655.1，为了提高cyp450的表达量，采用基因设计软件(optimumgenetm)对cyp450的dna 序列seq id no.3进行分析编码(来源于噬甲基菌属的methylophaga sp.sk1)，并根据大肠杆菌偏好性进行密码子偏好优化，优化后的cyp450基因命名为opt-cyp450基因，其序列如seq id no.4所示，以使其可以有效的在大肠杆菌中大量表达。
63.参见图2-5，所述cyp450的部分密码子偏好调节前后变化可见，所述cyp450异源基因序列seq id no.3和优化后的序列seq id no.4的gc含量均为50％，但gc在序列中的分布位置发生的改变。
64.优化后的所述cyp450的限制性内切酶与移除序列(restriction enzyme and avoidsequence)变化，如表4和表5所示。
65.表4限制性内切酶位点变化
66.restriction nameoriginaloptimizationsaci10ecori10ncoi10xhoi10
67.表5移除序列
68.removedoriginaloptimizationaataaa20attaaa10
69.具体的，适于大肠杆菌高效表达的cyp450基因序列的设计与密码子偏好优化的具体过程如下：
70.1)escherichia coli(大肠杆菌)密码子适应指数优化；
71.2)gc含量分布优化；
72.3)酶切位点的优化：为便于构建克隆及亚克隆，优化原有序列中ncoi、xhoi、saci 和ecori限制性内切酶识别序列；
73.4)优化后序列与优化前马蓝细胞素p450单加氧酶基因序列(genbank:mg857655.1) 的同源性仅为74.8％。由于优化前后dna序列差异较大，在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 网站上不能比对上相关dna序列
(nosignificantsimilarityfound)，故命名为opt-cyp450 dna序列。
74.tnaa-opt-cyp450融合基因序列如seq id no.1：
75.atggaaaactttaaacatctccctgaaccgttccgcattcgtgttattgagccag taaaacgtaccactcgcgcttatcgtgaagaggcaattattaaatccggtatgaaccc gttcctgctggatagcgaagatgtttttatcgatttactgaccgacagcggcaccggg gcggtgacgcagagcatgcaggctgcgatgatgcgcggcgacgaagcctacagcgg cagtcgtagctactatgcgttagccgagtcagtgaaaaatatctttggttatcaataca ccattccgactcaccagggccgtggcgcagagcaaatctatattccggtactgattaa aaaacgcgagcaggaaaaaggcctggatcgcagcaaaatggtggcgttctctaact atttctttgataccacgcagggccatagccagatcaacggctgtaccgtgcgtaacgt ctatatcaaagaagccttcgatacgggcgtgcgttacgactttaaaggcaactttgac cttgagggattagaacgcggtattgaagaagttggtccgaataacgtgccgtatatcg ttgcaaccatcaccagtaactctgcaggtggtcagccggtttcactggcaaacttaa aagcgatgtacagcatcgcgaagaaatacgatattccggtggtaatggactccgcgcg ctttgctgaaaacgcctatttcatcaagcagcgtgaagcagaatacaaagactggac catcgagcagatcacccgcgaaacctacaaatatgccgatatgctggcgatgtccgcc aagaaagatgcgatggtgccgatgggcggcctgctgtgcatgaaagacgacagcttc tttgatgtgtacaccgagtgcagaaccctttgcgtggtgcaggaaggcttcccgaca tatggcggcctggaaggcggcgcgatggagcgtctggcggtaggtctgtatgacggc atgaatctcgactggctggcttatcgtatcgcgcaggtacagtatctggtcgatggtct ggaagagattggcgttgtctgccagcaggcgggcggtcacgcggcattcgttgatgc cggtaaactgttgccgcatatcccggcagaccagttcccggcacaggcgctggcctg cgagctgtataaagtcgccggtatccgtgcggtagaaattggctctttcctgttaggc cgcgatccgaaaaccggtaaacaactgccatgcccggctgaactgctgcgtttaacc attccgcgcgcaacatatactcaaacacatatggacttcattattgaagcctttaaaca tgtgaaagagaacgcggcgaatattaaaggattaacctttacgtacgaaccgaaagt attgcgtcacttcaccgcaaaacttaaagaagtttaaatggaagccacctatgcaag cgcaatctatggcgcagtggcactgtttctgctgttttattattatctgctgaccaaaa gcagcaaacataaactgccgccggaagccccgggtgcacgccacttacatctgatgg caggtggtgcaaccagtagcgcaaaaccgccgcatattattctgggcgccctgagtg atcagcatggcccgatttttaccctgcgcctgggtgttcgccgcattctgctggtgag cagcagccgtattgccaaagaactgtttaccagtagtgatctggccattagcagccgt ccgaaaacccgtggcattaagcatctgggctatgattttgttatgtttgcattttctcc gtatagtgcatattggcgccacatgcgtaaactggttaccgttgaactgctgagcagt catcgtgcagaactgtttagcagcgtgggtatggaagaagtgaaacagagtgttaaa