论著??文章编号:1007-8738200505-0557-04BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定李青吴雄文3熊敏翁秀芳卢小玲梁智辉龚非力华中科技大学同济医学院免疫学系湖北武汉430030收稿日期:2004-08-23修回日 载重车期:2004-10-27基金项目：国家自然科学基金资助项目No.30271201国家重点基础研究发展规划973资助课题No.2001CB510008作者简介：李青1975-女湖北蕲春人博士生.3CorrespondingauthorTel:027********Prokaryoticex pressionofBirAenzymeandidentificationofthebioactivityofexpressedproductLIQingWUXi ong2wen3XIONGMinWENGXiu2fangLUXiao2lingLIANGZhi2huiGONGFei2liDepart mentofImmunologyTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofSciencesandTechnolo gyWuhan430030ChinaAbstract
自制化妆水AIM:ToconstructtheliBL221DE3.METH2ODS:ligenomebyPCRandclonedintopGEX24T22toconstructtherecombi2nantplasmi dpGEX2BirA.AfteliBL221DE3.TheexpressedproductwaspurifiedthroughGlutathio ne2agarosechromatographycolumn.Theenzymeactivityoftheexpressedproductwasidentifie dbyELISAan
dWesternblot.RESULTS:There2combinantprokaryoticexpressionvectorpGE X2BirAwasconstructedandthefusionproteinGST2BirAwasexpressedsuccessfully.Theresul tsofELISAandWesternblotshowedthatthepurifiedBirAenzymebiotinylatedHLA2A2peptid ecomplex.CONCLUSION:BirAenzymewithbioactivityispreparedsuccessfullywhichcanbe usedforstudyingtheinteractionbetweenproteinandprotein.Keywords BirAenzymebiotinylationHLA2A2peptidecomplex摘要目的：构建生物素2蛋白连接 酶BirA酶基因的表达载体并在大肠杆菌BL221DE3中表达具有生物学活性的BirA 酶。方法：用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX24T22中构建BirA酶
2GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX2BirA。经测序验证后在大肠杆菌
BL221DE3中诱导表达表达产物采用谷胱苷肽2琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽BirAsubstratepeptideBSP的HLA2A22肽复合物为底物用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果：构建了pGEX2BirA原核表达质粒并在大肠杆菌BL221DE3中诱导表达Mr为61300的BirA酶2GST融合蛋白表达产物经谷胱苷肽2琼脂糖层析柱纯化后得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示表达产物能使HLA2A22肽复合物生物素化。结论：成功地制备了具有生物学活性的Bi2rA酶为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。关键词BirA酶生物素化HLA2A22肽复合物中图分类号Q786文献标识码A
生物素2蛋白连接酶BirA酶EC6.3.4.15是由大肠杆菌BirA基因编码的1个双功能蛋白能识别蛋白质分子的特异序列使生物素结合到蛋白质上生物素化同时也可作为一种阻遏蛋白对合成生物素的操纵子产生抑制作用12。由于其生物素化的能力BirA酶作为一种重要的试剂已广泛用于蛋白质分子之间相互作用的研究特别是细胞表面受体2配体相互作用的研究3。通过在目的蛋白上加入1个能被BirA酶识别的肽序列可生物素化的序列BSPBirA酶既可将生物素结合到目的蛋白上这样就可用标记的亲合素探测目的蛋白4。在四聚体的制备中将4个生物素化的MHC分子连接到1个荧光标记的链霉亲和素上既形成HLA2抗原肽四聚体HLA2peptidetetramer可用于检测和分离抗
原特异性的T细胞5。虽然BirA酶是大肠杆菌的固有成分但商品化的BirA酶价格昂贵且不易购置。本研究旨在制备BirA酶以用于HLA2抗原肽四聚体的制备及其他研究。
1材料和方法1.1材料大肠杆菌BL21DE3为本室保存。原核表达载体
pp18
