融合蛋白在分子生物学中的应用极为广泛，最简单的应用是在蛋白质的
末端连上标签，用于WB检测或纯化。复杂一些的应用则是将需要研究的目的
蛋白与另一个标记蛋白连接：当标记蛋白为荧光蛋白时，可将目的蛋白的示
踪和图像学分析；标记蛋白为白蛋白或者抗体Fc片段时，可用于延长目的蛋白的半衰期；又或者将两个目的蛋白连接，用于研究他们的共同功能或者相互作用。
蒸煮炉作为需要使用融合蛋白的科研工作者，了解一些必要的Linker知识，将使得您在设计质粒方面更加得心应手。本文将介绍一下天然形式下的蛋白Linker和目前应用最广泛的人工合成Linker，以及他们的特性；其次介绍通过增加蛋白Linker实现的各种功能，包括提高折叠和稳定性，促进蛋白质表达，增加内在生物学活性；最后介绍如何使用在线工具设计Linker。
我们通常将使用的蛋白Linker分为3种，分别为柔性Linker、刚性Linker以及
可剪切（或自剪切）Linker。
柔性Linker
最常见的柔性Linker就是G（Gly）甘氨酸和S（Ser）丝氨酸的GS组合，
最常用的GS组合就是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，通过改变n的大小，研究者可以
将结构域之间的距离放大和减小，实现结构域分离（n≥2）或连接结构域，研 究其相互作用。
其他一些常见的蛋白Linker具有一些特定的用
结核杆菌蛋白芯片途，例如单链可变片段（single chain variable fragment(scFv)）中，连接重链可变区（VH）和轻
链可变区（VL）的柔性Linker，通常为
KESGSVSSEQLAQFRSLD和EGKSSGSGSESKST。
这些序列中甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）提供柔 软度，谷氨酸（Glu）和赖氨酸（Lys）提高水溶性。
更简单粗暴一些的柔性Linker就是纯甘氨酸
（Gly）组成的(Gly)8，或短一点点的(Gly)6，它们的优点是在酵母表达纯化过
程中，能够抵抗蛋白酶的水解，同时保护两端蛋白结构域的功能活性。
深度水产刚性Linker
具有(EAAAK)n序列的α-螺旋形成的Linker具有内部氢键和密切联系肽链
骨干，刚性且稳定。因此，刚性α-螺旋Linker可作为蛋白质结构域之间的刚性
电磁屏蔽罩
间隔。通过将蓝荧光蛋白（EBFP）和绿荧光蛋白（EGFP）连接在一起，评估荧光共振能量转移（FRET）之间的效率，可以发现(EAAAK)n序列连接
两个荧光蛋白时，荧光共振能量转移效率比(GGGGS)n序列低，说明α-螺旋Linker能够有效的隔离两个不同的蛋白结构域。
另一种类型的刚性Linker具有Pro-rich序列(XP)n，其中X可指定任何氨基酸，推荐选择丙氨酸（Ala），赖氨酸（Lys）或谷氨酸（Glu）。(XP)n序列没
有螺旋结构，Linker中存在的脯氨酸（Pro）可以增加骨架硬度，并且有效分
离结构域。富含脯氨酸序列的结构在机体中广泛的存在，例如骨骼肌蛋白的
N端就存在(Ala-Pro)7的结构。
刚性Linker表现出相对坚硬的结构，能够有效的将两端的蛋白结构域分开，通过改变n的大小，就能够轻易调整结构域之间的最佳距离，从而保证两端蛋
白的活性与生物功能。
可剪切Linker
到目前为止讨论的Linker通常不会在体内裂解。这些稳定的接头共价连接
两个功能域，使得融合蛋白在体内变成一个蛋白。功能结构域之间的稳定连
接提供许多优点，例如延长的血浆半衰期（例如白蛋白或Fc融合）。然而，原子菲
它也有一些潜在的缺点，包括功能域之间的空间位阻，生物活性降低，以及
由于域之间的干扰导致蛋白质部分的生物分布和代谢方式改变。在这些情况下，引入可剪切Linker，使得融合蛋白能够在体内释放，分离两个功能结构域。
一个研究的比较透彻的过程是二硫键的还原。这个可剪切Linker序列为LEAGCKNFFPR↓SFTSCGSLE，基于二硫环肽，在接头上的两个半胱氨酸（Cys）残基之间形成的分子内二硫键，同时这个序列对凝血酶敏感。在凝血管式反应器
酶的作用下能够有效的对Linker中凝血酶敏感序列（PRS）进行切割。
其他比较流行的可剪切Linker，能够不依赖蛋白酶，自行进行切割处理，
使得两个结构域断裂。这些自剪切Linker通为2A短肽，通常在序列NPG↓P进行
自剪切分离。2A短肽通常来源于病毒的蛋白质序列，例如P2A表示来源于猪
捷申病毒（porcine teschovirus-1）；E2A表示来源于马鼻炎病毒（equine
rhinitis A virus）；F2A表示来源于口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus）。由于自剪切效率各有不同，2A短肽之间也存在一定差异，一般推荐
使用P2A或T2A序列。
如何设计Linker
随着对天然多结构域蛋白中的Linker和重组融合蛋白的广泛研究，研究者们萌生了构建数据库的想法，提出了Linker设计工具，基于融合蛋白的期望特性来合理设计Linker。这种类型的工具的一个典型例子是名为synlinker的程序，该程序在用户指定的输入（例如Linker长度，要避免的蛋白酶敏感序列）
中搜索其连接子序列的数据库，并生成几个连接子序列的输出。Linker数据库是基于这样的假设建立的，即在X射线晶体结构或NMR溶液结构中观察到的环序列可能采用延伸构象作为融合蛋白中的Linker。最终的数据库包含14,734个序列，它们包含PDB文件中的记录，可自动识别蛋白质的二级和环状结构。程序的基本输入是Linker序列的期望长度，通常表示为残基数量或以埃为单位的距离。额外的输入参数包括，避免被蛋白酶或限制性内切酶切割，使得选择的Linker在克隆过程中对特定蛋白酶稳定或序列对限制性内切酶具有抗性。使用者还可以加入氨基酸组成偏好（例如，消除疏水性残基）以进一步选择其感兴趣的Linker。此程序可以作为生成Linker序列的工具，使用十分便利（/）。
【参考文献】
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