一种肾阳虚的中药组合物的检测方法

一种肾阳虚的中药组合物的检测方法

本发明为分案申请，原案申请号为200710063453.9，原案申请日为2007年 2月1日，原案名称为：一种肾阳虚的中药组合物及其制备方法和质量控制 方法。

技术领域

本发明涉及一种中药组合物的检测方法，特别是涉及一种肾阳虚的中 药组合物的检测方法。

背景技术

肾藏精，肾虚以肾精不足为主要症状。一般症状有精神疲乏、头昏、耳鸣、 健忘、腰、遗精、阳痿等，临床表现可偏于肾阴虚，或肾阳虚。亏的意思是 不足，以肾来说可以是功能作用的不足，就是肾阳虚。如果是基础物质的不足 就是肾阴虚。一般来说，功能作用的不足，也会导致基础物质的减少，阴阳两 者可以互相转化。肾功能的减退，男女皆有，并不独厚于男性，只是男性受到 以讹传讹的错误观念，或是与身俱来的自然压力，所导致的肾亏症多一些。

对于肾虚本来就是一种中医学的概念，祖国医学对于肾虚有好多好多 方法，和有效的药物，方剂也好一些成药也好，都非常有效。一般说肾阴虚治 疗法则是滋阴补肾。而肾阳虚，当然就是补肾助阳，通过补充肾阴的方法，让 肾精充足之后，它的偏盛偏衰就能够得以纠正了。肾阳虚补充肾气的一些药物， 来调整。我们临床上一些常用的方剂右龟丸、右龟引是肾阳虚的。在 时一定要注意，补肾阳必须补肾阴，这是中医肾虚的法则。

发明内容

本发明目的在于提供一种肾阳虚的中药组合物；

本发明目的还在于提供一种肾阳虚的中药组合物制备方法；

本发明目的还在于提供一种肾阳虚的中药组合物的质量控制方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明目的所述的一种肾阳虚的中药组合物可由如下技术方案实现：

本发明所述的肾阳虚的中药组合物可由如下重量比的原料药制成的：

本发明所述的肾阳虚的中药组合物优选如下重量比的原料药制成的：

本发明所述的肾阳虚的中药组合物优选如下重量比的原料药制成的：

本发明所述的肾阳虚的中药组合物优选如下重量比的原料药制成的：

本发明所述的中药组合物胶囊制剂的制备方法为：

选取原料药：

除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将人参、紫河车、冬虫夏草粉碎成细粉，其 余六味，加9-11倍量水煎煮2-3次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩 至相对密度为1.20-1.25(55-65℃)的清膏，减压干燥成干浸膏，粉碎成细粉， 与上述蜂花粉、蜂王浆冻干粉及红参等细粉混匀过筛，装入胶囊，即得。

本发明所述的中药组合物胶囊制剂的制备方法为：

选取原料药：

除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎成细粉，其余 黄芪等七味，加9-11倍量水煎煮2-3次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液 浓缩至相对密度为1.20-1.25(55-65℃)的清膏，减压干燥成干浸膏，粉碎成细 粉，与上述蜂花粉、蜂王浆冻干粉及红参等细粉混匀过筛，装入胶囊，即得。

本发明所述的中药组合物胶囊制剂的制备方法优选为：

选取原料药：

除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎成细粉，其余 黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至 相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，减压干燥成干浸膏，粉碎成细粉，与上 述蜂花粉、蜂王浆冻干粉及红参等细粉混匀过筛，装入胶囊，即得。

本发明药物组合物质量控制方法包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一 种或几种：

鉴别：

(1)取人参皂苷Rb、Re、Rg及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg 的混合溶液，作为对照品溶液；供试品溶液制备：取本发明组合物胶囊剂装量 差异项下的内容物，混匀，取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲 醇50ml，密塞，称定重量，置水浴上加热回流提取1-3小时，取出，放冷，再 称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发 皿中，蒸干，残渣加水25ml使溶液解，并移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取1-3 次，每次15ml，弃去氯仿液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3-5次，每次20ml， 合并正丁醇液，加氨试液30ml洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残 渣加甲醇量使溶解；并定量转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔 滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得；