pGEX24T22为瑞典Pharmacia公司产品。限制性内切酶BamHI、XhoI为MBI公司产品。T4DNA连接酶为Promega公司产品。pyrobestDNA聚755ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志ChinJCellMolImmunol2005215合酶及dNTP为Takara公司产品。针对HLA2I 类分子表位的单克隆抗体mAbW6/32鼠源性由本实验室制备6。HLA2A22肽复合物单体带有BSP由本实验室制备7。生物素和辣根过氧化物酶HRP标记的亲合素为北京中山生物技术公司产品。Gluta2thione2agarose为Sigma公司
产品。商品BirA酶为美国Avidity公司产品。1.2方法1.2.1BirA酶基因模板的制备取liDH5α的饱和菌液离心、去上清STE洗涤1次。加入500μLTE缓冲液于100℃煮沸10min以10000r/min离心10min取上清作为PCR的模板。1.2.2目的基因的PCR扩增按GenBank中登录的大肠杆菌K212MG1655的BirA基因DNA序列设计引物上游引物的序列为5′2CAAGGATCCAAG2GATAACACCGTGCCACTG23′含BamHI识别位点下划线和保护碱基虚线下游引物为
5′2CGTCTCGAGTCATTTTTCTGCACTACGCAGGG23′含终止密码斜体、XhoI识别位点下划线及保护碱基虚线均由上海博亚生物技术有限公司合成。采用上述引物进行PCR。PCR扩增的条件为:94℃40s65℃1min72℃1min30个循环后再于72℃延伸
10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.3BirA酶融合蛋白基因原核表达载体的构建及鉴定纯化PCR产物并用BamHI和XhoI进行双酶切同时用相同的内切酶对pGEX24T22质粒进行双酶切。将双酶切后的PCR产物和质粒进行连接反应后构建成pGEX2BirA重组载体。以此重组载体转化感受态菌E.coliBL21DE3筛选阳性克隆进行PCR鉴定及酶切鉴定并取鉴定后的质粒DNA送上海博亚生物技术有限公司测序。1.2.4目的蛋白的诱导表达将转化有重组体的BL21菌饱和菌液按1∶100加入含有氨苄青霉素的LB培养基中于37℃以250r/min振荡培养至A6000.6。加入IPTG至终浓度为1mmol/L于30℃以250r/min振荡培养46h取1mL菌液进行SDS2PAGE鉴定。
金属化膜
1.2.5目的蛋白的提取与纯化取1000mL诱导表达的菌液于4℃以7700g离心
10min。将菌体沉淀用40mLPBS重悬分别加入终浓度为1g/L的溶菌酶、10mL/L的TritonX2100及5mg/L的DNAase2I混匀于冰浴中放置30min4℃以12000g离心20min。取上清液并以10倍体积的PBS平衡Glu2tathione2agarose层析柱流速为30mL/h。将上清液经0.45μm的滤膜过滤后以30mL/h的流速上样20mLPBS洗去未结合的成分。再以10mL洗脱液140mmol/LTris及10mmol/L还原型谷胱甘肽pH8.0洗脱蛋白。SDS2PAGE 及凝胶薄层扫描鉴定纯化蛋白的纯度。纯化的蛋白对储存缓冲液透析24h每6h更换缓冲液1次与-70℃保存。1.2.6目的蛋白活性的鉴定以带有可生物素化序列的
HLA2A22肽复合物作为BirA酶的底物观察本研究中制备的BirA酶2GST融合蛋白的活性。生物素化反应的体系为:BirA酶本研究制备的BirA酶为50mg/L商品BirA酶为
2mg/L、5g/LHLA肽复合物、1μmol/L生物素、5mmol/LATP、各种蛋白酶抑制剂
2mmol/LEDTA、0.1mmol/LPMSF、1g/Lleupeptin及1g/Lpetsanin于室温反应12h7。生物素化产物的Westernblot检测：将生物素化的产物进行非变性凝胶电泳后转至硝酸
纤维素膜上。以20g/L的BSA封闭、洗涤后加入HRP标记的链霉亲和素孵育1h、洗脱以DAB显。生物素化产物的ELISA检测：用mAbW6/32包被依次经封闭、加入样品、加入HRP标记的链霉亲和素每步均经孵育及洗涤后以OPD显用酶标仪测定波长490nm的A值。2结果2.1原核表达载体的构建及鉴定将PCR扩增的BirA酶基因
片段经20g/L琼脂糖凝胶电泳显示图1在1、2泳道各出现1条大小约为981bp的片段同预期的结果相符。将重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定经琼脂糖凝胶电泳分析显示以重组质粒为模板进行PCR扩增的片段同预期的结果相符4泳道、重组质粒用BamHI 和XhoI双酶切得到的片段同预期的大小相一致5泳道。重组质粒测序的结果与GenBank中登录号为U00096的BirA酶基因序列完全一致结果未显示。2.2目的蛋白的表达和纯化表达菌E.coliBL21DE3经IPTG诱导4、6h后进行SDS2PAGE分析显示在相对分子质量Mr为61300处有1条明显的新生蛋白带同预计的BirA酶2GST融合蛋白的Mr相符。进行灰度扫描分析显示以6h的融合蛋855ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志ChinJCellMolImmunol2005215白的表达率最高占菌体总蛋白的31图2A。以溶菌酶裂菌、离心后分别取上清和沉淀进行SDS2PAGE分析发现表达产物大部分存在于上清中说明融合蛋白大部分以可溶性蛋白的形式存在于细菌内图2B。将BirA酶2GST融合蛋白经GST琼脂糖亲和层析纯化后纯化产物经120g/LSDS2PAGE鉴定及灰度扫描分析显示纯化蛋白的纯度为94图2C。