gaactgcatgcagtttgggaaggcaaaaaagatggtagcggccagctgctggttgat atgcgtaattggctggcagatatgaatctgaataccattctgcgtcaggtggtgggca aacgtctgtgtggtggtggcggcggtgacgatgccgaagaaatgcgccagtgtcgc gatgcaatttgggatttctttcatctggtgggcctgtttgttccggcagatgcactgc cgtggctgggctggctggatctgggtggttatgaaaagaaaatgaaagaaaccgca aagaaactggaaggcattatgggcggctggctggaagaacatcgtcgcaaagaatat agtggtggtgaaggtaaagtggaagattttatggatgtgattctgagtgcagtgcgc ggcagtgaaggtgaatatgaacatgatgttgataccgtgattaagagcacctgccag ctgatgattctgggtgcaaccgatacctttgccgtgaccctgacctgggccctgagcc tgctgctgaataatcgtcatgtgctgaccaaagcccaggaagaactggataaacatg tgggtcgtcataaaggtgtgaataagagcgatatttgcaatctggtttatctgcaggc aattgtgaaagaaaccctgcgtctgtatccggccgccccgctgggtggtcctcgtga gtttcgtgaagattgtaatattgccggttatcatattccgaaaggtacctggctgatgg ttaatgtttggaaactgcatcgcgatccgcaggtgtggcaggataatccgctggattt taaaccggaacgttttctgaccacccataaaaatatggatattaatggccaggatt
tc gaactgatgccgtttggcggcggccgtcgtatttgcccgggcttaaatctgggcatgc agaccattaatatggtgctggccaatctgctgcaggcctttgaatttgttaccattaat aatgaggcggttgatatgaccgaaagtgcaggtctgaccaatctgaaagcaaccccg ctggaaattctgattaccccgcgtctgccgccgaatctgtattaa。
76.供体dna序列如seq id no.2：
77.ccaaaagtgaaatcaccggtaggggccagcggcctgatgcagattatgcctggt acagcgacccatacggtgaagatgttctctattcctggttatagcagccctgggcaat tgctggatccggaaacgaatatcaacattggcaccagttatctgcaatatgtttatcag cagtttggcaataaccgtattttctcctcagcagcttataacgccggaccagggcggg tgcgaacctggcttggcaacagcgccgggcgtatcgacgcagtggcatttgtcgaga gtattccgttctccgagacgcgtggttatgtaaagaacgtgctggcttatgacgctta ctaccgctatttcatgggggataaaccgacgttgatgagcgccacggaatggggacg tcgttactgatccgcccgtttatgatatgctatcgtactctttagcgagtacaaccggg ggaggcattttgcttcccccgctaacaatggcgacatattatggcccaacaataatagt gattaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatc catagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatct ggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatca gcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatcc gcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagtta atagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtt tggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatccccc atgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagt tggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaat agtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgcc acatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaact ctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaac tgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggc aaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactct tcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatat ttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagt gccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaa tcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaaga atagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaa gaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccac tacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaa tcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacg tggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaag tgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctaca gggcgcgtcccattcgccaatccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctca agacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcag ccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatcttaatacagattcggcgg cagacgcggggtaatcagaatttccagcggggttgctttcagattggtcagacctgc actttcggtcatatcaaccgcctcattattaatggtaacaaattcaaaggcctgcagc agattggccagcaccatattaatggtctgcatgcccagatttaagcccgggcaaatac gacggccgccgccaaacggcatcagttcgaaatcctggccattaatatccatattttta tgggtggtcagaaaacgttccggtttaaaatccagcggattatcctgccacacctgc ggatcgcgatgcagtttccaaacattaaccatcagccaggtacctttcggaatatgat aaccggcaatattacaatcttcacgaaactcacgaggaccacccagcggggcggccg gatacagacgcagggtttctttcacaattgcctgcagataaaccagattgcaaatatc gctcttattca
cacctttatgacgacccacatgtttatccagttcttcctgggctttgg tcagcacatgacgattattcagcagcaggctcagggcccaggtcagggtcacggcaa aggtatcggttgcacccagaatcatcagctggcaggtgctcttaatcacggtatcaac atcatgttcatattcaccttcactgccgcgcactgcactcagaatcacatccataaaat cttccactttaccttcaccaccactatattctttgcgacgatgttcttccagccagccg cccataatgccttccagtttctttgcggtttctttcattttcttttcataaccacccaga tccagccagcccagccacggcagtgcatctgccggaacaaacaggcccaccagatg aaagaaatcccaaattgcatcgcgacactggcgcatttcttcggcatcgtcaccgccg ccaccaccacacagacgtttgcccaccacctgacgcagaatggtattcagattcatat ctgccagccaattacgcatatcaaccagcagctggccgctaccatcttttttgccttcc caaactgcatgcagttctttaacactctgtttcacttcttccatacccacgctgctaa acagttctgcacgatgactgctcagcagttcaacggtaaccagtttacgcatgtggc gccaatatgcactatacggagaaaatgcaaacataacaaaatcatagcccagatgctt aatgccacgggttttcggacggctgctaatggccagatcactactggtaaacagttct ttggcaatacggctgctgctcaccagcagaatgcggcgaacacccaggcgcagggta aaaatcgggccatgctgatcactcagggcgcccagaataatatgcggcggttttgcgc tactggttgcaccacctgccatcagatgtaagtggcgtgcacccggggcttccggcg gcagtttatgtttgctgcttttggtcagcagataataataaaacagcagaaacagtgc cactgcgccatagattgcgcttgcataggtggcttccattcctgcagcagatcctgaa acttctttaagttttgcggtgaagtgacgcaatactttcggttcgtacgtaaaggtta atcctttaatattcgccgcgttctctttcacatgtttaaaggcttcaataatgaagtcc atatgtgtttgagtatatgttgcgcgcggaatggttaaacgcagcagttcagccgggc atggcagttgtttaccggttttcggatcgcggcctaacaggaaagagccaatttctac cgcacggataccggcgactttatacagctcgcaggccagcgcctgtgccgggaactg gtctgccgggatatgcggcaacagtttaccggcatcaacgaatgccgcgtgaccgcc cgcctgctggcagacaacgccaatctcttccagaccatcgaccagatactgtacctgc gcgatacgataagccagccagtcgagattcatgccgtcatacagacctaccgccagac gctccatcgcgccgccttccaggccgccatatgtcgggaagccttcctgcaccacgc aaagggttctgcactcggtgtacacatcaaagaagctgtcgtctttcatgcacagca ggccgcccatcggcaccatcgcatctttcttggcggacatcgccagcatatcggcatat ttgtaggtttcgcgggtgatctgctcgatggtccagtctttgtattctgcttcacgctg cttgatgaaataggcgttttcagcaaagcgcgcggagtccattaccaccggaatatcg tatttcttcgcgatgctgtacatcgcttttaagtttgccagtgaaaccggctgaccac