陈姑，姜竹茂，位正鹏，等. 低温等离子体处理加速罗非鱼肌原纤维蛋白的氧化及结构改变[J]. 食品工业科技，2023，44（4）：88−95.doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022050196 CHEN Gu, JIANG Zhumao, WEI Zhengpeng, et al. Cold Plasma Treatment Accelerated the Oxidation and Structural Changes of Myofibrillar in Tilapia[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(4): 88−95. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022050196
· 研究与探讨 ·
低温等离子体处理加速罗非鱼肌原纤维蛋白
的氧化及结构改变
陈 姑1，姜竹茂2，位正鹏3，王佳媚1, *
，刘宸成1，桑晓涵1，蔡志成1，刘雅夫1，王金梅3，杨 青3
（1.海南大学食品科学与工程学院，海南海口 570228；
2.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005；
竹炭颗粒3.泰祥集团-荣成泰祥食品股份有限公司，农业部冷冻调理海洋食品加工重点实验室，
山东荣成 264300）
摘 要：以新鲜罗非鱼为研究对象，采用不同时间（0、1、2、3、4、5 min ）和电压（40、50、60、70、80 kV)进行处理，分析处理后鱼肉的羰基含量、巯基含量、疏水性、Zeta 电位、SDS-PAGE 凝胶电泳、紫外光谱、荧光光谱和拉曼光谱，探究低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白氧化及结构的影响。结果表明：随着低温等离子体处理时间延长及电压升高，鱼肉中羰基含量和疏水性逐渐增加，总巯基和活性巯基含量减少；当处理时间延长至5 min 时，总巯基和活性巯基分别减少至66.91 和52.76 μmol/g ；处理电压升高至80 kV 时，羰基含量从1.23 nmol/mg 上升至2.16 nmol/mg ；处理低温等离子体处理使肌原纤维蛋白Zeta 电位绝对值降低；SDS-PAGE 表明，低温等离子体处理使肌原纤维蛋白的肌球蛋白重链条带加重；随着低温等离子体处理时间的延长及电压的升高，紫外吸收光谱蓝移并且吸收强度增强，荧光吸收强度减弱；鱼肉经高电压、长时间等离子体处理后，α-螺旋增加，β-转角和β-折叠减少，无规卷曲无明显变化。综上，低温等离子体处理能够加速肌原纤维蛋白氧化，导致蛋白质的二级结构和构象发生改变。
关键词：低温等离子体，肌原纤维蛋白，罗非鱼，蛋白氧化
本文网刊:
中图分类号：TS254.1 文献标识码：A 文章编号：1002−0306（2023）04−0088−08DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2022050196
Cold Plasma Treatment Accelerated the Oxidation and Structural
Changes of Myofibrillar in Tilapia
CHEN Gu 1，JIANG Zhumao 2，WEI Zhengpeng 3，WANG Jiamei 1, *，LIU Chencheng 1，SANG Xiaohan 1，
CAI Zhicheng 1，LIU Yafu 1，WANG Jinmei 3，YANG Qing 3
（1.School of Food Science and Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China ；
2.College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China ；
3.Taixiang Group, Rongcheng Taixiang Food Products Co., Ltd., Ministry of Agriculture Key Laboratory of Frozen
Prepared Marine Foods Processing, Rongcheng 264300, China ）
