一株具有耐受重金属特性的高效解磷草酸青霉菌

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株具有高效解磷及耐受重金属特性的草酸青霉。 

磷是植物必需的营养元素之一，我国有74%的耕地土壤缺磷。土壤中95%以上的磷为无效形式，植物很难直接吸收利用。施入的磷肥当季作物利用率为5%～25%，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合，形成难溶性磷酸盐。提高磷的利用率一直是农学家关注的问题。很多因素影响土壤磷的利用效率，其中，微生物对土壤磷的转化和有效性影响很大。大量的研究结果证明：土壤中存在大量的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，增强植物对土壤中磷元素的摄取。目前，对解磷微生物的研究主要集中在解磷细菌方面，解磷真菌方面的研究相对较少。例如：中国发明专利（申请号：201110121381.5）公开了一株南方红豆杉根际高效解磷嗜松青霉及其应用；中国发明专利（申请号：201210235182.1）公开了一种马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉及其应用。 

矿山开采造成矿区大片植被和耕地被破坏，同时还产生大量矿业废物，严重影响土壤质地和结构。矿山开采所产生的大量酸性矿井水和尾砂矿是造成矿区及其周围地区生态系统重金属污染的主要原因之一，成为环境中重金属污染的主要污染源。近年来，国内外关于矿区土地复垦和生态重建的研究十分活跃，其中适生优良先锋植物种类的筛选和培育是一种行之有效的方法。但是矿区复垦地除了存在重金属污染的问题外，复垦地土壤的肥力低，尤其是有效磷含量低的问题，是限制矿区复垦地植被重建的重要因素。 

本专利涉及的菌种是从湖南省湘西州花垣县的铅锌尾矿区分离筛选出的一株高效解磷草酸青霉，而且该菌株对Pb2+、Zn2+、Cr2+、Mn2+等重金属具有很强的抗性。目前关于高效解磷草酸青霉及其耐重金属方面的研究在国内还未见相关报道。因此，从矿区污染地筛选耐受重金属的高效解磷真菌，对调节土壤磷素供需矛盾，改善矿区复垦地土壤肥力，促进当地植被生长具有重要意义。 

本发明的目的是提供一种能够耐受重金属的高效解磷草酸青霉。 

为了实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案如下： 

本发明采用的高效解磷、耐受重金属的菌株是由我们实验室从湖南省湘西州花垣县的铅锌矿表层土壤中分离筛选出来的，将其编号为TJ2，分类命名为草酸青霉（Penicillium oxalicum），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号CGMCC No. 7699，保藏日期为2013年6月14日。

该菌株的主要生物学特征：分生孢子梗直立、无、有分隔、具有帚状枝、且为做三次分枝的帚状形态，帚状枝上小梗丛生于分枝顶端呈花瓶状、分生孢子常链状生长、球形至椭圆形、无至着、表面光滑。该菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上菌落边缘为白，孢子形成后浅绿至深绿。 

将该菌株的18SrDNA ITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明，该菌株与青霉属（Penicillium）同源性都很高，与草酸青霉（P. oxalicum）的相似度为99%以上。结合形态特征、培养特征及18SrDNA ITS序列分析，该菌株确定为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。 

上述菌株在溶解难溶性无机磷酸盐中的作用：在液体摇瓶实验中，该菌株对难溶性磷酸盐磷酸三钙（Ca3(PO4)2)、磷酸镁（Mg3(PO4)2)和磷酸铝（AlPO4）具有极强的溶解效果。其中，对磷酸三钙和磷酸镁的溶解效果达到100%，对磷酸铝的溶解效果达到95.5%。 

上述菌株对重金属耐性方面的作用：本发明菌株除了具有很强的无机盐解磷特性，还对多种重金属具有耐性。将该菌株分别接种于含有Pb2+、Zn2+、Cr2+、Mn2+、Cu2+、As5+、Cd2+等重金属的液体培养液中，对上述重金属均具有较强的抗性，特别是对Pb2+、Zn2+、Cr6+、Mn2+的耐受浓度均别达到2000mg/L以上。因此，该菌在重金属污染的矿区土壤的生物修复中具有广阔的应用潜力。 

图1是草酸青霉菌TJ2菌株在摇瓶中培养时解磷能力和pH值随动态变化图。 

根据下面实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，但不作为对本发明实施范围的限定。 

实施例1：解磷草酸青霉菌的筛选和鉴定 

本实施方式的草酸青霉菌株从湖南省湘西州花垣县的铅锌矿表层土壤中分离筛选出来的。筛选按以下步骤进行：将采集的土壤立即带回实验室，风干、研碎、过筛，取其中10.0g过筛后的土壤放于带有玻璃珠的100ml无菌水中，制成土壤悬液，此悬液浓度为10-1，。将此悬液放于恒温振荡器上以150转/min充分震荡30min，取出后稍微静置，从该样品菌悬液中取10ml加入到90ml的无菌水中，制成菌悬液的浓度为10-2，再以此方法进行10倍梯度稀释，直至稀释液的浓度为10-4为止。取10-4浓度的菌悬液0.2ml，放在选择性的改良Pikovskaya培养基平板上（培养基组成（g/L）：(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，酵母粉0.5g，葡萄糖10.0g，Ca3(PO4) 225g，琼脂15g，pH7.0的蒸馏水l000ml），置于28℃培养箱中培养5d，挑取解磷范围较大的菌落作进一步筛选及菌株纯化。得到的解磷菌经形态学、培养特征以及18SrDNA的ITS序列测序分析，鉴定该菌株为草酸青霉，命名为草酸青霉（Penicillium oxalicum），该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 7699。

