有机冲施肥265
细胞h分子免疫学杂志（Chin ■!o n M dlm m unoipcgl ,37(3) .论著•文章编号：1007-8738(2021 )03"0265>06应用高效电融合技术制备小鼠抗人v a s o r in(V A S N)单克隆抗体 尹茉莉、聂元旺、刘浩、张爽2，刘磊\李秀春3，王会岩
r吉林医药学院吉林省抗体工程科技协同创新中心，吉林吉林市132013; 2吉林市园林管理中心，吉林吉林市132013; 3吉林 铁道职业技术学院组织人事部教师发展科，吉林吉林市132013)
[摘要]目的通过电融合法制备肝癌候选标志物人vasorin (V A S N)蛋白单克隆抗体并进行鉴定。方法以人带组氨酸标签 的V A S N重组蛋白（V A S N-H i s)免疫小鼠后进行细胞电融合，间接E L I S A筛选能够结合天然V A S N的阳性克隆。通过E L I S A检测抗体的效价及亲和力、Western blot法检测抗体能否识别H e PG2细胞中V A S N蛋白。结果在脾细胞与SP2川细胞的比例为 2:1，交变电场场强50 V 2 M H z 20 s，直流脉冲强度500 V 0.5 s时，融合率达0.31°/。。获得2株小鼠抗人V A S N单克隆抗体 (4阳和889)，抗体最高效价为丨:256 000，亲和力最高可达到4.9<；丨0617111()丨；2株抗体均可识别1^{^2细胞的¥431\蛋白。结论运用细胞电融合法成功制备2株小鼠抗人V A S N的单克隆抗体。
[关键词]肝细胞癌；Vas〇r i n(V A S N)；电融合；单克隆抗体stc2052
[中图分类号]R735.7, R392, R392-33 [文献标志码]A
P rep a ra tio n o f m ou se m o n o clo n a l an tib od y again st h u m an v a so rin( V A S N) p rotein by h ig h-effica cy electro fu sio n-b a sed p rotocol
YIN Moli1,NIE Yuanwang1,LIU Hao1,Z H A N G Shuang2,LIU Lei1,LI Xiuchun3,W A N G Huiyan'*
'Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, Jilin 132013; Jilin City Garden Management Center, Jilin 132013；3Jilin Railway Technology College, Jilin 132013, China
* Corresponding author, E-mail：****************
[Abstract]Objective To prepare and identify mouse monoclonal antibodies against human vasorin (V A S N) protein using electrofusion method. Methods The mice were immunized with human recombinant protein VASN-His, and then the cells were fused by electrofusion apparatus. Indirect E L IS A w as used to screen the positive hybridoma cells which could bind natural protein VA SN. The titer and affinities of the antibodies were detected by E L IS A, and W estern blotting was used to det
ermine whether the antibody could recognize VA SN protein in HepG2 cells. Results The fusion rate reached 0.31% when the ratio of spleen cells and Sp2/0 myeloma cells was 2： 1, the alternating electric field intensity w as 50 V, 2 MHz for 20 seconds, and the direct current pulse intensity was 500 V for 0.5 second. Two mouse anti-human VASN monoclonal antibcxJies (4Hland 8B9) were obtained, with the highest titer of 1：256 000 and the highest affinity constant ( K a) of 4.9 x106L/mol. W estern blotting showed that both monoclonal antibodies could specifically recognize V A SN in HepG2 cells. Conclusion Two mouse anti-human VA SN monoclonal antibodies have been successfully prepared by the cell electrofusion method.