照薄层谱法试验，吸取供试品溶液10μl、上述对照品溶液5μl，分别点 于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(11-15∶6-9∶1-3)10℃以下放置的 下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以9-11％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑 点显清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视；供试品谱中，在与对 照品谱相应的位置上，显示相同颜的斑点或荧光斑点；

(2)取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备，取本发明组合物胶囊剂装量差异项下的内容物，混匀， 取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量， 置水浴上加热回流提取1-2小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的 重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水25ml 使溶液解，并移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取2-3次，每次15ml，弃去氯仿 液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3-5次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨 试液30ml洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇量使溶解； 并定量转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过， 取续滤液，即得；照薄层谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照品溶液各5μ l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(9-11∶1-2∶1-2∶ 1-2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105□C加热数分钟， 置紫外光灯(365nm)下检视；供试品谱中，在与对照品谱相应的位置上， 显相同颜的荧光斑点；

(3)取本发明组合物胶囊剂内容物5g，加甲醇50m；，置水浴上加热回流1-2 小时，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶液，用氯仿振摇提取 2-3次，每次15ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品 溶液；另取枸杞子对照药材1g，加水煎煮10-20分钟，滤过，滤液同法制成对照 药材溶液，照薄层谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿一醋酸乙酯一甲醇(3-5∶2-4∶0.2-0.5)为展开剂，展开， 取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品谱中，在与对照药材谱 相应的位置上，显相同颜的荧光斑点。

含量测定：

照高效液相谱法测定，谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合 硅胶为填充剂；乙腈-水(27-31∶69-74)为流动相；检测波长为203nm；柱温 38-42□C。理论板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于2500。

对照品溶液的制备，精密称取人参皂苷Rb₁对照品7.5mg，置25ml量瓶中， 加甲醇使溶液，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含人参皂苷Rb₁0.3mg)。

供试品溶液的制备，取本发明组合物胶囊剂装量差异项下的内容物，混匀， 取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量， 置水浴上加热回流提取1-2小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的 重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水25ml 使溶液解，并移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取2-3次，每次15ml，弃去氯仿 液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3-5次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨 试液30ml洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇量使溶解。 并定量转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过， 取续滤液，即得。

测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱议， 测定，即得。本发明组合物胶囊剂每粒含人参皂苷Rb₁(C₅₄H₉₂O₂₃)，不得少于0.40mg。

本发明药物组合物质量控制方法优选如下鉴别方法和/或含量测定中的一 种或几种：

鉴别：

A、取人参皂苷Rb、Re、Rg及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg 的混合溶液，作为对照品溶液；供试品溶液制备：取本发明组合物胶囊剂装量 差异项下的内容物，混匀，取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲 醇50ml，密塞，称定重量，置水浴上加热回流提取1.5小时，取出，放冷，再 称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发 皿中，蒸干，残渣加水25ml使溶液解，并移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取2 次，每次15ml，弃去氯仿液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml， 合并正丁醇液，加氨试液30ml洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残 渣加甲醇量使溶解；并定量转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔 滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得；

照薄层谱法试验，吸取供试品溶液10μl、上述对照品溶液5μl，分别点于 同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置的下层溶液为 展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显清晰， 分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视；供试品谱中，在与对照品谱相应 的位置上，显示相同颜的斑点或荧光斑点；

B、取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备，取本发明组合物胶囊剂装量差异项下的内容物，混匀， 取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量， 置水浴上加热回流提取1.5小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的 重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水25ml 使溶液解，并移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取2次，每次15ml，弃去氯仿液， 水液用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨试液30ml 洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇量使溶解；并定量转 移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤 液，即得；照薄层谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照品溶液各5μl，分 别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开 剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105□C加热数分钟，置紫外光 灯(365nm)下检视；供试品谱中，在与对照品谱相应的位置上，显相同颜 的荧光斑点；

C、取本发明组合物胶囊剂内容物5g，加甲醇50m；，置水浴上加热回流1小时， 取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶液，用氯仿振摇提取2次，每 次15ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取 枸杞子对照药材1g，加水煎煮15分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液，照 薄层谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上， 以氯仿一醋酸乙酯一甲醇(4∶2∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外 光灯(365nm)下检视；供试品谱中，在与对照药材谱相应的位置上，显相 同颜的荧光斑点；