ctgcagagttactggtgatggttgcaacgatatacggcacgttattcggaccaacttc ttcaataccgcgttctaatccctcaaggtcaaagttgcctttaaagtcgtaacgcacg cccgtatcgaaggcttctttgatatagacgttacgcacggtacagccgttgatctggct atggccctgcgtggtatcaaagaaatagttagagaacgccaccattttgctgcgatcc aggcctttttcctgctcgcgttttttaatcagtaccggaatatagatttgctctgcgcc acggccctggtgagtcggaatggtgtattgataaccaaagatatttttcactgactcg gctaacgcatagtagctacgactgccgctgtaggcttcgtcgccgcgcatcatcgcag cctgcatgctctgcgtcaccgccccggtgccgctgtcggtcagtaaatcgataaaaac atcttcgctatccagcaggaacgggttcataccggatttaataattgcctcttcacgat aagcgcgagtggtacgttttactggctcaataacacgaatgcggaacggttcaggga gatgtttaaagttttccatgtgatgatgatgatgatgcatatgtatatctccttcttaaa gttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtga gtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggcc ggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatg gggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatgg tggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattcc ttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcagg agtcgcataagggagagcgtcgagatcc
cggacaccatcgaatggcgcaaaaccttt cgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaa ccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttccc gcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcg gcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaa cagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaa attgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcga tggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgc aacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgt ggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacaccc atcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctgg tcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggc gcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgata gcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaat gctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgct gggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggt agtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatc aaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctct cagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaa aaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcatta atgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgatggcagaacag cgtcaccaggagtggttacgttttgtcgacctgcttaagaatgcctaccaaaacgatc tccatttaccgttgttaaacctgatgctgacgccagatgagcgcgaagcgttgggga ctcgcgtgcgtattgtcgaagagctgttgcgcggcgaaatgagccagcgtgagttaa aaaatgaactcggcgcgggcatcgcgacgattacgcgtggatctaacagcctgaaag ccgcgcccgttgagctgcgccagtggctggaagaggtgttgctgaaaagcgattgat tttgtaggcctgataagacgcggcagcgtcgcatcaggcatcgtgcaccgaatgccg gatgcggcgtgaacgccttatccgtcctacaatgcctgatatacggcattgtgaaacg gactcagcgccaggatcaccgcctggtgatagacgctggcgcgagtgagtttcccgg cggtaaacacgccgatcgccccttccttacgaccaatctcatcaata。
78.cyp450基因序列如seq id no.3：