Abstract ：To investigate the effects of cold plasma treatment on the oxidation and structure changes of myofibrillar proteins tilapia, the fish was treated by cold plasma with different time (0, 1, 2, 3, 4, 5 min) and different voltage (40, 50, 60, 70,80 kV), respectively, the carbonyl content, sulfhydryl content, hydrophobicity, Zeta potential, SDS-PAGE, UV spectra,fluorescence spectra and Raman spectrometer of myofibrillar protein were measured after treatment. The results showed that the carbonyl content and surface hydrophobicity of myofibrillar protein were increased gradually, as the treatment time
收稿日期：2022−05−17
基金项目：国家自然科学基金（32060568）；山东省自然基金（ZR2020KC013）。
作者简介：陈姑（1999−），女，硕士研究生，研究方向：食品加工与安全，E-mail ：****************。* 通信作者：王佳媚（1984−），女，博士，副教授，研究方向：食品加工与安全，E-mail ：******************。
第 44 卷 第 4 期食品工业科技
Vol. 44 No. 42023 年 2 月
Science and Technology of Food Industry
Feb. 2023
extending or voltage increased, while the total sulfhydryl and the active sulfhydryl content were decreased. When the treatment time was extending to 5 min, the total sulfhydryl and the active sulfhydryl content were decreased to 66.91 and 52.76 μmol/g, respectively. The carbonyl content increased from 1.23 to 2.16 nmol/mg, if the treatment voltage was increased to 80 kV. Cold plasma treatment decreased the absolute value of Zeta potential of myofibrillar protein. The myosin heavy chain band of myofibrillar protein was increased based on SDS-PAGE results. As treatment time extending and voltage increasing, the UV spectrum of myofibrillar protein was blue-shifted with an increased UV absorption intensity, and the fluorescence absorption intensity of protein was weakened. Based on the Raman spectrometer determination, the content of α-helix was increased, the contents of β-sheet and β-turn were reduced, and the random coils had no obvious changes in myofibrillar protein of tilapia after cold plasma treatment. In conclusion, extending the treatment time or increasing treatment voltage of cold plasma can accelerate the oxidation of myofibrillar protein to result in the changes of their second-order structure and conformation.
Key words：cold plasma；myofibrillar protein；tilapia；protein oxidation
罗非鱼繁殖快，抗病性强，营养价值高，是日常生活中优质价廉的蛋白质来源，深受消费者喜爱，罗非鱼养殖业发展迅速，占据国内渔业养殖产业的主体[1]。罗非鱼自身水分含量高，营养丰富，易受微生物污染导致腐败，目前罗非鱼保鲜技术有低温保鲜、气调保鲜、低温等离子体保鲜、辐照保鲜、化学保鲜等[2]。
