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周锦兰，俞开潮．油菜籽中主要硫甙的提纯与抗肿瘤活性［J ］．应用化学，2005，22（10）：39-
欧丽兰，余昕，张椿，朱烨（西南医科大学药学院，四川泸州646000）
收稿日期：2016-02-05基金项目：四川医科大学科研基金项目（20130410）
作者简介：欧丽兰（1980—），女，硕士，研究方向为药用植物学。Tel ：135****8413，E- mail ：oulilan@vip．qq．com 摘要：目的
研究慈姑多糖的最佳提取工艺，并测定其抗肿瘤活性。方法
苯酚-硫酸法测定慈姑多糖含有量。在单
因素试验的基础上采用L 9（34
）正交试验，以慈姑多糖提取率为参数，分析提取次数、提取温度、提取时间与料液比对慈姑多糖提取率的影响，优化提取工艺。在小鼠右腋皮下接种S 180肿瘤细胞，灌胃后观察移植瘤抑制率，ABC-ELISA 法检测小鼠血清中IL-2、TNF-α水平。结果 最佳条件为料液比1ʒ40，提取温度100ħ，提取时间120min ，提取次数3次，平均提取率为13.76%。慈姑多糖可抑制小鼠S 180移植瘤的生长，高剂量组（1.60g /kg ）抑瘤率为39.80%，还能提高血清中IL-2和TNF-α水平。结论慈姑多糖具有较明显的体内抗肿瘤活性，其机制可能与多糖提
高机体免疫功能有关。
关键词：慈姑；多糖；提取工艺；正交试验；抗肿瘤活性；S 180；IL-2；TNF-α中图分类号：Ｒ284.2
文献标志码：B
文章编号：1001-1528（2016）08-1835-04doi ：10.3969/j．issn．1001-1528.2016.08.037
慈姑Sagittaria sagittifolia 是泽泻科多年生水生草本植物，别名剪刀草、燕尾草
［1］
，为药食两用植物，在我国有广泛分布与栽培，资源丰富
［2-3］
。其性味苦、甘、微寒，无
毒，具有止血、凉血、消肿、解毒的功效［4］
，临床上主治
胎衣不下、产后血闷、淋病、疮毒肿瘤、咯血等病证［5-6］。多糖为慈姑中的重要组分，也有着很多生物活性成分
［7-9］，目前在天然医药产品的研制过程中属于关键构成物质［7］
。
前期搜集了国内外资料文献，发现对慈姑多糖的研究大多
停留在提取方法上
［8］
，而对其抗肿瘤作用尚未见报道。本
大蒜剥皮机
实验以慈姑多糖量为指标，采用正交设计法确定其最佳提取工艺，并进一步深入探讨该成分抗肿瘤的效果。1材料、试剂与仪器1.1
材料
慈姑购自成都市新津县花桥镇慈姑种植基地，
经西南医科大学药学院生药教研室税丕先教授鉴定为泽泻科慈姑属慈姑Sagittaria sagittifolia L．的球茎。1.2
试剂
D -无水葡萄糖标准品（贵州迪大试剂有限公
司，批号110833-2009040）。三（批号201301004）、浓硫酸（批号20140713）、苯酚（批号20140227）
（成都
金山化学试剂有限公司）；乙醇（重庆川东化工有限公司，批号20140201）。ＲP-MI1640培养基（美国Gibco 公司）；环磷酰胺（CTX ）注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，
批号13022625）；新生小牛血清（南京宏润生物研究中心）；小鼠IL-2与TNF-α试剂盒（南京建成生物研究所，批号110826）；小鼠肉瘤S 180（西南医科大学药品与食品功能中心，定期腹腔接种传代保种）。1.3
仪器
AN1574电子分析天平（上海民桥精密科学仪
器有限公司）；HH-5数显定温水浴锅（浙江华润电器有限责任公司）；TW-2KW 可控调温电炉（成都市永信电器厂）LD4-2A 离心机（北京医用离心机厂）；UV 5800紫外分光光度计（南京生物器材公司）；DHG-8056A 电热定温干燥皿（南京精密仪器研制公司）；DNM-9602全自动酶标工作站（北京普朗集团有限公司）；MCO-15A 二氧化碳培养箱（上海双舜实业发展有限公司）；SWCJ-1F 洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。1.4