含量测定：

照高效液相谱法测定，谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合 硅胶为填充剂；乙腈-水(29∶71)为流动相；检测波长为203nm；柱温40□C； 理论板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于2500；

对照品溶液的制备，精密称取人参皂苷Rb₁对照品7.5mg，置25ml量瓶中， 加甲醇使溶液，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含人参皂苷Rb₁0.3mg)；

供试品溶液的制备，取本发明组合物胶囊剂装量差异项下的内容物，混匀， 取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量， 置水浴上加热回流提取1.5小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的 重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水25ml 使溶液解，并移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取2次，每次15ml，弃去氯仿液， 水液用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨试液30ml 洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇量使溶解；并定量转 移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤 液，即得；

测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱议， 测定，即得；本发明组合物胶囊剂每粒含人参皂苷Rb₁(C₅₄H₉₂O₂₃)，不得少于0.40mg。

本发明组合物具有很好的药效，具有益气填精，补肾助阳，作用，对气虚 精亏，肾阳不足引起的神疲乏力，失眠头晕，，腰膝酸软，畏寒肢冷，食欲不振， 心悸气短等症有很好的效果。相比现有制剂也表现出出众的药效，并且本发明 所述的范围在可以实现本发明的药理效果同时，经过筛选，意外的发现，在组 合物的某些范围内，有着更为突出的药效。

本发明所提供的中药组合物的质量控制方法，是通过大量具体创造性试验 筛选后得到，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴 别专属性很好，而且方法经济适用、结果快速，并且对不同的薄层板都能应用。 含量测定方法中通过对样品、供试品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得含 量测定方法可以很有效的对产品进行质量控制，并且用该方法测定的产品要相 比其他方法测定的产品在药理效果上表现的更为稳定。

具体实施方式

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1

实验药物为实施例2制剂，与现有类似作用的中成药右归丸相比较，按照下 述实验方法，在神疲乏力，失眠头晕，腰膝酸软，畏寒肢冷，食欲不振，心悸气 短等症方面都有更好的效果。

实验例2

组方I：

组方II：

对照组：

按照药物组I、药物组II与对照组的处方比例称取原料药材，按照上述实 施例1工艺制备，比较阳痿作用，结果见下表。

本发明药物对去势大鼠生殖器官重量的影响

注：*药物组I、II与对照组相比P＜0.05。

结果表明：对照药物组合物胶囊剂对去势大鼠生殖器官重量的影响与药物 组I、II胶囊剂有显著差异(P＜0.05)，药物组I、II对去势大鼠生殖器官重量 的影响明显高于对照药物胶囊药物组。

实验例3 镇静安神作用

取昆明种小鼠20只，体重18-22g，雌雄兼用，随机分为2组，每组10只。 生理盐水对照组(对照组)：予生理盐水0.2ml/10g灌胃，每日1次，共3天。 解郁安神颗粒组(本发明药物)：取制备好的本发明药物样品液0.2ml/10g灌胃 (相当于人用量的9倍)，每日1次，其3天。各组最末次灌胃后1h，将小鼠放 入自发活动仪中适应3分钟后，开始测定自发活动次数及睡眠超过2小时的睡 眠时间。结果见下表：

对小鼠自发活动次数及睡眠时间的影响

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

结果表明：本发明药物高、中、低剂量组均具有镇静安神作用，随着剂量 的加大镇静安神作用增强。

实验例4 促进胃功能作用

1、对大鼠胃液分泌功能的影响

大鼠40只，随机等分为4组，甲、乙、丙组分别灌胃本发明药物1.5、3.0、 4.0g/kg，丁组灌胃同体积生理盐水，连续给药7天，末次给药后禁食24小时 (不禁水)，乙醚麻醉，打开腹腔，结扎幽门，经十二指肠注入上述各种药物 1.8ml(0.9g)，然后缝合腹腔，绝食绝水5小时。5小时后再用乙醚麻醉，打开腹 腔，结扎贲门，取下胃，分别以二层布过滤胃液，至刻度试管中，用3000r/min 离心15min，记录上清液量即胃液，分别用酸度计测容法、麦特毛细管试验法， 测定游离酸度、总酸度结果见下表：