79.atggaagcaacttatgcctcagccatctatggagccgttgccttgtttctcctttt ctactattaccttcttactaaatcttccaaacataaactcccacctgaagcccccgggg cgcgccacctccatctcatggctggtggcgccacctcctctgctaaaccccctcacat catcttaggggccttgtcggaccaacacggacccatcttcaccctccggttgggcgt gcgccgtatcctcttggtgagcagttcgagaatagcaaaggagttgttcacttccag cgatttggccatctcgtcccgcccaaagacgcgaggtatcaaacacctcggctatgac tttgtcatgtttgccttcagtccttacagtgcatactggcgacacatgcggaaactcg tcaccgtggagctcctctcgagccatcgggctgagcttttcagcagtgtgggcatgg aggaagtaaaacagtccgttaaggagctgcacgcagtttgggaggggaagaaggat ggatcggggcagttgttggtggacatgaggaattggttggcagatatgaatttgaata ccatcctcaggcaggttgtggggaagagactttgtggcggcggcggaggagatgat gcggaggagatgcggcagtgccgggatgctatatgggatttcttccacttggtagggc ttttcgtgccggcggatgcacttccatggctggggtggctggacttgggaggatacg agaagaaaatgaaggaaactgccaagaagttggaaggaataatgggagggtggctg gaggagcaccggcgaaaggaatattccggcggggagggaaaagtagaggactttat ggatgtgatattgtcggcggtacgaggttcggaaggggaatacgagcacgatgttgat accgttattaaatctacatgccagctgatgattcttggagccacagacacttttgcag tcacgctaacctgggcactttccctgttgttgaacaaccgacacgtcctaaccaaag cccaagaagaactagacaagcacgttgggagacacaaaggagtgaataaatcggac atttgcaacctagtatatctacaggcca
tagtcaaagagaccttaaggttataccccgc tgctcccttgggtgggccacgtgaattccgtgaagactgcaatatagccgggtacca cattcctaaagggacatggctaatggtgaatgtatggaagctgcacagagatccaca agtgtggcaagacaacccattggatttcaaacccgaaagatttttaaccacacacaa aaatatggatatcaatggtcaagattttgagttgatgccatttggaggtggtcggagg atatgcccggggttgaaccttgggatgcaaaccataaatatggttctggctaacttatt gcaggcttttgagttcgtgacaataaataatgaagcagtggatatgacagagagtgc tggattgacgaatctcaaagccacaccacttgaaattcttattaccccgagactaccc cctaatctttattaa。
80.opt-cyp450基因序列如seq id no.4：
81.atggaagccacctatgcaagcgcaatctatggcgcagtggcactgtttctgctgt tttattattatctgctgaccaaaagcagcaaacataaactgccgccggaagccccggg tgcacgccacttacatctgatggcaggtggtgcaaccagtagcgcaaaaccgccgca tattattctgggcgccctgagtgatcagcatggcccgatttttaccctgcgcctgggtg ttcgccgcattctgctggtgagcagcagccgtattgccaaagaactgtttaccagtag tgatctggccattagcagccgtccgaaaacccgtggcattaagcatctgggctatgat tttgttatgtttgcattttctccgtatagtgcatattggcgccacatgcgtaaactggtt accgttgaactgctgagcagtcatcgtgcagaactgtttagcagcgtgggtatggaa gaagtgaaacagagtgttaaagaactgcatgcagtttgggaaggcaaaaaagatgg tagcggccagctgctggttgatatgcgtaattggctggcagatatgaatctgaatacca ttctgcgtcaggtggtgggcaaacgtctgtgtggtggtggcggcggtgacgatgccg aagaaatgcgccagtgtcgcgatgcaatttgggatttctttcatctggtgggcctgtt tgttccggcagatgcactgccgtggctgggctggctggatctgggtggttatgaaaa gaaaatgaaagaaaccgcaaagaaactggaaggcattatgggcggctggctggaag aacatcgtcgcaaagaatatagtggtggtgaaggtaaagtggaagattttatggatgt gattctgagtgcagtgcgcggcagtgaaggtgaatatgaacatgatgttgataccgtg attaagagcacctgccagctgatgattctgggtgcaaccgatacctttgccgtgaccc tgacctgggccctgagcctgctgctgaataatcgtcatgtgctgaccaaagcccagg aagaactggataaacatgtgggtcgtcataaaggtgtgaataagagcgatatttgcaa tctggtttatctgcaggcaattgtgaaagaaaccctgcgtctgtatccggccgccccg ctgggtggtcctcgtgagtttcgtgaagattgtaatattgccggttatcatattccgaa aggtacctggctgatggttaatgtttggaaactgcatcgcgatccgcaggtgtggca ggataatccgctggattttaaaccggaacgttttctgaccacccataaaaatatggata ttaatggccaggatttcgaactgatgccgtttggcggcggccgtcgtatttgcccggg cttaaatctgggcatgcagaccattaatatggtgctggccaatctgctgcaggccttt gaatttgttaccattaataatgaggcggttgatatgaccgaaagtgcaggtctgacca atctgaaagcaaccccgctggaaattctgattaccccgcgtctgccgccgaatctgta ttaa。
