TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究 郭阳1,2 郑静2 胡愉2 崔莲仙2 何维2，
（1湖北医药学院基础医学院免疫教研室 湖北十堰 442000；
2北京协和医学院基础学院中国医学科学院基础医学研究所免疫学系 北京100005）
[摘要]目的：研究TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法：通过同位素99mTc标记技术观察TCR9/2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布，及观察TCR9/2(OT3)-Fc对荷瘤裸鼠肿瘤生长和生存期的影响。结果：在荷瘤裸鼠体内99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合，并且其可抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长速度，延长小鼠生存期。结论：本研究初步证明TCRγ9/δ2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果，为肿瘤靶向性抗体提供了新的思路。 [关键词] TCR9/2(OT3)-Fc；肿瘤靶向；荷瘤裸鼠
Anti-tumor Effect of TCR9/2(OT3)-Fc in Nude Mice Bearing Tumor GUO Yang1,2, ZHE
NG Jing2, HU Yu2, CUI Lian-xian2, HE Wei2
(1School of Basic Medicine,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000;2Department of Immunology,IBMS& School of Basic Medicine,CAMS & PUMC,Beijing 100005,China)
Abstract: Objective To investigate the anti-tumor effects of TCR9/2(OT3)-Fc fusion protein in vivo. Methods We observed the imaging and distribution of TCR9/2(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor through labeling 99mTc. Meanwhile, we observed the tumor growth and survival of nude mice with the treatment of TCR9/2(OT3)-Fc. Results In nude mice 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc showed obvious binding ability with tumor tissue and it inhibited tumor growth in nude mice and prolong survival of mice. Conclusion Our preliminary study demonstrated the anti-tumor effect of TCR9/2(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor and provide a novel strategy for tumor targeting antibody therapy.
Key words: TCR9/2(OT3)-Fc; tumor targeting therapy; nude mice bearing tumor
T细胞是免疫系统中的一个独特的体，在外周淋巴细胞库中是数量较小的亚，约占正常人外周血CD3+ T淋巴细胞总数的1%～10%。 T细胞被视为处于免疫防御系统的第一线，在抗感染和抗肿瘤过程中起到重要的防御作用[1]。近年来γδT细胞在肿瘤免疫中的积极作用备受关注。在体内外的实验表明，γδT细胞对不同性质的多种肿瘤细胞，如黑素瘤、淋巴瘤拉画笔[2]、卵巢癌和肺癌[3]等均具有良好的细胞毒作用。TCR与TCRab不同，其识别抗原不具有MHC分子的限制性，可以直接识别肿瘤细胞抗原[4]。为此，我们建立了一个构建新型抗肿瘤抗体的新策略－将人类TCR识别肿瘤的特性通过基因工程的方法移植到一个基因工程抗体中，这样将γδT细胞和抗体二者的优点集于一身，从而形成一种新型完全人源化的抗肿瘤抗体。TCR识别肿瘤抗原的主要结构域是CDR3δ，本项目前期发现了卵巢上皮癌组织浸润的γδT细胞TCR的一个CDR3δ的基因优势序列（OT3）[5]，因此我们利用昆虫表达系统表达了TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白，既保留完整TCR识别肿瘤抗原的特点，又兼有抗体的Fc片段。本研究主要通过同位素标记技术观察TCR9/2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布，及TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的效果，从而初步研究TCR9/2(OT3)-Fc在体内的抗肿瘤效果。 1 材料和方法
1.1 实验动物
BALB/c 裸鼠，4～6周，雌性，均购自中国药品和生物制品检定所啮齿类实验动物中心。饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心二级动物房。
1.2 细胞株
SKOV3，人类卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株，以含10%FCS的DMEM-F12培养基进行贴壁培养。
1.3主要试剂和仪器
SnCl2，无水乙醇，葡庚糖酸钠（GH），2-亚氨基噻吩（2-IT）均为A.R，Sigma公司产品，C-18纯化柱（Sigma公司产品），Na99mTcO4（北京原子高科奶站）。淋巴细胞分离液（ 天津瀚洋生物有限公司，中国）。cck-8机器人模型制作（同仁化学，日本）。
LKB γ 计数器（瑞典），ICON SPECT（西门子，德国），R-905活度计（中国计量科学研究院），HP 1100，Zorbax SB-C18 column, EG&E Radioflow Dectector LB509。
1.4实验方法
肿瘤反应性TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白的表达：利用昆虫表达系统表达TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白，实验方法见本研究前期发表文章[6]。
荷瘤裸鼠模型的建立：取新鲜传代培养的人卵巢癌细胞SKOV3，用0.25%的胰酶消化，用PBS清洗3变，重悬，计数；给裸鼠右前腋下接种1×106/只人卵巢癌细胞SKOV3，标准饲养，约14 d肿瘤长至约0.5 cm3，进行下步实验。