对大鼠胃液分泌功能的影响

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

结果表明：本发明药物高、中、低剂能促进在鼠胃液分泌、提高游离酸度 和总酸度排出量，及对胃蛋白酶活性增强，其作用随着剂量的加大而加强。

2、对大鼠胃液分泌功能的影响

大鼠40只，随机等分为4组，分别灌胃本发明药物混悬液低、中、高剂量 组1.5、3.0、4.0g/kg，空白对照组灌胃同体积生理盐水，连续给药7天，末次 给药后禁食24小时(不禁水)，分别灌胃上述药品用生理水配成含碳末和阿拉 伯胶各10％的混悬液0.2ml/10g体重，15分钟后用颈椎脱臼法将小鼠处死，立 即剖按文献方法操作，计算小肠推进率，结果见表：

注：与对照组比较，*P＜0.01

结果表明：本品可促进小鼠小肠的运动，与生理盐水对照组比较有显著性 差异P＜0.01，

3、对醋酸型胃溃疡的影响

大鼠40只，随机等分为4组，方法及剂量同上一组，然后禁食24小时， 不禁水，在乙醚麻醉下，按无菌操作剖开腹引胃，用直径5mm的泸纸片2片浸 渍冰醋酸后，帖在胃大弯两侧浆膜处30Second，迅速移开泸纸片，并用脱脂棉球 擦干，整复胃体，缝合腹壁。术后次日开始进食并灌胃给药，分组、给药量、 经药同实验1，末次给药后禁食24小时，脱臼处死，立即剖腹取胃并用1％福 尔马林固定，记录胃内病变情况，以溃疡长度总和mm作为溃疡指数，进行统计 学处理，结果见表：

对醋酸型胃溃疡的影响

注：与对照组比较，***P＜0.001

结果表明：本发明药物对大鼠醋酸型胃溃疡有明显的抑制作用，与生理盐水 对照组比较有非常显著性差异P＜0.001。

实验例5 心悸作用

对小鼠断颅喘息时间的影响：取体重18-22g小鼠80只，随机分为4组， 每组20只，雌雄各10只。实验前动物禁食16h。各组动物分别给予本发明药物 高、中、低剂，空白对照组等量生理盐水。药后1h小鼠颈部断颅，同时以秒表 纪录小鼠张嘴喘息时间。结果见下表

心脑康胶囊对小鼠断颅喘息时间的影响

注：与空白对照组比较，***p＜0.01

结果表明：本发明药物可明显延长小鼠的喘息时间。

实验例6 阳痿

1、对去势大白鼠生殖器官的影响

取离乳1个月的Wistar雄性大鼠60只，体重90-110g，在钠(0.6％， 7.5ml/kg)麻醉下，阴囊皮肤消毒，摘除双侧睾丸。术后肌肉注衬青霉素G(2万 单位/kg)连续3天。去势手术3天后将50只去势大鼠随机分为5组：

去势模型组 蒸馏水灌胃(1ml/100g)。

丙酸皋丸素组 皮下注射给药(0.2mg/只)。

本发明药物大剂量组 用前(4g/kg)以蒸馏水配制成1ml/100g浓度灌胃。

本发明药物中剂量组 用前(2g/kg)以蒸馏水配制成1ml/100g浓度灌胃。

本发明药物小剂量组 用前((1g/kg)以蒸馏水配制成1ml/100g浓度灌胃。

以上6组均每日给药1次，连续20天。此外，同期另设一组为正常对照组， 将10只未去势大鼠同期饲养，蒸馏水(1ml/100g)灌胃，观察。

给药后第21天，将动物处死，迅速摘取包皮腺、精液囊、提肛肌及前列腺 并称重量，计算脏器指数，进行组间t检验。

本发明药物对去势大鼠生殖器官重量的影响(x±s)

注：与去势模型组比较**p＜0.01

本发明药物的同化激素活性作用

组别 动物数(n) 提肛肌/前列腺

正常对照组 10 0.25±0.11

去势模型组 10 0.39±0.11**

丙酸睾丸素组 10 0.22±0.13

本发明药物大剂量组 10 0.80±0.10**

本发明药物中剂量组 10 0.67±0.20**

本发明药物小剂量组 10 0.60±0.22**

注：与正常对照组比较**p＜0.01

2、对去势大白鼠阴茎勃起功能的影响

取离乳1个月的Wistar雄性大鼠60只，体重90-110g，在钠(0. 6％，7.5ml/kg)麻醉下，阴囊皮肤消毒，摘除双侧皋丸。术后肌肉注衬青霉素G(2 万单位/kg)连续3天。去势手术3天后将50只去势大鼠随机分为5组：