82.实施例3：bl21(de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
)工程菌在生产靛蓝中的应用
83.所述的bl21(de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
)工程菌可应用于生产靛蓝，将平板中挑取bl21(de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
)和对照bl21(de3)工程菌单克隆，于lb培养基中过夜培养活化菌株。
84.具体的，工程菌的培养方法具体如下：
85.1)将蛋白胨6-10g，酵母膏3-5g，氯化钠6-10g；
86.2)加无菌水配制成1000ml培养基(ph值＝7.0)；
87.3)挑取新鲜培养的菌株接种于lb培养基中，置于恒温箱中37℃，150rpm培养24h 进行活化；
88.4)将新鲜活化的种子培养物转接至装有100ml培养基的500ml锥形瓶中，37℃， 150rpm进行培养，待od600值达到0.4～0.6之间，加入iptg(终浓度为0.2mmol/l)，于37℃诱导4h，然后将温度调整为30℃继续诱导到24h；在培养24小时时取培养液 5ml于玻璃试管中，进行拍照(参见图7，其中其中，x为bl21(de3)；y为bl21 (de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
))；
89.5)收集50ml发酵液中的蓝沉淀(含细菌)，无菌水洗涤后超声破碎细胞，加入二甲基亚砜反复萃取靛蓝素，离心收集上清溶液(参见图8，其中，j为bl21(de3)；h 为bl21(de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
))；可见bl21 (de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
)的靛蓝素产量较高；进一步的，本发明所提供的工程菌可直接应用于工业生产天然的靛蓝素。
90.6)采用高效液相谱仪检测靛蓝，检测条件为：c18谱柱，二极管阵列检测器，流动相v(甲醇)∶v(超纯水)＝9∶1，柱温30℃，流速0.2ml/min，检测波长610nm；质谱结果(参见图9和图10，其中263.17为靛蓝的质子峰)；
91.7)发酵24h后检测菌株中靛蓝素的产量。
92.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种生产靛蓝素的工程菌，其特征在于，所述工程菌为bl21(de3/trpr-/tnaa-opt-cyp450+/amp
+
)，获得该工程菌的具体过程为：选择大肠杆菌bl21(de3)；使用crispr/cas9技术，利用grna靶向trpr基因，将trpr基因序列剪断；利用λred同源重组酶将供体dna通过同源重组方法插入trpr基因中，得到该工程菌；所述供体dna包括trpr上游同源臂、启动子、tnaa-opt-cyp450融合基因、amp抗性基因、终止子以及trpr下游同源臂；所述tnaa-opt-cyp450融合基因序列如seq id no.1所示；所述供体dna序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述供体dna的制备过程具体如下：将tnaa-opt-cyp450融合基因克隆构建至原核表达载体pet-22b中，获得重组表达质粒pet-22b-tnaa-opt-cyp450；分别设计引物，以pet-22b-tnaa-opt-cyp450为模板，供体引物f2/r2进行pcr获取启动子、终止子、tnaa-opt-cyp450融合基因和amp抗性基因；以大肠杆菌基因组为模板，供体引物f1/r1和供体引物f3/r3进行pcr获取trpr上游同源臂、trpr下游同源臂；再通过pcr获得供体dna。3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述tnaa-opt-cyp450融合基因包括tnaa基因与opt-cyp450基因，所述tnaa基因的genbank id为nc_000913.3；所述opt-cyp450基因为基于genbank id为mg857655.1的马蓝细胞素cyp450 mrna序列的核酸和氨基酸序列信息经过分析编码并根据大肠杆菌的密码子偏好优化后所得，所述opt-cyp450基因序列如seq id no.4所示。4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述opt-cyp450基因序列经过大肠杆菌的密码子偏好优化的参数具体包括：1)所述opt-cyp450序列的密码子适应指数cai优化前为0.67，优化后为0.97；2)所述opt-cyp450序列中的碱基gc含量优化前以及优化后均为0.5；3)所述opt-cyp450序列优化前含有ncoi、xhoi、saci和ecor i限制性内切酶识别位点，优化后不含ncoi、xhoi、saci和ecor i限制性内切酶识别位点；所述isdna序列的回避序列优化后移除了2个aataaa碱基序列和1个attaaa碱基序列；4)删除所述opt-cyp450的重复序列；优化前重复序列的最大正向和最大反向长度均为12bp，优化后最大反向长度为14bp。5.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌应用于工业生产天然的靛蓝素。

技术总结

本发明提供了一种生产靛蓝素的工程菌，具有利用培养基中的营养成分高效生产靛蓝素的功能。该工程菌基于大肠杆菌氨酸合成途径及添加氨酸到靛蓝素形成的关键酶基因，应用基因编辑和分子克隆技术对合成途径进行分子遗传改造，整合改造后的DNA为一条从培养基营养成分形成靛蓝素的便捷通路。改造后获得的工程菌可直接应用于靛蓝素生物合成，为后续工业化生产靛蓝素奠定基础。后续工业化生产靛蓝素奠定基础。后续工业化生产靛蓝素奠定基础。