实施例2：解磷草酸青霉菌对难溶性磷酸盐的解磷性试验 

选择五种难溶性磷酸盐，配成如下培养基

解磷培养基1：葡萄糖 10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，酵母粉0.5g，Ca3(PO4) 2 10g，蒸馏水l000ml，pH7.0。

解磷培养基2：用磷酸氢镁（MgHPO4）代替解磷培养基1中的Ca3(PO4) 2，其它成分和含量不变。 

解磷培养基3：用磷酸锌（Zn3(PO4)2代替解磷培养基1中的Ca3(PO4) 2，其它成分和含量不变。 

解磷培养基4：用磷酸铝（AlPO4）代替解磷培养基1中的Ca3(PO4) 2，其它成分和含量不变。 

解磷培养基5：用磷酸铁（FePO4）代替解磷培养基1中的Ca3(PO4) 2，其它成分和含量不变。 

将上述菌株接种到PDA平板上，培养5d后，用无菌水配制孢子悬液，通过血球板计数法确定孢子悬液浓度为1.6×107个孢子/mL，按1mL/瓶接种量分别接种到装有50mL解磷培养基1、2、3、4和5的100mL三角瓶中，以加入相同体积的解磷培养基不接种为对照（CK），每个处理三瓶重复。置于28℃摇床中，150rpm振荡培养培养，培养一周后，发酵液于4℃,10000r/min离心10min，用钼锑抗比法测定发酵液中可溶性磷含量，结果见表1所示。 

其中，解磷率（%）=（接种处理中可溶性磷含量-对照中可溶性磷含量）/培养基中加入的磷含量×100。 

表1 草酸青霉菌对五种难溶性磷酸盐的溶解能力 

 由表1可以得出，分别以难溶性磷酸盐磷酸钙（Ca3(PO4) 2）、磷酸氢镁（MgHPO4）、磷酸锌（Zn3(PO4)2、磷酸铝（AlPO4）和磷酸铁（FePO4）为唯一磷源，培养7d后，该菌株发酵液中可溶性磷含量均高于对照，但不同处理间存在一定差异。其中，该菌株对难溶性磷酸盐磷酸钙（Ca3(PO4) 2）、磷酸氢镁（MgHPO4）和磷酸铝（AlPO4）的解磷能力很强，均达到95%以上，对磷酸铁（FePO4）有一定的解磷性，但对磷酸锌（Zn3(PO4)2的解磷能力较弱。

实施例3：草酸青霉菌解磷性的动态变化 

将上述菌株接种到PDA平板上，培养5d后，用无菌水配制孢子悬液，通过血球板计数法确定孢子悬液浓度为1.6×107个孢子/mL，按1mL/瓶接种量接种到50ml改良蒙金娜液体培养基中，同时以不接菌的设为空白对照组，每一瓶空白组中加入1ml无菌水，每个处理三瓶重复。置于28℃摇床中，150rpm振荡培养，每隔24小时检测上清液中的可溶性磷的含量和培养基的pH值，连续测定14d。结果见图1所示。

由图1可见，上述菌株解磷能力经过14d的测定，除刚接种的第一天外，其他2-14d内均呈现出很高的解磷能力。其中，在接种上述菌株第7天时，解磷量达最高，其他时间期内也均表现很高的解磷能力，各时间段内的解磷量均超过1500mg/L。从pH值的变化来看，接种后的第2天pH快速下降，到第4天达到最低值，之后缓慢上升，但在接种后2-14天中，培养基内pH值始终低于4.0。 

实施例4：重金属对草酸青霉解磷性作用 

分别配制含有铅、锌、锰和铬四种不同浓度重金属的改良蒙金娜液体培养基，重金属浓度从100mg/L起，依次为100mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L，以不加重金属的处理作为对照。

将上述菌株接种到PDA平板上，培养5d后，用无菌水配制孢子悬液，通过血球板计数法确定孢子悬液浓度为1.6×107个孢子/mL，按1mL/瓶接种量分别接种于含有不同种类、不同浓度重金属的液体培养基中，每个处理接种1mL。置于28℃摇床、150r/min振荡培养10天，测定该菌在含有各种类、不同浓度重金属的液体培养基中可溶性磷含量的变化，结果见表2。 

表2 草酸青霉菌在不同重金属浓度下的解磷性测定 

注：解磷量单位：mg/L

由表2可以得出，在含有重金属铅、锌、锰、铬的液体培养基中，随着重金属浓度的升高，该菌株的解磷量呈逐渐降低的趋势。其中，该菌株对重金属锌的抗性表现最强，在含有2000mg/L重金属锌的培养基中，该菌株的解磷量仍达到1953.7mg/L（对应于未加重金属的对照的解磷量为2068.2mg/L），解磷量达到对照的94.46%。在含有重金属铅、锰和铬的液体培养基中，当各重金属含量为2000mg/L时，它们的解磷量分别达到593.6mg/L、424.6mg/L和107.3mg/L，分别为对照解磷量的28.70%、15.83%和5.19%。观察在含有各浓度重金属的液体培养基中该菌株生长量发现，该菌在各处理培养基中均能非常好的生长，即使在含有2000mg/L重金属的培养基中菌体生长量与对照相比，仍然没有太大差别。由此也可以说明，上述菌株对重金属铅、锌、锰和铬的抗性均很强，在解磷量上该菌对重金属锌的抗性最强。