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影像处理CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究 许艳;陈海丽;刘晓茜;熊延青;席秀红;宰淑蓓;蔡金凤;卢水华;朱召芹
【摘 要】氨分解制氢
微型音箱目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值.方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体.优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6).制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体.结果 重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致.融合蛋白在E.coli BL21 (DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40％.利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95％以上.Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应.CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500.检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT＞ ELISA(rCFP10-ESAT6)＞ELISA (kit).结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值. 【期刊名称】《中国人兽共患病学报》
【年(卷),期】2015(031)004
【总页数】5页(P315-319)
【关键词】结核分枝杆菌;CFP10-ESAT6;酶联免疫吸附试验(ELISA)
【作 者】许艳;陈海丽;刘晓茜;熊延青;席秀红;宰淑蓓;蔡金凤;卢水华;朱召芹
【作者单位】上海市公共卫生临床中心,上海201508;上海市公共卫生临床中心,上海201508;上海市公共卫生临床中心,上海201508;上海市公共卫生临床中心,上海201508;上海市公共卫生临床中心,上海201508;上海市公共卫生临床中心,上海201508;上海市公共卫生临床中心,上海201508;上海市公共卫生临床中心,上海201508;上海市公共卫生临床中心,上海201508
【正文语种】中 文
【中图分类】R378.91
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的一种慢性传染病，是危害人类健康的重要传染病之一。控制结核病的流行与蔓延的关键在于到简便、快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法[1-3]。虽然细菌学检查仍是结核病诊断的金标准，但由于涂片阳性率较低，培养又需时太久，所以发展免疫学诊断对结核病的诊断具有重要参考价值[3，8]。
目前临床上使用ELISA诊断方法的特异性较差，主要原因是现行的ELISA方法无法区分致病性结核杆菌感染和BCG接种者[4-5]。卡介苗及其它非致病性分枝杆菌中不存在RD1区，因此RD1区基因所编码的蛋白在结核分枝杆菌疫苗研制开发和检验诊断方面都受到了广泛的关注。CFP10和ESAT6的编码基因均位于RD1区，是重要的T细胞抗原，具有良好的免疫原性，能诱导机体产生特异性免疫应答，且具有强烈的免疫原性，成为研究结核病诊断与预防的热点[6，9-10]。因此可将CFP10和ESAT6作为诊断结核杆菌感染的特异性试剂[7，11]。
由于单一蛋白在诊断上灵敏度较差，因此我们通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白CFP10-ESAT6，建立检测人血清中抗结核杆菌抗体的间接ELISA方法，并探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分支杆菌免疫诊断中的应用价值。
1.1 材料
1.1.1 毒株、质粒与菌株 结核分支杆菌H37Rv、大肠工程菌TOP10、BL21(DE3)由本实验室是保存，pET28a(+)表达质粒购自Novagen(USA)。贺育民
1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶Nde I、BamH I、Sac I和Hind Ⅲ、PCR相关试剂及DNA marker购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司；DNA回收试剂盒购自Qiagen公司；IPTG购自捷瑞生物公司；抗His-tag单克隆抗体及蛋白质纯化试剂盒购自Novagen公司；除盐柱购自Millipore公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠二抗购自Sigma公司；羊抗人二抗购自Proteintech group公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。
1.1.3 结核免疫诊断试剂 奥普结核分枝杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒购自上海奥普生物技术有限公司，操作按诊断试剂说明书进行。
1.1.4 实验动物 雌性新西兰大白兔1只，质量3 kg左右,来自上海市公共卫生临床中心动物中心。
1.1.5 血清 血清取至上海市公共卫生临床中心住院患者，TB并排除HIV感染病人血清170例。
