生物化学与生物
物理进展
PROGRESS IN
BIOCHCMISTRY
AND BIOPHYSICS
1999年 第1期 No.1
1999
赖春宁 朱元晓 沈倍奋 洪海燕
摘要 将构建的可溶性SCF表达质粒PBV-SCF转化到大肠杆菌DH5α中进行非溶合蛋白表达，经克隆筛 选出高效表达菌株表达量在20％左右，大量扩增后经包涵体提取、液相层析技术纯化，得到纯度为90％以上的rh-SCF制品，对其等电点和N端氨基酸进行分析，证实具有天然SCF特性，生物活性检测表明该表达产物比活性为6.6×105 U/ mg, 同时可以协同GM-CSF促进人骨髓中CFU-GM增殖. 重组人可溶性SCF的获得对于实验室研究和临床应用具有一定价值. 通用机关零件关键词 rhSCF，纯化，生物活性
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学科分类号 Q78
Recombinant Human SCF Proteins Purification and Bioactivity.LAI Chun-Ning,ZHU Yuan-Xiao,SHEN Bei-Fen(Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850, China); HONG Hai-Yan(North-east Agricultural University, Harbin 150030, China).
Abstract Recombinant plasmid PBV-SCF was transformed into the DH5α and a high expressing germ that could produce about 20 percent SCF product of all the bacterial protein was selected. The SCF product is expressed in form of inclusion body. By liquid chromatography, recombinated human SCF(rhSCF) was obtained with the purity of 90 percent. The sequence of the N-terminal amino acid and the isoelectric point of the rhSCF were analyzed. They are same as the natural SCF. The specific activity of the rhSCF is
三足式离心机6.6×105 U/mg.Morcover, it can coordinate with the granule-macrophage stimulating facet (GM-SCF) to stimulate proliferate of the CFU-GM from the human bone marrow. The acquiration of the rhSCF is important to both the labotory research and the clinical therapy. Key words rhSCF, purification, bioactivity
人干细胞生长因子（stem cell factor-SCF)是一种多功能细胞因子，在机体内主要参与早期的造血祖细胞的增殖、分化和调控等.研究表明SCF作用的靶细胞比IL-3更为原始，是造血细胞生长发育早期所必需的因子之一.在大肠细菌中表达的人重组可溶性非糖基化的SCF已被证实同天然可融性SCF具有相同的生物活性［1，2］.本实验室将构建好的可溶性SCF基因转化到大肠杆菌中进行非融合蛋白表达，经纯化得到90%以上的rh-SCF蛋白，应用免疫学、生物化学方法和活性检测表明该表达产物具有天然的SCF 的特性和生物活性.
1 材料方法
1.1 材料
实验中用S-Sepharose Fast Flow阳离子柱, Sephacryl-S200凝胶柱为瑞典Pharmacia产品；人骨髓单个核细胞来源于临床非血液性肿瘤病人外科手术肋骨; Phastsystem快速电泳为Pharmacia产品；等电点标准品为Bio-Rad公司产品，范围为pI3～9.
1.2 PBV-SCF基因的转化
按分子克隆实验手册［3］, 将构建好的人可融性SCF基因PBV-SCF转化到大肠杆菌DH5α中，经30℃培养和42℃诱导后，选择出表达量高的菌株作为菌种.
1.3 人可融性SCF蛋白的纯化
将S-Sepherose Fast Flow的胶粒装柱，柱长20 cm，直径1.6 cm, 用1 mol/L NaCl冲洗3个柱体积, 再用25 mmol/L NaAc, pH 4.5液平衡柱子, 将包涵体纯化的样品上样, 然后用0～0.35 mol/L NaCl梯度洗脱，间隔5 min收集样品.再用Sephacryl S-200HR胶粒装柱，柱长100 cm(Φ1.6)，用10 mmol/L PBS pH 7.2的液体平衡柱子，将离子交换柱纯化的样品浓缩后上样，用同样缓冲液洗脱，使样品进一步纯化，上述纯化蛋白用于生物活性检测、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点和N端氨基酸分析［4］.
1.4 免疫印迹检测SCF蛋白
上述纯化的SCF蛋白经12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在pH 8.3 Tris-甘氨酸电泳转移液和15 V电压条件下，用湿转移方法将蛋白条带转移到硝酸纤维膜上，应用人SCF标准单抗及辣根过氧化物酶显来识别SCF蛋白和其表达的分子质量［5］.
微型麦克风1.5 生物活性检测
将上述纯化的SCF蛋白在一定浓度范围与造血生长因子GM-SCF合用，应用造血祖细胞集落培养法观察对人骨髓中CFU-GM集落生成影响，间接检测纯化SCF生物活性［6］.
