•4618・现代牛物医学讲慝 Progress in Modern Biomedicine VoL20NO«24DEC2020
doi:10.ki.pmb.2020.24.004
张继朋1卢强I陈静$王武平I杨三虎仏
(1空军军医大学唐都医院胸外科陕西西安710049；2泰州职业技术学院护理系江苏泰卅225300)
摘要目的：探讨何种雌激素受体在肺腺癌A549细胞系上皮间质转化(EMT:Epithelial-mesenchymal transition)过程中发挥作用
方法：用雌激素受体拮抗剂分别抑制A549细胞系中的雌激素和受体，再用浓度为1*10-"mol/L的雌激素刺激抑制前后的各组细胞系，用q-RT-PCR及Western blot实验检测各组细胞中EMT标志物的表达量，用Transwell实验检测各组细胞迁移量，计算各组间有无统计学差异。结果：雌激素组细胞中Vimentin的mRNA表达量为5.81±0.71，显著高于空白对照组,E-cadherin的mRNA 表达量为0.43±0.07，显著低于空白对照组，细胞迁移数量为80.17±&82，显著高于空白对照组，组间有统计学差异。用雌激素受体拮抗剂MPP处理前后Vimentin的mRNA表达量分别为7.63±0.92和6.29±0.73，均显著高于空白对照组，组间 有统计学差异；E-cadherin的mRNA表达量分别为0.39土0.05和0.42土0.06，均显著低于空白对照组，组间有统计学差异；细胞迁移数量分别为85.21±11.56和78.69土9.63，均显著高于空白对照组，组间有统计学差异。雌激素加雌激素受体拮抗剂PHTPP组及雌激素加雌激素和受体拮抗剂组V imentin的mRNA表达量分别为1.21±0.15和1.17±0.13,E-cadherin的mRNA表达量分别为0.86土0.12和0.93±0.11，细胞迁移数量分别为39.85± 5.22和37.21± 4.95，与对照组无统计学差异。各组细胞中EMT标志物蛋白表达量与mRNA表达量趋势相同。结论：雌激素p受体是雌激素促进A549细胞系发生EMT过程的重要靶点，在肺腺癌的肿瘤发生和发展过程中发挥了主要作用，可以作为进一步靶向的研究方向。
中图分类号:R-33;R734.2:Q579.13文献标识码:A文章编号：1673-6273(2020)24-4618-05
The Role of Estrogen Receptor in EMT of Lung Adenocarcinoma
*
Cell Line A549
ZHANG Ji-peng,LUQiang,CHENJing,WANG Wu-ping1,YANG San-hu'A
(1Department of t horacic surgery,Tangdu Hospital,Air Force Medical University,Xi'an,Shaanxi,710049,China;
2Department of n ursing,Taizhou Polytechnic College,Taizhou,Jiangsu,225300,China) ABSTRACT Objective:To investigate the role of estrogen receptor in epithelial mesenchymal transition(EMT)of lung adenocarcinoma cell line A549.Methods:Estrogen receptor antagonists were used to inhibit estrogen receptor in A549cell line,and then estrogen of1x10"mol/L concentration was used to stimulate the cell lines before and after inhibition.The expression of EMT markers in each group was detected by q-RT-PCR and Western blot,and the cell migration rate of each group was detected by Transwell,and the statistical difference between each group was calculated.Results:The mRNA expression of vimentin in estrogen group was5.81±0.71,which was significantly higher than that in blank control group.The mRNA expression of E-cadherin in estrogen group was0.43±0.07,which was significantly lower than that in blank control group.The number of cell migration in estrogen group was80.17±8.82,which was significantly higher than that incontrol group.The mRNA expression of vimentin were7.63±0.92and6.29±0.73before and after treatment with MPP,which were significantly higher than those in control group(P<0.05);the mRNA expression levels of E-cadherin were 0.39±0.05and0.42±0.06,which were significantly lower than those in the control group;the number of
cell migration were85.21±11.56and78.69±9.63before and after treatment with MPP,which were significantly higher than that of the control group,and there was statistical difference between the two groups.The mRNA expression of vimentin was1.21±0.15and1.17±0.13,the mRNA expression of E-cadherin was0.86±0.12and0.93±0.11,and the number of cell migration was39.85± 5.22and37.21± 4.95in estrogen plus PHTPP group and estrogen plus MPP and PHTPP group respectively which were no significant difference with control group.The trend of EMT marker protein expression and mRNA expression in each group was the same.Conclusion:Estrogen receptor p is an important target for estrogen to promote the EMT process of A549cell line.It plays an important role in the carcinogenesis and development of lung adenocarcinoma,and can be used as the research direction of further targeted therapy.