动物
ICＲ小鼠（西南医科大学实验动物中心，动物
许可证号SCXK ［川］2008-17），体质量18 22g ，雌雄兼有。2方法与结果2.1
慈姑多糖的提取
称取慈姑粉5g ，置于250mL 烧杯
中，加入蒸馏水，恒温水浴锅中加热120min ，减压抽滤，浓缩液中加入3%三以除去蛋白质，摇匀，静置过夜，离心除去沉淀，滤液中加入4倍量95%乙醇以沉淀多
5
381
糖，静置24h ，离心，得到慈姑多糖粗提物
［10-12］
。蒸馏水溶解，即得供试品溶液，备用。2.2慈姑多糖含有量测定2.2.1
葡萄糖标准溶液制备
精密称取无水葡萄糖对照品
100.00mg ，蒸馏水溶解，定容在100mL 量瓶中，配成1.00mg /mL 葡糖糖对照品溶液。精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL ，置于100mL 量瓶中，蒸馏水定容至刻度，吸取4.0mL ，置于比管中，加入5%苯酚1.0mL 和浓硫酸5.0mL ，摇匀，置于35ħ恒温水浴锅中
加热40min ，冷却至室温［13］
。在490nm 波长处，以蒸馏
水为空白组，测定吸光度。其横坐标是溶液质量浓度（X ，μg /mL ），纵坐标是吸光度（A ），得回归方程A =0.0132X +0.0042（r =0.9961）。2.2.2
提取率测定
斗拱模型
按“2.1”项下方法提取慈姑多糖，
根据标准曲线计算其含有量，按照公式［13］带外衰减
（慈姑多糖提取
率=X ˑV /M ˑ100%）计算提取率。其中，V 为样液体积（mL ），X 为样液质量浓度（μg /mL ），M 为慈姑质量（g ）。2.2.3
显方法
预实验显示，其显要求是移取慈姑多
糖2.0mL ，加入1.0mL 苯酚和5.0mL 浓硫酸，振荡摇匀，在恒温条件下可显0.5h 。2.3慈姑多糖提取率的单因素试验［14-15］
工字扣2.3.1
料液比
精密称取慈姑粉末2.00g ，以料液比
1ʒ20、1ʒ30、1ʒ40、1ʒ50与水相溶，60ħ下水浴1h ，不时搅拌，过滤，按“2.2”项下方法计算提取率，结果见图1。由图可知，随着料液比提高，提取率也会增加，在1ʒ40时最高，但进一步增大至1ʒ50或1ʒ60后反而下降。因此，料液比以1ʒ40为宜
。
图1
料液比对慈姑多糖提取率的影响
2.3.2
提取温度
取慈姑粉末2.00g ，按1ʒ20料液比溶
于水中，60、70、80、90、100ħ下水浴1h ，过滤，按“2.2”项下方法计算提取率，结果见图2。由图可知，在100ħ时提取率最大，同时温度增加，提取率也会增加。因此，提取温度以100ħ以下为宜。2.3.3
提取时间
取慈姑粉末2.00g ，按1ʒ20料液比溶
于水中，60ħ下水浴60、90、120、150、180min ，过滤，按“2.2”项下方法计算提取率，结果见图3。由图可知，当提取时间为60 120min 时，提取率逐渐增加，但之后逐渐减小。因此，提取时间以120min 为宜。2.3.4提取次数
取慈姑粉末2.00g ，按1ʒ20
料液比溶
图2
提取温度对慈姑多糖提取率的影响
图3
提取时间对慈姑多糖提取率的影响
于水中，60ħ下水浴，每次1h ，考察提取次数，结果见图4。由图可知，随着提取次数增加，提取率也随之增加，但超过3次后变化不明显。因此，提取次数以3次为宜
。
图4
提取次数对慈姑多糖提取率的影响
2.4
正交试验因素水平
以提取时间、提取次数、提取温
度与料液比为因素，各因素选择3个水平，通过L 9（34
）
正交试验表对其进行设计，具体见表1。
表1
因素水平
水平因素
A 料液比
B 提取温度/ħ
C 提取时间/min
D 提取次数/次1
1ʒ306060121ʒ40809023
1ʒ50
100
120
3
2.5正交试验结果见表2，方差分析见表3。
由表2可知，对提取率影响最大的因素是提取温度，其次是料液比、提取时间和提取次数，故选择提取次数作为误差项。表3也显示，影响程度依次为B （提取温度）
＞A （料液比）
＞C （提取时间）
吡咯烷酮羧酸锌
＞D （提取次数）。