2 结 果
2.1 高效表达重组菌的筛选
将构建好的PBV-SCF表达质粒转化到DH5α大肠杆菌中，在AP抗性的平板上, 随机挑四个菌株进行30℃培养和42℃诱导，全菌体进行SDS-聚丙烯酰胺电泳检测结果表明：克隆的重组菌表达出19 ku左右蛋白，表达蛋白占菌体总蛋白的10％～20％并以不融性包涵体的形式存在于细菌包浆中，挑选表达量在20％左右的表达菌株用5L发酵罐发酵收集细菌备用(图1).
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图1 含有SCF基因的高效表达重组菌的筛选
大球泥1: 分子质量标准；2，3：未诱导的对照；4～7：表达菌裂解物.
2.2 重组可融性人SCF蛋白的纯化
将克隆筛选出含PBV-SCF基因的大肠杆菌DH5α，经30℃培养42℃诱导收集表达菌, 超声破碎后收集到纯度在50％左右的包涵体, 用1 mol/L尿素反复地离心清洗后, 将沉淀溶解在8 mol/L尿素中室温4 h, 离心除去沉淀收集上清，将其溶解在含有0.1 mol/L 还原谷胱甘肽，0.1 mmol/L氧化谷胱甘肽溶液中复性，然后装入10 000分子质量的透析膜中，在10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4缓冲液中透析24 h，离心收集上清，将上清经S-Sepharose Fast Flow阳离子柱纯化，收集1号样品峰，用10 000分子质量的超滤器超滤浓缩样品（2 g/L），样品经Sephacryl-S200凝胶柱进一步纯化，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达蛋白纯度在90％左右(图2，3).
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图2 S-Sepharose Fast Flow阳离子柱和Sephacryl-S200凝胶柱层析图谱
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图3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化样品纯度
1：阳离子柱纯化样品；2：凝胶柱纯化样品；3：分子质量标准.
2.3 重组可融性人SCF蛋白生物活性检测
水性涂料分散剂
依据SCF可以协同GM-CSF促进CFU-GM增殖，在培养体系中加入10 μg/L的人GM-CSF和不同浓度纯化的SCF，根据集落数，以最大增殖量一半为一个活性单位，结果表明SCF蛋白比活性为6.6×105 U/mg(图4).
2.4 SCF蛋白免疫学鉴定
将表达产物经分离后, 用电转移法转到硝酸纤维素膜上, 做蛋白质印迹检测, 证明表达产物具有与天然SCF相同的分子质量(图5).
2.5 纯化的SCF等电点和N端氨基酸分析
在Pharmacia公司产的Phastsystem上做等电聚胶电泳, 与标准等电点蛋白相比, rhSCF等电点约为5.25. 氨基酸N端分析结果表明, 样品中除部分N端多出一个甲硫氨酸外, 前13个氨基酸与天然的人SCF序列相同, 序列如下:Met-Glu-Gly-Ile_Cys-Arg_Asn-Arg-Val-Thr-Asn-Val-Lys.
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图4 重组可融性人SCF蛋白生物活性检测
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图5 重组人SCF蛋白质印迹检测结果
1：分子质量标准；2：SCF.
3 讨 论
人天然SCF是一个高度糖基化糖蛋白，分子质量在30 ku～40 ku之间，主要由基质细胞分泌.基因根据编码区域可分为4个部分，即：信号肽、膜外区、穿膜区和膜内区.机体内的SCF以膜型SCF和可溶性的SCF两种形式存在，可溶性SCF由λ膜外区1～165氨基酸（aa）组成，是其主要功能活性区域［1］.我们将可溶性SCF cDNA片段插入带有λ启动子的载体pBV220中，构建成pBV-SCF重组质粒［7］，转化到大肠杆菌DH5α中进行非融合蛋白表达，设计包涵体、液相层析技术纯化步骤，得到纯度为90％以上的rh-SCF制品，对其等电点和N端氨基酸分析证实具有天然SCF特性, 依据SCF可以协同GM-CSF促进CFU-GM增殖作用，建立了SCF生物活性检测方法，结果表明SCF蛋白比活性为6.6×105 U/mg.
由于SCF在造血细胞发育过程中的重要调控作用, 人们对SCF基因工程产品在临床上的应用前景充满了兴趣.研究表明SCF对于贫血、提高放化疗后白细胞数量、抗急性辐射损伤、基因等方面有应用前景［9］.高纯度重组人可融性SCF的获得对于实验室研究和为临床应用打下了基础.
*国家863青年基金资助项目(7306127).
作者单位：赖春宁 朱元晓 沈倍奋 军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850 洪海燕 哈尔滨农业大学生物工程系，哈尔滨 150030
参考文献