低温等离子体是新兴的非热食品加工技术，对食品微生物具有显著的杀菌保鲜效果，能有效提高食品的安全性，延长保质期[3]。目前低温等离子体保鲜技术已广泛应用于水产品中，Albertos等[4]研究表明，低温等离子体处理能显著减少鲭鱼片中好氧嗜冷菌、假单胞菌和乳酸菌总数，延长其货架期。低温等离子体能有效灭活食品微生物，是由于在低温等离子体处理过程中产生的活性氧、活性氮、过氧化氢等活性物质遏制了微生物的生长繁殖[5]，但这些活性物质会与鱼肉中的脂质、蛋白质相互作用，发生氧化反应，导致蛋白质等营养成分结构发生变化[6]。Huang 等[7]研究表明，低温等离子体处理鲑鱼鱼糜后，微生物显著减少的同时伴随着脂质的氧化，硫代酸（thiobarbituric acid reactive substances, TBARS）值略微升高。姜竹茂等[8]研究表明，低温等离子体处理鲅鱼鱼肉，加速蛋白质氧化，羰基含量、疏水性增加，巯基含量减少。杜曼婷等[9]研究表明随着低温等离子体处理时间的延长，羊肉肌原纤维蛋白羰基含量显著增加，低温等离子体加速了蛋白质氧化。
Wang等[10]对罗非鱼、金鲳鱼和鲣鱼肌原纤维蛋白表征的比较研究表明，罗非鱼肌原纤维蛋白溶解度最高，蛋白结构更稳定，其具有稳定乳化剂的潜力。虽然已有很多研究表明，低温等离子体处理会加
速水产品蛋白质氧化，但不同来源的肌原纤维蛋白结构特性存在差异。关于低温等离子体处理条件对罗非鱼的肌原纤维蛋白特性变化以及乳化性质的影响研究相对较少。罗非鱼作为我国主要经济鱼类之一，研究低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白氧化及结构的影响尤为重要，也为低温等离子体应用于不同鱼类及水产品保鲜提供必要信息。
本研究以罗非鱼为研究对象，采用不同低温等离子体处理时间及电压处理鱼肉，分析其对罗非鱼蛋白氧化的影响，并进一步测定Zeta电位、紫外光谱、荧光光谱、拉曼光谱分析处理对蛋白质结构变化影响，为低温等离子体保鲜技术应用于罗非鱼保鲜提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜罗非鱼（Oreochromis mossambicus） 每条重（750±200）g，购自海口市沿江三农贸市场；尿素 西陇科学股份有限公司；氯化钠、SDS、溴酚蓝 广东广试试剂科技有限公司；DNPH、DTNB 国药集团化学试剂有限公司；总蛋白定量测试盒 南京建成生物工程研究所。
MAP-H360型复合气调包装机 苏州森瑞保鲜设备有限公司；BK130/36高压电转换器 美国Phoenix 公司；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析仪 英国Malvern Instrument公司；UV-1800紫外可见分光
光度计 日本岛津有限公司；F-7000荧光分光光度计 日本日立公司；Reflex in Via拉曼光谱仪 英国Renishaw plc公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品处理 将新鲜罗非鱼宰杀，除去头、尾、表皮及内脏，称取鱼肉块（50±2 g）放入塑料包装盒中，用包装机进行空气密封包装后，将包装盒放置于低温等离子体装置两电极之间，低温等离子体进行如下处理：A处理时间：在70 kV电压条件下分别处理0、1、2、3、4、5 min；B 处理电压：在40、50、60、70、80 kV电压条件下处理3 min；未经低温等离子体处理的样品作为对照组，对照组包装后在4 ℃条件下放置相同时间取样。
1.2.2 肌原纤维蛋白提取 参考Han等[11]的方法略作修改。称取5 g鱼肉糜于25 mL PBS缓冲液中，在冰浴条件下均质1 min（10000 r/min），均质后离心（10000 r/min，4 ℃，10 min），弃上清液，沉淀用PBS 缓冲液洗3次后加入20 mL PBS（0.6 mol/L NaCl）缓冲液，冰浴下均质15 s（10000 r/min），4 ℃下提取2 h后4层纱布过滤，所得滤液为罗非鱼肌原纤维蛋
第 44 卷第 4 期陈 姑，等：低温等离子体处理加速罗非鱼肌原纤维蛋白的氧化及结构改变· 89 ·
白，蛋白浓度用试剂盒进行测定。1.2.3 羰基含量的测定 参考Mesquita 等[12]的方
法略作修改。用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液将蛋白浓度调整为2 mg/mL ，将0.4 mL 稀释后的蛋白溶液与0.4 mL 10 mmol/L DNPH 溶液（含0.5 mol/L H 3PO 4）混合，与等量0.5 mol/L H 3PO 4溶液混合作为对照组，将混合溶液于25 ℃下暗处反应10 min ，反应完成后，向混合溶液中加入0.2 mL 6 mol/L NaOH 溶液，并在25 ℃继续反应10 min ，在450 nm 波长处测定混合溶液吸光度。计算公式如下：
式中：A 为450 nm 波长处的吸光值；n 为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数22000（L/（mol·cm ））；ρ为蛋白质量浓度（mg/mL ）。