综上所述，慈姑多糖的最佳提取条件是A 2B 3C 3D 3，即料液比1ʒ40，提取温度100ħ，提取时间120min ，提取次数3次。
6
381
表2正交试验结果
试验号A B C D提取率/% 11111 5.72 212228.02 3133312.42 421237.58 5223111.83 6231213.32 731328.63 8321310.83 9332111.57
K126.1621.9329.8729.12
K232.7330.6827.1729.97
K331.0337.3132.8830.83
k18.727.319.969.71
k210.9110.239.069.99
k310.3412.4410.9610.28
Ｒ 2.19 5.13 1.900.57
主次顺序B＞A＞C＞D
最优水平A2B3C3D3
对接扣件表3方差分析
因素平方和自由度均方F值P值A7.752 3.8815.82＜0.05 B39.67219.8480.96＜0.01 C 5.442 2.7211.10＜0.05 D0.4920.25——总和53.358———注：F0.01（2，2）=99，F0.05（2，2）=192.6验证试验根据最优提取工艺配制3批慈姑多糖溶液，按“2.3”项下方法计算，测得慈姑多糖平均提取率为13.76%，和正交试验结果相当。由此可知，该工艺具有一定可行性。
2.7慈姑多糖抗肿瘤活性研究
2.7.1溶液配制按最佳提取工艺制备慈姑多糖溶液，分为高（1.6g/kg）、中（0.8g/kg）、低（0.4g/kg）3个剂量组，冷藏备用。
2.7.2造模及给药将S
180
细胞经小鼠腹水传代2次后，灭菌生理盐水稀释无菌条件下抽取的小鼠腹水，对小鼠右腋进行皮下注射，每只0.2mL（约5ˑ106 6ˑ106个瘤细胞），制成皮下移植瘤模型。接种24h后，将50只小鼠随机平
均分为5组，即模型组（生理盐水0.2mL/［10g·d］）、环磷酰胺组（0.02g/kg）、慈姑多糖高剂量组（1.6 g/kg）、中剂量组（0.8g/kg）、低剂量组（0.4g/kg）。除了环磷酰胺组需间隔1d进行腹腔注射给药外，其他均灌胃给药10d。
2.7.3抗肿瘤活性测试每天记录小鼠的身体情况，同时称定质量。第11天称定质量后处死，切除右腋皮下组织，剥离肿瘤物，称定质量，计算抑瘤率［16］，公式为抑瘤率=（模型组瘤质量－试验组瘤质量）/模型组瘤质量ˑ100%。结果，与模型组对比，慈姑多糖各剂量组对小鼠体质量均无明显影响（P＞0.05）。同时，环磷酰胺组与慈姑多糖高、中剂量组的瘤质量明显降低（P＜0.05，P＜001），其中高剂量组与环磷酰胺组的抑瘤率超过30%。具体见表4。
表4慈姑多糖对S
180
移植瘤的抑制作用（n=10，xʃs）
组别
剂量
/（g·kg－1）
体质量/g
用药前用药后
瘤质量/g抑瘤率/%
模型组—19.25ʃ1.0724.35ʃ1.23 1.54ʃ0.32—环磷酰胺组0.0219.06ʃ1.3125.72ʃ1.57*0.67ʃ0.87＊＊65.67慈姑多糖（高） 1.6019.18ʃ1.3324.85ʃ1.150.84ʃ0.52＊＊39.80慈姑多糖（中）0.8020.32ʃ1.0625.31ʃ1.18 1.21ʃ0.87＊＊25.87慈姑多糖（低）0.4020.13ʃ1.0725.08ʃ1.33 1.31ʃ0.6921.38
注：与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01
2.7.4慈姑多糖对血清TNF-α与IL-2水平的影响第11天时眼球抽血，将血清分离，酶标仪测算出每一孔的吸光度（450nm波长），样品与标准品的吸光度与空白孔的吸光度相减，把各样品的吸光度与标准曲线结合，计算其相应含有量［16］。结果，与模型组比较，慈姑多糖各剂量组血清IL-2水平均有增加，其中高、中剂量组有显著性差异（P＜0.05）。环磷酰胺组、慈姑多糖各剂量组血清TNF-α水平均有增加，其中高剂量组和环磷酰胺组有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。具体见表5。