*基金项目：国家自然科学基金项目(81572252)
作者简介：张继朋(1984-)，本科，主治医师，主要研究方向：胸外科肿瘤,E-mail:****************
△通讯作者：杨三虎(1979-)，硕士，主治医师，主要研究方向：胸外科肿瘤.E-mail:，电话：153****5359
(收稿日期：2020-06-27接受日期：2020-07-23)
现仕物医学孵 Progress in Modem Biomedicine VoL20NO24DEC2020•4619・
Key words:Estrogen receptor;Epithelial stromal transformation;Lung cancer
Chinese Library Classification(CLC):R-33;R734.2;Q579.13Document code:A
Article ID:1673-6273(2020)24-4618-05
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前B
肺癌已经成为危害公众健康的一大难题，目前肺癌的临床主要是以手术为主结合放化疗、靶向以及免疫为一体的综合措施冋，但仅对于没有发生转移的患者效果较好，而对于已经发生远处转移的患者，则没有较好的办法。肺癌主要通过血液、淋巴和局部扩散进行转移叫而上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)则是肿瘤转移的起始环节。EMT过程中主要的分子特征改变为上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达减少和功能缺失，间质细胞标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin)过量表达叫主要细胞学改变为迁移能力增强。本课题组前期实验证实叫浓度为1*10"mol/L的雌激素可以有效促进A549细胞系发生EMT过程，但雌激素是通过何种受体参与EMT过程仍不明朗，
如果能够明确是何种雌激素受体参与肺癌的发生发展过程，将有望为临床精准肺癌提供新的思路。本实验用雌激素受体拮抗剂分别抑制A549细胞系中的雌激素和受体，用q-RT-PCR及Western blot方法检测各组细胞中EMT标志物在雌激素刺激前后表达量的变化，用Transwell实验检测各组细胞在雌激素刺激前后迁移能力的变化，以此来判断何种雌激素受体在A549细胞系EMT过程中发挥作用。现总结报告如下：
1材料与方法
1.1主要实验材料
下表为本实验主要实验材料，其余实验材料为唐都医院胸外科实验室统一采购(表1)。
1.2培养细胞
培养A549细胞系，编号A、B、C、D、E，常规培养，A组为空白对照组,B组只加雌激素,C组加雌激素和雌激素a受体拮抗剂,D组加雌激素和雌激素3受体拮抗剂,E组加雌激素、雌激素a受体拮抗剂和雌激素p受体拮抗剂。配制含有雌激素浓度为lx lO^mol/L的1640培养基，配制雌激素受体拮抗剂：雌激素受体a(ERa)特异性抑制剂甲基哌喘毗瞰Methyl-Piperidi-no-Pyrazole,MPP)浓度为100pmol/L,ER|3的拮抗剂Chemical name4-[2-Phenyl-5,7-bis(trifluoromethyl)pyrazolo[1,5-a] pyrimidin-3-yl]phenol(PHTPP)
浓度为100pmol/LP。加入雌激素受体拮抗剂，使其浓度为100pmol/L0当细胞到达对数生长期起始点时，倒掉培养基，在A、B、C、D、E号培养瓶中分别加入4mL各组对应的1640培养基,48小时后，提取各组细胞的RNA和总蛋白，行RT-qPCR和Western-blot检测各细胞系中NOK和EMT标志物的表达量。
1.3q-RT-PCR检测各组细胞中EMT标志物的mRNA表达量
提取各组细胞总RNA，存放于-80P冰箱中备用；用紫外分光光度计测总RNA浓度，每次测量前应先做空白对照，测每个样品之间应将仪器擦洗三遍；根据测量所得RNA浓度计算反转录需要的加样量，加样量最多不多于11Jig；荧光定量PCR(20“L体系)；每个样本设3个复孔，混匀，离心，分装入八连管，放入PCR仪，运行程序。本实验重复七次，保存并分析结果。
表1实验材料及厂家
Table1Experimental materials and manufacturers
Material Manufactor
A549Cell line
Thoracic Surgery Laboratory of
Tangdu Hospital
Estrogen Estradiol company Vimentin monoclonal antibody Abeam company
E-cadherin monoclonal antibody Abeam company
p-actin monoclonal antibody Abeam company
Reverse transcription Kit Thermo company
Primer Bioengineering Co.,Ltd.