查阅病例病史，入选TB病例均符合中华人民共和国卫生部颁布的《中华人民共和国传染病防治法》所规定结核病病例诊断标准，主要为痰涂片结果、痰培养结果、影像学结果、入院诊断、初步诊断及出院诊断等相关病史，并参照前期ELISPOT检测结果进行分组[14]。在研究的170位病例中，明确诊断阳性：即痰涂片或痰培养阳性55人，痰涂片或痰培养均阴性，但胸x线片有特征病灶的有53人，故传染性诊断明确的有108人；痰涂片和痰培养阴性，但具备菌阴性诊断标准1～6中3项或7～8条中任何1项的有22人；排除结核病的有40人。同时，选取妇产科排除TB病例60例作为对照组。
1.2 方法
1.2.1 扩增目的基因 实验用到的引物见表1。引物由上海生工生物工程公司合成，扩增条件为：94℃ 预变性5 min， 94 ℃,30 s；55 ℃,30 s；72 ℃, 45 s，共30个循环。
1.2.2 重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6的构建 用Qiagen PCR产物纯化试剂盒纯化CFP10和ESAT6表达片段PCR产物，分别连入pMD18-T 载体，将连接产物转化TOP10感受态细胞，提取质粒、酶切和测序鉴定。用Nde I和HamH I双酶切pET28a(+)和pMD18-T-CFP10重组质粒，连接后转化TOP10感受态细胞，提取质粒、酶切和测序鉴定。SacI和HindⅢ双
酶切pMD18-T-ESAT6和pET28a-CFP10，回收ESAT6片断与线性化的载体pET28a-CFP10,连接后转化TOP10感受态细胞，提取质粒后进行酶切鉴定。
1.2.3 重组融合蛋白诱导表达和鉴定 将鉴定正确的重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6转入大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆接种于5 mL含卡那霉素的LB中37 ℃振荡培养至OD600=0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导4 h后离心收集菌体。洗涤后重悬菌体沉淀，用超声破碎细菌，离心后分别取少量上清与沉淀SDS-PAGE检测。并用Western-Blotting的方法进行蛋白鉴定。
1.2.4 重组蛋白纯化和多抗制备 用Novagen 的试剂盒纯化蛋白，纯化方法及过程见操作手册，并经除盐柱除盐。以Novagen蛋白纯化试剂盒中的Binding Buffer做对照，用nanodrop1000仪器测定纯化蛋白浓度，然后用Binding Buffer稀释成使用浓度为1mg/mL。将不完全弗氏佐剂和融合蛋白CFP10-ESAT6(1 mg/mL)各0.5 mL混合,分别于第0周、2周、4周、6周采用背部皮下多点注射的免疫方式，6周后从耳静脉采血，间接ELISA测效价为1∶16 000时心脏采血，分离血清备用。
1.2.5 间接ELISA检测方法检测 以不同浓度的重组蛋白CFP10-ESAT6作为包被抗原，并且
用免疫家兔获得的抗CFP10-ESAT6的多克隆抗体血清作为阳性血清，正常人血清作为阴性血清，倍比稀释后进行方阵滴定。寻最佳的抗原包被浓度、患者血清的最佳稀释、最佳封闭条件，根据结果确定ELISA最佳反应条件。倍比稀释重组蛋白CFP10-ESAT6加入ELISA检测板中，每孔100 μL，37 ℃包被2 h；弃去孔内的液体，用1×PBST洗涤液洗涤5次，每次5次；每孔加200 μL含5%脱脂乳的PBS，37 ℃封闭2 h；拍干，每孔加入倍比稀释100 μL患者血清，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入HRP标记的羊抗人第二抗体(1∶2 500稀释)，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入新鲜配制的底物液，每孔加100 μL，避光反应15 min，加入2 mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫检测仪上读取OD490值。
1.2.6 统计分析 对比融合蛋白ELISA试剂盒检测的灵敏度和特异度，且应用Stata7.0统计软件，分别采用配对卡方检验和普通卡方检验对各组检出阳性率进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 目的基因扩增和诱导表达鉴定 CFP10与ESAT6扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期一致，见图1。融合蛋白经IPTG诱导后的菌体进行12% SDS-PAGE鉴定，结果显示，在相对分子质量24 kD处可见一明显蛋白表达条带(图2)。用抗His抗体Western blot检测目的蛋白，无非特异性条带出现(图2)。
2.2 融合蛋白纯化 将诱导后的表达菌，集菌后冰上超声裂解，将全菌、超声后的菌液上清、超声后的菌体沉淀进行SDS-PAGE检测。目的蛋白存在于上清中，说明重组蛋白CFP10-ESAT6为可溶性表达。将超声后的裂菌上清用试剂盒按照试剂盒说明书经Ni2+亲和层析对蛋白进行纯化，并收集过程中的缓冲液，分别SDS-PAGE，确定纯化效率(图4)。
2.3 融合蛋白纯化后除盐浓缩 用Millpore的除盐柱除盐后作12%SDS-PAGE可见纯度较高的蛋白条带。
2.4 间接ELISA检测方法的应用 选取170例确诊结核患者和60份健康患者的血清[15]，利用棋盘法，将不同稀释度蛋白浓度包被后(包被液为5%脱脂乳)，加入不同稀释度确诊患者和健康血清，根据检测ELSIA孔结果的读取值比较，确定融合蛋白CFP10-ESAT6的最佳包被浓度为0.002 μg/mL，患者血清的最佳稀释度为1∶500稀释。有线电视分支分配器
2.5 CFP10-ESAT6融合蛋白ELISA检测方法比较
2.5.1 总体阳性率比较 在130位病例中，用CFP10-ESAT6融合蛋白ELISA检测方法检测，阳性87例，阴性27例，无法判断16例；用商品化的胶体金试剂盒检测，阳性79例，阴性51
例，其阳性检出率分别为66.92%和55.39%。而ELISPOT检测阳性109例，阴性17例，无法判断4例，总体阳性检出率为83.84%(见表2)。