3讨论
通过单因素试验和正交试验发现，提取温度对慈姑多糖提取率有显著影响，其次是提取时间与料液比，提取次数影响最小，正交试验结果也印证了这一结果。最终确定，最佳提取工艺参数为料液比1ʒ40，提取温度100ħ，提取时间120min，提取次数3次，慈姑多糖提取率为13.78%。表5慈姑多糖对血清TNF-α与IL-2水平的影响（n=10，xʃs）
组别
剂量/
（g·kg－1）
IL-2/
（pg·mL－1）
TNF-α/
（pg·mL－1）
模型组—124.43ʃ44.3744.72ʃ9.63
环磷酰胺组0.0286.64ʃ43.6768.56ʃ11.39＊＊慈姑多糖（高） 1.60148.43ʃ34.73*62.39ʃ8.17＊＊慈姑多糖（中）0.80136.27ʃ28.51*60.43ʃ5.37*
慈姑多糖（低）0.40126.09ʃ36.2558.47ʃ13.55*注：与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01
然后，按照该工艺提取慈姑多糖，考察其抗肿瘤效果。结果，该成分对S180移植瘤有一定抑制作用，各剂量组均呈现出一定的剂量依赖性，其中高剂量组的抑瘤率达39.80%，但低于环磷酰胺组（65.67%）。同时，它还能明显提高血清中IL-2、TNF-α水平，而且高、中剂量组作用更为显著（P＜0.05，P＜0.01）。综上所述，慈姑多糖能
7381
通过调节血清中IL-2、TNF-α水平来增强机体免疫力，从而发挥出抗肿瘤作用。参考文献：
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星点设计-效应面法优化鹿角胶-脱蛋白骨制备工艺高志惠1，孙铁锋1，王平2，王亮
2
（1．山东中医药大学，山东济南250355；2．山东省中医药研究院，山东济南250014）
收稿日期：2015-12-22基金项目：国家自然科学基金项目（81273776）；山东省科技发展计划（2014GSF118026）；山东省自然科学基金（ZＲ2015HM061）；济南市科技明星计划（20120142）；山东省自主创新重大计划项目（2012ZHZX1C0405）
作者简介：高志惠（1990—），女，硕士生，研究方向为中药药理学。Tel ：（0531）82949847，E-mail ：gaozhihui8800@163．com *通信作者：王平（1974—），女，副研究员，硕士生导师，研究方向为中药药理学。Tel ：（0531）82949847，E-mail ：wangpingjinan @163．com
摘要：目的采用星点设计-效应面法优化鹿角胶-脱蛋白骨制备工艺。方法煎煮提取鹿角胶后，H 2O 2-乙醚制备脱蛋白骨。以鹿角胶质量浓度、冻干时间和交联时间为自变量，孔隙率为因变量进行多元线性回归和二项式方程拟合，描绘效应面，确定最佳工艺。结果
最佳条件为鹿角胶质量浓度1.20g /mL ，冻干时间64h ，交联时间8h 。结论
该
方法简便、合理、稳定，预测性良好。
关键词：鹿角胶；脱蛋白骨；星点设计-效应面法中图分类号：Ｒ284.2
文献标志码：B
文章编号：1001-1528（2016）08-1838-04doi ：10.3969/j．issn．1001-1528.2016.08.038
鹿角胶-脱蛋白骨支架是将脱脂脱蛋白处理后的猪股骨松质骨与鹿角胶混合制备而成的支架，因鹿角胶中富含骨生长的营养物质和促骨生长的细胞因子，而脱蛋白骨能保持骨原有的三维立体结构和孔隙率，故两者形成的鹿角胶-脱蛋白骨支架能够将坏死部位的细胞激活，达到骨的“再生”
，从而股骨头缺血性坏死，在临床上具有广阔的应用前景。目前，传统正交设计制备的支架由于试验次数
少，精度低，导致建立的数学线性模型预测性较差，而星点设计采用非线性预测模型
［1］
拟合，在中心点进行重复试
验以提高精度，使预测值更接近真实值。
由于组织工程所使用的多孔可降解支架具有较高的空隙率，可以保证细胞有生长、增殖的三维微环境，因此本实验以鹿角胶质量浓度、冻干时间、交联时间为自变量，孔隙率为因变量进行星点设计试验，效应面法优化制备工
8
381