MPP Tocris company
PHTPP Abeam company
PCR引物序列:
扩增基因引物序列退火温度
E-cadherin UP:5'-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT・3'
DOWN:5'-TCCCAGGCGTAGACCAAGA-3'
61°C
Vimentin UP:5'・AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3'
DOWN:5,-CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3,
61°C
B-actin UP:5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'
DOWN:5'・GCTGTCACCTTCACCGTTCC・3'
61°C
1.4Western-blot实验检测各组细胞中EMT标志物的蛋白表液，用去离子水稀释蛋白样品，做3个复孔，制作标准曲线，计达量算样品浓度；配分离胶和配浓缩胶；正确连接正负极，精确控制提取总蛋白，取20jiL保存于-20°C冰箱；配备BCA工作加样量，开始电泳；配制电转缓冲液，将蛋白凝胶转移至PVDF
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膜上，恒流条件下转膜；配制1* TBST 溶液，配制封闭用脱脂
牛奶，将带有目的蛋白的PVDF 膜用TBST 轻轻清洗，然后正
面朝上放入已配制好的牛奶中，在摇床上缓慢摇晃封闭2-3小
时（根据室温的不同调整封闭时间，室温低时可适当延长封闭
时间）；按照一定比例稀释抗体（E-cadherin 、Vimentin 和|3-actin 抗体稀释浓度分别为：1:2000、1:2000、1:2000，二抗稀释浓度
为：1:10000），清洗，一抗孵育，清洗，二抗孵育；配置显液，打
开仪器，在电脑上运行程序，显，保存图片。
1.5 Transwell 实验检测各组细胞迁移能力
培养A549细胞系，分组同前。配制雌激素浓度为lx 10* mol/L 的1640培养基，配制雌激素受体拮抗剂：
雌激素受体a
拮抗剂MPP 浓度为100pmol/L，雌激素受体p 拮抗剂PHTPP 浓度为100pmol/L 。调整细胞浓度至lx 2/mL，向各组小室 中分别加入200 pL 细胞悬液，加入500 |iL 含不同浓度雌激素
和雌激素受体拮抗剂的1640培养基；在细胞孵箱中培养48小 时，用PBS 冲洗小室三遍，并用棉签擦去小室内部的Matrige
胶和细胞，将小室放入95%乙醇中固定10 min，再放入5%的
结晶紫溶液中染30min，用PBS 冲洗干净，用棉签擦净小室
内部残留的染液；在200倍倒置相差显微镜下观察细胞，并在 每个小室的上下左右中五个位置拍照，细胞计数；重复7次，统
计数据，分析各组间细胞迁移能力有无统计学差异。
1.6统计学分析
q-RT-PCR 及Transwell 实验结果用SPSS18.0软件进行分
析，将七次实验的结果行统计分析，结果以均数士标准差（吐5）
表示，组间比较采用t 检验，各实验组分别与空白对照组进行
比较,P 值<0.05表示组间差异有统计学意义。
2结果
2.1雌激素/受体拮抗剂对EMT 标志物mRNA 和蛋白表达量
的影响
雌激素组细胞中Vimentin 的mRNA 表达量为7.63±
0.92，显著高于空白对照组，组间有统计学差异（P<0.05），雌激
素加MPP 组Vimentin 的mRNA 表达量为6.29± 0.73，表达量 较雌激素组低，但依然显著高于对照组（P<0.05），雌激素加
PHTPP 组Vimentin 的mRNA 表达量为1.21± 0.15，与对照组
无统计学差异（P>0.05），雌激素加MPP 和PHTPP 组Vimentin
的mRNA 表达量为1.17± 0.13，与对照组无统计学差异（P>0.05）
（图l,a 图）。
雌激素组细胞中E-cadherin 的mRNA 表达量为0.39±
0.05，显著低于空白对照组，组间有统计学差#（/><0.05 ），雌激
素加MPP 组E-cadherin 的mRNA 表达量有所升高，为0.42+
0.06，但依然显著低于对照组（P<0.05），雌激素加PHTPP 组 E-cadherin 的mRNA 表达量为0.86± 0.12，与对照组无统计学
差异（P>0.05），雌激素加 MPP 和 PHTPP 组 E-cadherin 的 mR
NA 表达量为0.93± 0.11，与对照组无统计学差异（P>0.05）（图
1 ,b 图）。
各组细胞中EMT 标志物蛋白表达量与mRNA 表达量趋 势一致（图l,c 图）。
8 6 4 2 0
2P )
A U -U 05
0>«u H
■ E
■ D
(a p )
A ucvno
O A -C E V M
A
:
D
p-actin
Vimentin
E-cadherin
A B C D E
图I MPP 和PHTPP 对A549细胞中EMT 标志物表达量的影响
Fig.l The effect of MPP and PHTPP on the expression of EMT markers in A549
七与第一组(0 mol/L )相比，P<0.05(n=7)