TCR9/2(OT3)-Fc在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内显像实验：取0.5 mg抗体TCR9/2(OT3)-Fc，加入5.0 L的2mg/mL 2-IT，避光，室温反应45 min，过PD-10柱纯化；修饰后融合蛋白TCR9/2(OT3)-Fc加入10 L 100 mg/mL 葡庚糖酸纳溶液和8 L的1 mg/mL SnCl2溶液，立即加入0.2 mL 2.1mCi的99mTc，室温反应15 min后过PD-10柱纯化分离，收集标记产品，测定放射性计数并计算标记率和产率。收集2.5 mL产品，放射性活度人参切片机1.7 mCi。尾静脉注射标记的融合蛋白0.2 mL（0.24mCi）,分别于于注射后10 min、3 h、7 h和24 h进行显像。采集计数为500k，采集炬阵为128×128，ZOOM为3.67，能峰为140 keV，能窗20%，使用低能高分辨平行孔准直器。观察标记药物在裸鼠体内的显像情况。
TCR9/2(OT3)-Fc c的在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内分布实验：给每只裸鼠前腋下接种1×106人卵巢癌细胞SKOV3细胞，标准饲养。当肿瘤长至约0.7 cm时，平均分成2组，每组3只，其中两组尾静脉注射99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc，体积0.1 mL（1.85 MBq，含抗体约2.5μg）分别于用药后4 h 和24 h，从眼球取血，扭断颈椎至死，解剖，取心、肝、脾、肾、肺、胃、畅、肌肉、骨和肿瘤等主要脏器，称重，并测定放射性计数，计算每克组织摄取放射性的百分比（ID%/g）和肿瘤/非肿瘤组织放射性（T/NT）的比值。
TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白的荷瘤（SKOV3）裸鼠实验：荷瘤裸鼠模型的建立：方法同前。肿瘤大小为0.1 cm3时，将裸鼠随机分为2组：PBS对照组和组。每次剂量：PBS对照组40 μL PBS/只；抗体组每只荷瘤裸鼠与肿瘤周边注射40 μL，浓度为1 μg/μL（即40μg/只）TCR9/2(OT3)-Fc。第一次注射记为第1天，每3 d一次，共4次。从第1天起每3 d观察肿瘤结节生长情况。用卡尺测量肿瘤结节的长径与短径，计算肿瘤体积。瘤体体积计算公式：瘤体体积（mm3）=a b2 0.5。a：瘤体长径（mm），b：瘤体短径（mm）。并观察各组小鼠的生存期。
2结果
2.1肿瘤反应性TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白的表达
图1 TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白SDS-PAGE电泳图
经过protein G亲和层析，得到纯度较高的TCRγ9/δ2(OT3)-Fc，如图1.所示，变性SDS-PAGE鉴定，γ9和δ2(OT3)-Fc两条链的大小相近，约70 KD，非变性SDS-PAGE鉴定，显示了单一条带，表明是二聚体表达。纯度达90%以上，可以用于后续实验。
2.2 TCR9/2(OT3)-Fc在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内显像
SKOV3荷瘤裸鼠分别尾静脉注射99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc选择15min、3 h、7 h和24 h四个时相进行γ显像。结果如图2所示，注射后7 h左右，在荷瘤裸鼠体内99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合，红箭头所指为肿瘤部位，这种结合可以一直持续到24 h。
图2 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内显像
2.3 TCR9/2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的分布
高速公路收费系统以ID%/g（每克组织摄取放射性的百分比）和T/NT（肿瘤/非肿瘤组织放射性）比值两个指标评定抗体片段在荷瘤裸鼠体内的分布，选择4 h和23 h两个时相观察其分布，结果分别如表1和图3所示。
99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白在注射后4 h，肿瘤组织的ID%/g值为(1.29±0.15)（ID
%/g>1），说明肿瘤对抗体的摄取尚可。99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白在注射后的早期（4 h），肝肾等血流丰富的组织摄取率较高，显然，这与这些脏器的血流量相关。随着时间的延长，肿瘤/血液的值分别由注射99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc后4 h的（1.13±0.17）到提高到23 h的（2.05±0.28）说明99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc和肿瘤组织的结合效果随着时间的延长在一定程度上增加。
表1 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc注射荷瘤（SKOV3）裸鼠后
不同时间点在体内的分布
组织 | 4 h | 23 h |
ID%/g | T/NT | ID%/g | T/NT |
血液 | 1.15±0.06 | 1.13±0.17 | 0.34±0.02 | 2.05±0.28 |
心 | 0.50±0.05 | 2.64±0.54 | 0.24±0.01 | 2.88±0.20 |
肝 | 1.81±0.22 | 0.73±0.17 | 0.97±0.16 | 0.73±0.17 |
脾 | 0.67±0.07 | 1.91±0.16 | 0.30±0.02 | 2.30±0.21 |
肾 | 7.60±1.38 庞大内部资源网 | 0.17±0.05 | 2.64±0.34 | 0.26±0.01 |
肺 | 0.93±0.16服务器审计 | 1.42±0.31 | 0.43±0.07 | 1.62±0.38 |
胃 | 0.63±0.33 | 2.49±1.24 | 0.47±0.12 | 1.55±0.50 |
肠 | 0.68±0.08 | 1.91±0.32 | 0.20±0.02 | 3.41±0.01 |
肌肉 | 0.14±0.02 | 9.55±2.00 | 0.05±0.01 | 12.75±2.56 |
骨 肿瘤 | 3.45±0.30 1.29±0.15 | 0.37±0.03 | 2.65±0.25 0.68±0.07 | 0.26±0.04 |
| | | | |