图1BirA基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析A和重组体pGEX2BirA的PCR鉴定及酶切鉴定BFig1 AgarosegelelectrophoresisanalysisofPCRproductoftheBirAgeneAandPCRidentificationan drestrictionenzymedigestionanalysisoftherecombinantpGEX2BirABM1M2:DL2000mark er1-3:PCRproductoftheBirAgene4:PCRproductofpGEX2BirA5:pGEX2BirA/BamHIXhoI.图2pGEX2BirA在E.coliBL21中的SDS2PAGE分析liBL2bySDS2PAGEM:Proteinmarker.1:li
夜光路面BL21transfectedwithpGEX24T22withoutIPTGinduction2:TotalproteinofE. liBL21tran liBL21transfectedwit liBL21transfectedwithpG EX2BirAafterIPTGin2ductionfor6hours.liBL21transfectedwith liBL21transfectedwithpGEX2Bi rAafterIPTGinduction.10:Solubleproteinafterpurification.2.3BirA酶的活性鉴定Westernblot结果显示带有可生物素化序列的HLA2A22肽复合物分别与制备的BirA 酶2GST融合蛋白和商品BirA酶反应后均出现明显的蛋白带说明HLA2A22肽复合物的可生物素化序列上连接了生物素提示本研究中制备的BirA酶2GST融合蛋白同商品BirA酶一样具有使蛋白质特定序列生物素化的活性图3。ELISA结果显示带有可生物素化序列的HLA2A22肽复合物分别与BirA酶2GST融合蛋白和商品BirA酶反应后其所产生的A490值接近说明制备的BirA酶2GST融合蛋白具有使特定序列生物素化的活性图4。图3BirA酶2GST融合蛋白生物素化活性的Westernblot分析Fig3 WesternblotanalysisofthebiotinylationactivityoftheBi2rA2GSTfusionprotein1:Thebiotinyl ationactivityoftheBirA2GSTfusionprotein2:Negativecontrol3:Thebiotinylationactivityofa commercialBirAenzyme.图4BirA酶2GST融合蛋白生物素化活性的ELISA检测Fig4 AnalysisofthebiotinylationactivityoftheBirA2GSTfusionproteinbyELISA1:Thebiotinylati onactivityofBirA
2GSTfusionprotein2:Negativecon2trol3:Thebiotinylationactivityofacom mercialBirAenzyme4:Blankcontrol.3讨论BirA酶作为一种重要的新试剂广泛地应用于蛋白质标记技术方面比如蛋白质纯化、细胞分选以及一些灵敏的检测系统等。在所研究的蛋白质的N2端或者C2端加上1个可生物素化的肽序列一般为
Leu2His2His2Ile2Leu2Asp2Ala2Gln2Lys2Met2Val2Trp2Asn2His2Arg的15肽使其在BirA酶的作用下标记上生955ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志
ChinJCellMolImmunol2005215物素便可利用生物素2亲和素系统对蛋白质进行研究8。标记过程为酶促反应具有高效、位点特异及操作方便等特点同时由于可生物素化的肽序列短小对目的蛋白的构象及活性影响极低。我们选用带有强启动子tac的pGEX24T作为表达载体构建了重组表达载体pGEX2BirA。以其转化E.coliBL21DE3经IPTG诱导成功地表达了N2端为谷胱苷肽巯基转移酶GST、C2端为的BirA酶的融合蛋白。此融合蛋白具有以下特点:1GST不影响BirA酶的活性。BirA酶作为一种双功能蛋白其N2端为DNA结合区域起阻滞子的作用C2端为酶活性区域故在N2端加上GST不会影响BirA酶活性。2GST能增加融合蛋白的可溶性得到具有酶活性的可溶性蛋白。3融合蛋白表达系统便于融合基因翻译起始提高表达效率。4BirA酶作为一种翻译阻遏蛋白大量表达时对细胞生长有害因此不易大量获得该酶蛋白但有GST标签的BirA酶蛋白能降低其作为阻滞子的功能。5融合蛋白极易纯化。GST作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时与自然界存在的酶具有相同的酶活性用亲和
层析法极易分离纯化出融合蛋白。我们制备的BirA酶蛋白可催化带有BSP的
HLA2A22肽复合物单体使其标记上生物素便于将生物素化的HLA2A22肽复合物单体与荧光标记的链霉亲合素结合制备HLA2抗原肽四聚体。另一方面制备的BirA酶2GST融合蛋白中BirA酶的活性低于商品化的BirA酶可能原因是在制备过程中温度、pH值等因素对酶的活性影响导致的。参考文
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