*： Compared with the first group (0 mol / L), P<0.05( n=7
)
现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine VoL20NO«24DEC2020・4621・
2.2雌激素/受体拮抗剂对细胞迁移能力的影响
空白对照组细胞迁移数量为32.57± 5.38，雌激素组细胞迁移数量为85.21±11.56，显著高于空白对照组，组间有统计学差异(P<0.05)，雌激素加MPP组细胞迁移数量为78.69±9.63，较雌激素组低，但依然显著高于空白对照组(P<0.05)，雌激素加PHTPP组细胞迁移数量为39.851 5.22.略高于空白对照组.组间无统计学差异(P>0.05).雌激素加MPP和PHTPP 组细胞迁移数量为37.21± 4.95，与空白对照组无统计学差异(P>0.05)(图2)。
图2MPP和PHTPP对A549细胞迁移能力的影响
Fig.2The effect of MPP and PHTPP on the migration of A549cells 七与第一组(0mol/L)相比，P<0.05(n=7)
*:Compared with the first group(0mol/L),P<0.05(n=7)
3讨论
在世界范围内，肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年升高，然而目前仍然缺乏有效的防治手段叫全球肺癌的发生率和死亡率基本平行，每年约有180 万的新生病例和160万的死亡病例叫近几年，女性患肺癌的比率逐年增高，发病率和死亡率仅次于乳腺癌叫肺癌已经成为危害公众健康的一大难题。目前临床肺癌的主要手段是以手术为主结合放化疗、靶向以及免疫为一体的综合措施何，但仅对于没有发生转移的病灶效果较好，而对于已经发生远处转移的患者，则没有较好的办法，而肺癌致死的主要因素在于肺癌的转移。肺癌致死的主要因素在于肺癌转移带来的一系列并发症，如肿瘤直接压迫或侵犯重要脏器导致器官功能衰竭.进而导致死亡。因此，防治肺癌转移成为了肺癌的突破口。
EMT是1982年由Greenburg等人首次在人晶状体上皮细胞中发现的机体内一种普遍的生理及病理现象，
即上皮细胞在特定的条件下向间充质细胞转化的过程2叫EMT在胚胎发育、伤口愈合、器官纤维化和肿瘤转移等过程中均扮演着重要角EMT过程不仅是简单的促进细胞的迁移和侵袭能力，还是一个复杂的重新编码的过程.包括表观遗传学改变、细胞骨架的重新改造、蛋H表达的变化、细胞粘附能力的丢失、细胞极性消失、侵袭和转移能力增加、代谢和分化过程的改变等"叫该过程通过分化上皮癌细胞来逆转分化状态，不仅表达了干细胞标记物.而且还获得了干细胞样的功能"叫EMT在肿瘤发生发展过程中主要的分子特征改变为：E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮标志物表达和功能缺失“如，同时波形蛋白(Vimentin)等间质细胞标志物过量表达妙刊。本课题组前期实验已证实通过测定细胞中Vimentin和E-cadherin两个标志物的表达量及细胞的迁移能力，可以判断细胞是否发生了EMT 过程叫这与国外的相关研究结论相符。本次实验主要验证雌激素受体在肺腺癌A549细胞系EMT过程中的作用，基于前期研究基础，仍选用Vimentin和E-cadherin作为EMT标志物，同时应用细胞迁移实验检测细胞迁移能力。
雌激素作为人体重要的激素之一，不仅有重要的生理作用，还与多系统肿瘤的发生、发展关系密切3刑。以往的经验认为，雌激素作为人体必需的激素之一，与肿瘤的发生发展没有关系，然而最近的流行病学统计发现，在同样的烟草暴露下，女性罹患肺癌的比例高于男性，绝经前患肺癌的比例高于绝经后，且肺腺癌占主要部分a匈。有研究表明，在非小细胞肺癌患者血清中检测到雌激素含量显著高于正常组织，且血清中雌激素含量与肿瘤的分期及患者预后有相关性，血清中雌激素含量越高，肿瘤分期越晚.患者预后越差0如。另有研究发现，雌激素受体不仅与乳腺癌、卵巢癌等女性生殖系统肿瘤
的发生相关，与肺癌、直肠癌的发生发展也具有密切关系，可见雌激素及其受体对人体肿瘤的发生过程具有重要作用㈣。本课题组的前期研究结果显示切，在体外条件下，当雌激素浓度为lx10"mol/L 时，对肺腺癌A549细胞系EMT过程的促进作用最显著，故本次实验，仍选用lx10
*m ol/L作为雌激素的工作浓度。雌激素主要通过和两种受体发挥作用，但是具体是哪一种受体参与
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其中，并不清楚。本实验通过分别用雌激素和受体拮抗剂抑制A549细胞系中的雌激素和受体，再用浓度为lx10-«mol/L的雌激素刺激细胞，通过统计分析发现，抑制雌激素受体，并不能阻断雌激素对A549细胞系EMT过程的促进作用，而抑制雌激素受体后，A549细胞系中EMT标志物表达量在雌激素的作用下变化并不明显，细胞迁移数量也与对照组无显著差异综上所述，我们的研究表明，雌激素B受体是雌激素促进A549细胞系发生EMT过程的重要靶点，在肺腺癌的肿瘤发生和发展过程中发挥了主要作用，可以作为进一步靶向的研究方向。
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