1.2.4 巯基含量的测定 参考徐红艳等[13]的方法略
作修改。总巯基测定：用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液将蛋白浓度调整为2 mg/mL ，取0.5 mL 稀释后的蛋白溶液依次加入2 mL 尿素-十二烷基硫酸钠溶液（含8.0 mol/L 尿素，30 g/L SDS ，0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液，pH7.4）和0.5 mL 10 mmol/L DTNB 试剂（溶解在0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液中，pH7.4），在室温下反应15 min ，取上清液在412 nm 下测定吸光值，用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液代替蛋白液用于空白对照。
活性巯基测定：用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液将蛋白浓度调整为2 mg/mL ，取0.5 mL 稀释后的蛋白溶液依次加入2 mL 十二烷基硫酸钠溶液（含30 g/L SDS ，0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液，pH7.4）和0.5 mL 10 mmol/L DTNB 试剂（溶解在0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液中，pH7.4），在室温下反应15 min ，取上清液在412 nm 下测定吸光值，用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液代替蛋白液用于空白对照。计算公式如下：
式中：A 为412 nm 波长处的吸光值；n 为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数13600（L/（mol·cm ））；ρ为蛋白质质量浓度（mg/mL ）。
1.2.5 表面疏水性的测定 参考黄倩等[14]
的方法略
作修改。用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液将蛋白浓度调整为2 mg/mL ，取1 mL 稀释后的蛋白溶液，加入200 μL 1 mg/mL 溴酚蓝溶液后离心（6000 r/min ，15 min ），并对上清液进行10倍稀释，以PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液为空白对照，在595 nm 下测定吸光度值，以溴酚蓝结合量来表示表面疏水性。计算公式
如下：
式中：A 1为空白对照组溴酚蓝吸光值；A 2为样品吸光值。
1.2.6 Zeta 电位测定 参考李子晗等[15]的方法略作
修改。采用粒度仪进行测定，用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液将蛋白浓度调整为1 mg/mL ，在25 ℃下测定，蒸馏水作为溶剂。
1.2.7 SDS-PAGE 凝胶电泳 参考石钢鹏等[16]的方
法略作修改。用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液将蛋白浓度调整为1 mg/mL ，取10 μL SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5×）与40 μL 样品混匀后沸水浴加热5 min ，为电泳样品，上样量为15 μL 。采用质量分数为10%的分离胶，质量分数为4%的浓缩胶，样品在浓缩胶时电压为80 V ，进入分离胶时电压改为120 V 。电泳结束后，使用染液染20 min 后脱至条带清晰。
1.2.8 紫外吸收光谱测定 参考张海璐等[17]的方法
略作修改。用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液将蛋白浓度调整为1 mg/mL ，置于紫外分光光度计中测定紫外吸收光谱，扫描波长范围为240~340 nm ，扫描速率为2 nm/min 。
1.2.9 内源荧光光谱测定 参考张海璐等[17]的方法
略作修改。用PBS （0.6 mol/L NaCl ）缓冲液将蛋白浓度调整为2 mg/mL ，置于荧光分光光度计中测定内源荧光光谱，设置激发波长280 nm ，发射波长290~500 nm ，电压700 V ，狭缝宽度2.5 nm ，扫描速度2400 nm/min 。
1.2.10 拉曼光谱测定 参考Zou 等[18]的方法略作
修改。将提取的蛋白溶液进行冷冻干燥，取冻干后的粉末置于载玻片上，使用50倍长焦镜头进行聚焦，514 nm 氩离子激光器，扫描范围为400~2100 cm −1，扫描时间为60 s 。