Key words] hepatocellular carcinom a；vasorin；electrofusion；monoclonal antibody
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，H C C)致死 率在恶性肿瘤中居第四位。其发病隐匿，可预见 性差，多数患者被检查出时已发展至晚期，若能早期 发现H C C，并针对性，可提高患者生存率[3]。
收稿日期：202046-29；接受日期：2020-11 >02
基金项目：吉林省科技厅技术攻关项目（20190301088NY, 201‘
(201913706017, 202013706002)
作者简介：尹茉莉（1984 -)，女，吉林辽源人，初级实验师
T el：*************；E-mail：
* 通讯作者，王会岩，E-mail: ****************血清学检查费用低廉且损伤性小，是肝癌早期筛查、诊断的重要方法。目前，H C C血清学诊断标志物是 甲胎蛋白（alpha fetoprotein,A F P)，但其特异性、灵 敏度均不高[4]。寻独立的，或与A F P联合用于肝
吉林省科技厅项目（20180623(M5TC)；吉林省大学生创新创业训练项目
癌早期检测的诊断标志物具有重要意义。
人vasorin (V A S N )蛋白是一种典型的1型跨膜 蛋白[5]，在主动脉的血管平滑肌细胞表面具有较高 水平表达，在正常的肾脏和胎盘组织中有少量表达， 但是在乳腺癌细胞、甲状腺癌、肝癌细胞中有较高水 平的表达，在肝细胞癌的血清标本中表达水平也较 高[6—7]。人V A S N 蛋白在HePG 2肝癌细胞大量表达， 并且主要存在外泌体中，外泌体中的V A S N 能促进 人挤静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells , H U V E C )的迁移。V A S N 蛋白与转化生长因子(3 (transforming growth fa ct or (3，T G F -卩）结合，减弱 TGF -(3的传导信号，诱导H U V E C 形成血管样结构，并
抑制白细胞的迁移。TGF -p 在肿瘤的形成中扮演重要角 ，可促进肿瘤的恶性发展和转移[M]。相关
研究表明
V A S N 蛋白是肝癌的潜在候选标志物。在血清样本中, 人V A S N 的表达与A F P 无相关性，制备V A S N 抗体与 A F P 联合筛查H C C 可提高诊断的敏感性w 。
单克隆抗体（monoclonal antibody , m A b )至今已 被广泛的应用在疾病和体外诊断等方面["~]。 制备m A b 通常采用聚乙二醇（polyethylene glycol ， P E G )化学方法进行细胞融合。然而，该方法融合效
率低，P E G 对细胞具有毒性作用，很难获得令人满意 的抗体。细胞电融合技术已广泛应用于m A b 的制备 中，该方法对细胞毒性小、操作简单、重复性强、融 合效率高，据报道电融合法的融合率比P E G 方法的 融合率高10倍左右[14]。2016年，王超男等[15]依托 公司制备V A S N 蛋白胞外结构域单克隆用于研究 V A S N 蛋白的生物学功能。至今，商业化抗V A S N m A b 已被开发，但未见有使用电融合技术制备抗 V A S N 蛋白m A b 应用于建立血清学检测方法的报道。
本实验通过优化电融合参数，进一步提高融合 效率，以期获得能够调节抗原活性的功能性抗V A SN 蛋白mAb ，为建立VASN 免疫学检测方法用于癌症 的临床诊断奠定基础。1
材料和方法
1.1材料
6 ~8周龄雌性BALB /c 小鼠购自上海斯拉克实 验动物有限公司；SP 2/0细胞保存于吉林医药学院吉 林省抗体工程科技协同创新中心实验室。带组氨酸 标签（histidine ，His )的 VASN 重组蛋白（V A S N -His )、 带His 标签的A F P 重组蛋白（AFP -His )、小鼠抗 V A S N m A b 购自北京义翘神州科技股份有限公司；完
266全Freund 佐剂、不完全Freund 佐剂、链霉蛋白酶E 、 甘露醇、氯化钙、氯化镁、次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺
啼徒核昔（hypoxanthine -aminopterin -thymidine , H A T )、H R P 标记是山羊抗小鼠IgG 、鼠类m A b 抗体
亚类鉴定试剂盒均购自Sigma 公司；胎牛血清、 RPMI 1640培养基购自Gibco 公司；蛋白A ( protein A )
亲和层析柱购自G E 公司；二辛可宁酸（bicinchoninic acid , B C A )法蛋白质定量试剂盒购自北京康为世纪
生物科技有限公司；3, 5, 5'-四甲基联苯胺
(3，3’，5, 5’-tetramethylbenzidine , T M B )购自北京中
杉金桥生物技术有限公司。1.2方法
1.2.1小鼠的免疫采用50叫VASN -His 蛋白乳化 等体积完全Freund 佐剂，腹腔注射免疫6 ~ 8周龄雌性 BALB /c 小鼠。每隔两周以等量同样的方式免疫1次，
地源热泵系统均使用不完全Freund 佐剂。3次免疫后，小鼠尾静脉取 血，测定血清抗体的滴度。待效价达到要求后，加强免 疫1次。3 d 后，取小iJ 軸紐行细胞融合。
1.2.2电融合实验分离脾细胞后，将Sp 2/0细胞 与脾细胞分别以1:1、1:2的比例混合，加人链霉蛋白 酶E (pronaseE )激活细胞，15 s 后加人血清终止。细 胞混悬液经电融合缓冲液清洗两次后，进行融合。 电融合仪配置电极LF 498-3，融合室容量为1.5 m L ， 使用电融合缓冲液调整细胞数为2 x 107个/m L ，将 混合好的细胞悬液加人融合室。调整交流电压，即 交流电场（alternating current , A C )强度设计为30 V 、 40 V 、50 V 、60 V , A C 频率2 M H z , A C 持续作用时 间20 s ，显微镜观察细胞“排队情况”。使用两个直 流脉冲，直流脉冲电压（d ire ct current , D C )分别设计 为 300 V 、400 V 、500 V 、600 V , DC 作用时间为 〇.5s 。在最后一次脉冲后，使用交流电压50 V , 0.8 M H z ，持续7 s 。融合后，将细胞悬液从融合室移 至预加热的含200 m l V L 胎牛血清的RPMI 1640培养 基中，调整细胞数为6xl 05个/m L ，每孔100 p L ，加 人铺有小鼠腹腔液原代细胞作为滋养细胞的96孔
板 中，经过H A T 选择培养基筛选，7 ~ 9 d 后，取细胞 培养上清筛选阳性杂交瘤细胞，并记录杂交瘤细胞 的集落，融合效率（％)为每个孔的杂交瘤集落总数
除以B 细胞数，再乘以100。1.2.3 m A b 的筛选用V A S N -His 蛋白包被酶标 板，杂交瘤细胞上清作为一抗，加人H R P 标记的山 羊抗小鼠IgG ( 1:5000)，初筛阳性杂交瘤细胞株。再
细胞与分子免疫学杂志（Chin .1 Cell M »l hnmunol)2021 , 37(3)
3期尹茉莉，等.戍用高效电融合技术制备小鼠抗人vas 〇rm (VASN )单克隆抗体267
排列的细胞较多（图1B )。随着交变电压逐渐升高， 细胞排列整齐，当交变电场强度为50 V 时，95%细 胞成串，仅有极少数细胞游离（图1C )。当A C 强度 为60 V 时，细胞虽然成串排列，但是“队列”不整齐
(图1D )。由此可见，交变电场电压强度影响细胞排 列效果，理想的交变电场电压为50 V 。■ > ；. ■r u 'r * --'
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A ：细胞呈不规则排列；
B ：细胞排列成短的珍珠串；
C ：细胞形成较长
的珍珠串；D ：细胞成串不整齐.
图1 A C 对细胞成串的影响（相差显微镜，X200)
2.2选择最佳的电融合脉冲参数本实验设置A C 强度为50 V 、频率2 M H z 、20 s ， 计算不同直流电脉冲时细胞融效率。与P E G 融合的 融合率比较，当脉冲强度为300 V 时，未见电融合的优 势；随着脉冲强度的增加至4〇〇 V 时，融合率也随之升 髙；当脉冲强度为500 V 时，达融合率最高值0.31%，
存活的杂交瘤细胞较多；当脉冲强度增加到6〇〇 V 时, 融合率略呈下降趋势，细胞的致死率也升高。研究结果 表明，不同脉冲刺激细胞，融合率差异明显，应用5〇〇 V 的直流脉冲产生融合效率最高(户<〇.〇1，图2)。
aP <0.05, bP <0.01 PEG 组.
图2不同直流脉冲强度对融合率的影响
提取HepG2细胞的总蛋白包被酶标板，同时设AFP-His 为对照，筛选能结合天然形式的V A S N 蛋白的杂交 瘤细胞株。通过有限稀释法进行克隆化，扩大培养 能稳定分泌抗V A S N 的m A b 细胞株。
1.2. 4 m A b 的亚类鉴定按照鼠m A b 亚类试剂盒 提供的方法测定其Ig 亚型。
1.2.5 腹水的制备及纯化预备接种杂交瘤细胞 1周前，小鼠腹腔注射液体石蜡〇.5 ml /只。使用生 理盐水重悬杂交瘤细胞数为（1 ~2) xlO 6个/m L ，小 鼠腹腔注射0.5 m i y 只。7 ~ 15 d 后，小鼠腹部可见 明显膨大，抽取腹水。用Protein A 亲和层析柱纯化 腹水，用10 mmol/L P B S 平衡树脂；100 mmol /L 甘氨 酸溶液^112.7)进行洗脱，以1111〇1/[1'1^1^9.0 溶液中和洗脱液，SDS -P A G E 分析，B C A 方法进行蛋 白质浓度测定。纯化的m A b 按1:200进行倍比稀释 后，测定其效价。
1.2.6亲和力的测定参考文献[16]的方法测定
mAb 的亲和力。使用剂量分别为1 pg /m L 和
2 (j L g /mL 的重组蛋白V A SN -His 包板，4 t 过夜，10 g/L 奶粉封闭；加人1:1〇〇〇起倍比稀释的弹力玩具
mAb , 37 ^孵 育1 h ；加入1:5000稀释的HRP 标记山羊抗小鼠二 抗；T M B 显5 min ；测定450 nm 处光密度（A 450 ) 值。根据公式 K aff = ([ A g /Ag '] - 1 )/2 ([ Ag /Ag '] [Ab ']t -[Ab ]t )计算抗体的亲和常数。[Ab ]t 和 [Ab ']t 分别是抗原浓度为Ag 和Ag '时，最大吸光度 (A )值的1/2相应的抗体浓度（m ol /L )。
1.2.7
W e s t ern b l o t 法
鉴定m
A b
特异性提取
HepG2细胞总蛋白进行S D S -P A G E ，将凝胶转膜至 P V D F 膜上；加人终剂量为1 mg /m L 纯化的抗V A S N
2
株m A b ( 1 : 4000 )、商业化小鼠抗V A S N m A b
(1:1000)；加入1:5000倍稀释的H R P
标记的山羊抗
小鼠IgG 为二抗；E C L 显，观察结果。
1.2.8统计学分析检测结果在Excel 中建立数据 库，应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资 料均以i 表示，P <0.05为差异有统计学意义。
2
结果
2.1交变电场强度对细胞成串的影响
当交变电场强度为30 V 时，由于A
C
强度较低，
导致细胞移动较慢，致使细胞成串的比率低或不能
成串（图1A )。增强交变电压为40 V 时，细胞沿电 场方向形成明显的珍珠串排列，可见4
个以上成串
sa i.8x i 〇8
个细胞
■ 2.2 X I 08个细胞 □ 2.5X 108个细胞；
I i H
l
X
i 电
融合
:2电
融含:3卩£0融（
2.3不同细胞浓度比例下融合效率的比较
在AC 强度为50 V 、频率2 M H z 、20 s，脉冲强
度为500 V 、0.5 s 时，SP 2/0骨髓瘤细胞与脾细胞比 例1:2时为最佳的细胞融合比例，电融合率达最高， 电融合比PEG 融合的融合率高出约4倍（P < 0. 05， 图3)。有报道称，PEG 诱导的脾细胞与SP 2/0细胞 融合最佳的细胞比例是1:3[17]，我们经过实验摸索证 实了这一观点，实验数据在本文最后详述。在我们 的实验中，SP 2/0与B 细胞1:2的比例是最有效的电 融合方案（图3)。
268*P <0.05 w 其他两组.