1.3 数据处理
每组实验重复3次，采用Excel 2016进行处理，
结果用平均值±标准差表示。采用Origin 2019软件
作图，通过SPSS 17.0进行显著性分析，以P <0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白羰基含
量的影响
通过自由基直接修饰氨基酸侧链、肽键断裂或
非蛋白羰基单元内收形成羰基，蛋白质氧化往往伴随着羰基的生成[19]。如图1a 所示，相比未处理，处理时间对羰基含量有显著影响（P <0.05），随着处理时间的延长，羰基含量逐渐增加，在处理5 min 后羰基含量增加至1.95 nmol/mg 。随着低温等离子体处理时间的延长，产生的活性氧等活性物质增加，活性自由基攻击氨基酸侧链，使得氨基酸残基、肽链发生改变，形成更多的羰基及羰基衍生物，肌原纤维蛋白的氧化程度也随之增加。Panpipat 等[20]的研究中发
· 90 ·食品工业科技2023年 2 月
现，随着低温等离子体处理时间的延长，金线鱼肌球蛋白羰基含量显著增加，这与本研究结论一致。如图1b 所示羰基含量随着处理电压的升高呈上升趋势（P <0.05），在电压达到80 kV 时羰基含量显著增加至2.16 nmol/mg （P <0.05），低温等离子体处理电压升高，产生的活性物质增加，加速蛋白质氧化。
1
23
4
5
0.0
0.51.01.52.02.5a
b
b
c
c d
a 0
40
506070
80
0.0
0.51.01.52.02.5a
b
b
c
c
c
b 羰基含量 (n m o l /m g )
羰基含量 (n m o l /m g )
时间 (min)
电压 (kV )
图 1 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白
羰基含量的影响
Fig.1 Effect of cold plasma treatment on the carbonyl content
of myofibrillar proteins from tilapia
注：图中小写字母不同，表示数值有显著差异（P <0.05），图3~图4同。
2.2 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白巯基含
量的影响
蛋白质氧化会引起巯基含量减少。由图2a 可
以看出，随着处理时间的延长，总巯基以及活性巯基含量均显著下降（P <0.05），在处理5 min 时分别下降至66.91和52.76 μmol/g ，说明罗非鱼肌原纤维蛋白的氧化程度随着处理时间的延长而增加。如图2b 所示，总巯基和活性巯基含量随着处理电压的升高而减少（P <0.05），在80 kV 时分别减少至61.15和56.86 μmol/g 。随着等离子体处理电压的升高，产生的过氧化氢、活性氧、活性氮等或活性物质也随之增加，巯基被过氧化氢等自由基氧化为二硫键或生成磺酸衍生物，所以含量减少[21]。唐玲玲等[22]研究表明，随着低温等离子体处理时间延长和电压升高，南美白对虾肌原纤维蛋白总巯基含量显著下降。
2.3 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白疏水性
的影响
蛋白质表面疏水性与蛋白质的折叠、交联、聚合
有关，是评估蛋白质变性的重要指标之一[23]。由
图3a 可知，与对照组相比，经低温等离子体70 kV 处理1 min 后，溴酚蓝结合量显著增加了13.07 μg （P <0.05），并且随着处理时间的延长，溴酚蓝结合量逐渐增加。如图3b 所示，与对照组相比，经低温等离子体处理40 kV 处理3 min 后，溴酚蓝结合量显著增加了14.66 μg （P <0.05），溴酚蓝结合
量随着处理电压的升高而增加。Miao 等[24]研究表明，低温等离子体处理阿拉斯加狭鳕肌原纤维蛋白，随着处理电压从10 kV 升高至60 kV ，疏水性显著增加。在低温等离子体处理下，ROS 、过氧化氢等自由基攻击疏水性氨基酸，蛋白质分子伸展，疏水基团逐渐暴露，使得肌原纤维蛋白疏水性增加[25]。
2.4 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白Zeta
电位的变化
Zeta 电位表明分散体中相邻带电粒子之间的静
电相互作用程度，电位绝对值越高，说明蛋白质溶液体系越稳定，电位绝对值越低，蛋白质颗粒凝结聚集程度越高[26]。等离子体处理时间对罗非鱼肌原纤维蛋白Zeta 电位的影响如图4a 所示随着时间延长，肌原纤维蛋白的Zeta 电位绝对值显著降低，从对照组的10.4降低至6.29（P <0.05）。如图4b 可知随着处理电压升高，肌原纤维蛋白的电位绝对值显著减少，在80 kV 时减少至5.57（P <0.05）。Du 等[27]研究表明反复冻融处理加速镜鲤肌原纤维蛋白氧化，Zeta 电位绝对值从26.87减少至16.50，蛋白质分子之间
01