图3不同细胞数量比率对融合率的影响
2.4 m A b 的筛选及亚型鉴定
间接ELISA 筛选抗V A SN mAb ，经初步、复查筛 选出读数值比阴性对照值大于或等于2的阳性杂交 瘤细胞株共50个。在特异性筛选中，获得2株识别
VASN -His 重组蛋白、H eP G 2细胞的总蛋白，与A FP -H is 无交叉反应的杂交瘤细胞株（图4)。经过4次筛选 和克隆化，确定杂交瘤细胞株，分别命名为4H 1和 8B 9。4H 1效价为1:256 000，亚类鉴定为IgGl ; 8B 9 效价为1:128 000，亚类为IgG 2a 。
细胞1_j 分子免疫学杂志（Chin J Ce 丨丨M ol lmmU nol )2021，37(3)
链)处有两条清晰絲，触可达95% (图5)。
A /f /103
M ：蛋白质 marker; 1: 4H 1; 2: 8B9.
图5 S D S -P A G E 分析纯化后的2株m A b
2.6 m A b 亲和常数测定
4出和869的最大吸光度（人45。）值分别为2.13、 1.98，由此推出1/2 A 45。值为1.06、0.99，根据公式 计算4H 1和8B 9的Kaff 值分别为4. 9x l 06iy m 〇l 和1.6 x 106 L /m 〇l ，说明4H 1抗体的亲和力高于8B 9(图 6)。
A
|
-Loga a 为抗休稀释度
1
«-5
I 1-0
0.5 -
图4 E L I S A 检测抗体特异性
2.5 m A b 腹水效价的测定及纯化
Protein A
亲和层観化腹水后，经120 g /L S D S -P A G E
鉴定。相对分子质量(屹）在55 000(重链）和25 000(轻
udn
0 2 4 6 8 10
-Loga a 为抗休稀释度
A: 4H 1的亲和常数测定曲线；B: 8B 9的亲和常数测定曲线.
图6抗VASN mAb 4H 1和8159的亲和常数测定曲线
2.7 m A b 可用于H e p G 2细胞的Western blot 分析以4H 1、8B 9和小鼠抗V A S N m A b 为一抗，对
HeP G 2细胞总蛋白进行W estern blot 法检测。结果显 示，3株抗体与细胞中的V A S N 蛋白结合，条带显 清晰。与小鼠V A S N m A b 相比，4H 1和8B 9抗体稀 释度为丨：4000，而小鼠抗V A S N m A b 稀释度为
(％)
其—
云
3期尹茉莉，等.应用高效电融合技术制备小鼠抗人vasiiri n(VASN)单克隆抗体269
1:1000，可见4H1和8B9特异性强，灵敏度高(图 7)0
A V103'
1: 4H1; 2: 8B9; 3：小鼠抗VASN mAb.
图7 Western blot法检测H e PG2细胞V A S N的表达
3讨论
人V A S N蛋白有两种形式，其可溶形式具有生 物活性，在肿瘤的发生中发挥作用[18]。人V A S N蛋白存在于细胞内和细胞分泌的外泌体中，分泌型 V A S N能够与TGF-p结合，抑制T GF-p的信号转导，能促进H U V E C的迁移，是潜在的肿瘤生物标志 物采用电融合的方法制备抗人V A S N的m A b，为建立人肝癌V A S N的诊断方法提供原材料。
m A b技术是将分泌抗体的B细胞与骨髓瘤细胞 进行融合杂交，经过选择性培养基及ELISA筛选，获得
既能分泌抗体又能传代扩增的杂交瘤细胞株。动物免疫可以使B淋巴细胞在抗原刺激下分化、增殖[2°]。m A b制备动物免疫途径有多种形式，本实验 通过腹腔注射免疫，V A S N蛋白抗原通过腹膜被吸收 直接进入脾、淋巴结免疫器官产生免疫应答。免疫 佐剂可以非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫 应答和有效的免疫记忆，是免疫动物不可或缺的重 要试剂。Freund完全佐剂和Freund不完全佐剂是 目前研制检测用抗体最常使用的佐剂，其价格低廉，刺激机体产生免疫反应更强U2]。本实验免疫抗原为 V A S N真核表达蛋白，对实验动物毒性小，能更好的 激起免疫应答反应。免疫时，抗原与佐剂结合，免疫后获得了较高的血清效价。
电融合效率高于P E G融合，更容易获得膜蛋白 等具有挑战性的抗原的抗体及具有高度亲和力。电融合效率受交变电场强度、直流电脉冲强度、融合细 胞比例等因素影响。交变电场强度直接影响细胞成 串、膜接触，直流脉冲会使细胞膜瞬时破裂，在交变 电场的继续作用下，相邻的细胞间细胞膜融合[23]。不同类型细胞的通透性差异使细胞间的比例影响细 胞融合率M l。融合仪器不同，其融合参数也需要研 究[25]。在本研究中，我们通过改变不同的交流电场 强度，观察细胞的成串情况，在交流电场强度为 5〇V时，融合细胞呈串状态理想。脉冲强度过低，诱导细胞膜形成的有效穿孔或穿孔数量不够，脉冲强度过高，可以提高融合效率，但是细胞膜的过高击 穿使细胞的死亡率增加[26]。我们也验证了这一观 点，在直流脉冲强度为500 V时，细胞融合率较高，杂交瘤细胞状态饱满，呈对数生长；在脉冲强度为 600 V时，杂交瘤细胞死亡率升高，不利于抗体的产 生。SP2/0骨髓瘤细胞处于对数生
长期，活力旺盛，形态良好是提高融合率的又一关键因素。在进行细 胞融合时，需提前一星期将SP2/0骨髓瘤细胞复苏，避免SP2/0细胞传代时间过长造成污染，形态出现 异常。
大量制备m A b主要有两种方法：一是体外培养 杂交瘤细胞，取细胞培养上清液获得m A b，但是该方 法成本高，生产率低，1m L上清液中含10 ~ 60网抗 体，若要满足需求，生产周期长，需大量处理样品，增加工作量。二是小鼠体内诱生法制备腹水。该方 法腹水量大，抗体浓度、效价高，而且雌性小鼠比雄 性更容易产生腹水[21]。本实验使用雄性小鼠体内诱 生法制备m A b腹水。纯化抗体有很多方法，本实验 采用最经典的硫酸铵沉淀抗体后，再经过具有高度 特异性亲和力的protein A免疫亲和层析柱纯化，得 到纯度较高的VASN m A b。
通过ELISA、Western blot鉴定后，筛选到2株效 价高、特异性强的m A b，并且2株抗体均能与天然形 式的V A S N蛋白结合。后续实验我们将利用电融合 技术制备抗肝癌诊断标志物的m A b，并将m A b应用 于血清学检测方法，分析该标志物对肝癌诊断的可 行性，为建立检测H C C的诊断方法奠定基础。
参考文献：
[1 ] Zhu L, Wu Q, Quan B, et al. Autophagy inhibition by reversine and
its suppressive effects on human hepatocellular carcinoma cells _ J .
Biochem Biophys Res Commun, 2020, 528(1) ：105-111.
[2] Liu Y C, Yeh C T, Lin K H. Cancer stem cell functions in hepatocellular
carcinoma and comprehensive therapeutic strategies [ J/O L ]. Cells，2020,9(6)：1331.DOI：10. 3390/cells9061331.
[3] Yin L, He N, Chen C Z, et al. Identification of novel blood-based
HCC-specific diagnostic biomarkers for human hepatocellular
carcinoma[ J ]. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2019, 47 ( 1)：1908-1916.
_4] Borges K A, Dai J L, Parikh N I), et al. Rationale and design of the hepatocellular carcinoma early detection strategy study ： A
multi-center longitudinal initiative of the National Cancer Institute's光学增强器守卫
early detection research network [ J ]. Contemp Clin Trials, 2019,
76：49-54.
[5 ] Li D , Zhang T, Yang X Q, et al. Identification of functional
mimotopes