234
5
50
55606570758085总巯基活性巯基
a b
c
d
e压花模具
f
A
B
C
yig滤波器
D
E F a 040
506070
80
50
55606570758085总巯基活性巯基
a b
c d
e f A
B
C
D
E
F b 巯基含量 (μm o l /g )
巯基含量 (μm o l /g )
时间 (min)
电压 (kV)
智能筷子
图 2 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白
巯基含量的影响Fig.2 Effect of cold plasma treatment on the sulfhydryl content
of myofibrillar proteins from tilapia 注：图中小写字母不同表示总巯基数值有显著差异（P <0.05）；大写字母不同表示活性巯基数值有显著差异（P <0.05）。
第 44 卷 第 4 期陈 姑 ，等： 低温等离子体处理加速罗非鱼肌原纤维蛋白的氧化及结构改变
· 91 ·
的排斥减弱，蛋白质之间的聚集增加。等离子体处理产生的自由基促进蛋白质氧化，改变了蛋白表面电荷，破坏了蛋白质之间的氢键、疏水相互作用，使得蛋白质分子发生聚集，Zeta 电位绝对值减少[28]。
2.5 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白SDS-PAGE 的影响
肌球蛋白重链（MHC ）和肌动蛋白是肌原纤维蛋
白的主要成分，蛋白质氧化涉及蛋白质中共价键链接的变化，导致条带出现模糊、弱化，出现新的低分子量条带[29]。由图5a 所示，随着处理时间延长，肌球蛋白重链条带颜加重。随着低温等离子体处理时
间延长，蛋白质分子发生聚集，使得肌球蛋白重链条带加深，但长时间处理会促进大分子蛋白降解为小分子蛋白，肌球蛋白重链条带减弱。如图5b 所示，随
着处理电压升高，肌球蛋白重链出现扩展现象，肌球蛋白重链条带加深，肌动蛋白条带加深。随着处理时间的延长和电压的增加，自由基使得蛋白质结构发生改变，蛋白质分子交联聚集，导致肌原纤维蛋白出现聚集体，条带发生变化[30]。
a kDa Marker 012345
肌球蛋白重链
肌动蛋白
原肌球蛋白
250 130 100 70 55
35
25
b Marker 04050607080
肌球蛋白重链
肌动蛋白
原肌球蛋白
250
130 100 70 55
35 25
图 5 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白凝胶电泳的
影响
Fig.5 Effect of cold plasma treatment on the SDS-PAGE
profiles of myofibrillar proteins from tilapia
注：a 为在70 kV 电压条件下分别处理0、1、2、3、4、5 min 电泳图；b 为在40、50、60、70、80 kV 电压条件下处理3 min 电泳图。
2.6 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白紫外光
烤花炉
谱的影响
蛋白质中的芳香氨基酸在紫外光下有较强的吸
收区域，紫外光谱能反映蛋白质构象变化[31]。由图6可知，经不同时间、不同电压等离子体处理后的肌原纤维蛋白的紫外吸收光谱相似，均在280 nm 波长左右出现峰的拐点，说明等离子体处理后的氧化不会改变肌原纤维蛋白整体图谱趋势，但随着处理时间的延
1
2345
25
30354045505560
a
a
b
c
d
e
a 0
40
506070
80
25
30354045505560a
b
c
c
d
e
b 溴酚蓝结合量 (μg )
溴酚蓝结合量 (μg )
时间 (min)
电压 (kV)
图 3 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维
蛋白疏水性的影响Fig.3 Effect of cold plasma treatment on hydrophobicity of
myofibrillar proteins from tilapia
1
2
3
4
5
−12−10−8−6−4−20a
a
b
bc
c d
a
4050
60
70
80
−12
−10−8−6−4−20a
b
c
d
e f
b
Z e t a 电位 (m V )
Z e t a 电位 (m V )
时间 (min)电压 (kV)图 4 低温等离子体处理对罗非鱼肌原纤维蛋白
Zeta 电位的影响Fig.4 Effect of cold plasma treatment on the Zeta potential of
myofibrillar proteins from tilapia
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食品工业科技
强制系统2023年 2 月