去势模型组 蒸馏水灌胃(1ml/100g)，

丙酸皋丸素组 皮下注射给药(0.2mg/只)。

本发明药物大剂量组 用前(4g/kg)以蒸馏水配制成1ml/100g浓度灌胃。

本发明药物中剂量组 用前(2g/kg)以蒸馏水配制成1ml/100g浓度灌胃。

本发明药物小剂量组 用前((1g/kg)以蒸馏水配制成1ml/100g浓度灌胃。

以上6组均每日给药1次，连续20天。此外，同期另设一组为正常对照组， 将10只未去势大鼠同期饲养，蒸馏水(1ml/100g)灌胃，观察。

在给药后第21天，将电刺激血栓形成仪的刺激电极放置于大鼠阴茎部位，给予 电刺激(电流强度为4mA)。记录从刺激开始至阴茎勃起时间(勃起潜伏期)，结果 进行组间t检验。

对去势大白鼠阴茎勃起功能的影响(x±s)

组别 动物数(n) 阴茎勃起潜伏期(s)

正常对照组 10 14.53±3.10**

去势模型组 10 65.01±15.91

丙酸睾丸素组 10 21.03±6.41**

本发明药物大剂量组 10 26.51±6.52**

本发明药物中剂量组 10 28.23±6.94**

本发明药物小剂量组 10 32.00±8.99**

注：与去势模型组比较**P＜0.01

结果看出，本发明药物能提高去势大鼠阴茎对外部刺激的兴奋性，在局部 电刺激下，各组动物阴茎勃起时间明显短于去势模型组，有显著性差异。

3、对雄性小白鼠交配能力的影响

动物雄性昆明种小白鼠50只，体重20g-22g，随机分为5组，每组10只。

正常对照组 蒸馏水灌胃(20ml/kg)

丙酸皋丸素组 皮下注射给药(0.025mg/只)。

本发明药物大剂量组 用前(5g/kg)以蒸馏水配制成2ml/100g浓度灌胃。

本发明药物中剂量组 用前(2.5g/kg)以蒸馏水配制成2ml/100g浓度灌胃。

本发明药物小剂量组 用前((1.25g/kg)以蒸馏水配制成2ml/100g浓度灌胃。

以上各组，每日灌胃1次(丙酸辜丸素组为皮下注射给药)，连续10天，第 5天开始每只雄鼠与5只雌鼠同笼喂养，第6天给每只雌鼠皮下注射苯甲酸雌二 醇(200ug/kg)。同笼后次日开始每天上午检查各组雌鼠阴道口或阴道内有无白 物出现，有白物者为出现阴栓，将其从笼中取出；计算阴栓出现率。进行 x²四格表检验组间比较，结果见下表

本发明药物对雄性小鼠交配能力的影响

组别 动物数(n) 出现阴栓的鼠数(n) 阴栓出现率(％)

正常对照组 50 11 22

丙酸睾丸素组 50 30 60**

本发明药物大剂量组 50 36 75.2**

本发明药物中剂量组 50 30 60**

本发明药物小剂量组 50 25 50**

注：与正常对照组比较**p＜0.01

结果可见，本发明药物大、中、小剂量组和阳性对照组(丙酸皋丸素组和与 正常对照组比较均明显地增强小鼠交配能力。

通过以上实验发现，本发明药物能提高去势雄性大鼠阴茎对外部刺激的 兴奋性，缩短其阴茎勃起潜伏期及增强雄性小鼠交配能力，提示该药能增强阴 茎勃起功能和提高性交能力。实验中还观察到，本发明药物对动物附属生殖腺 的影响有其特殊性，即虽促使包皮腺、精液囊、提肛肌的细胞增殖而使其湿重 增加，但不使前列腺湿重增加，表明该药不仅有类雄性激素样作用，而且有同 化激素活性作用，提示中老年阳痿患者服用此药不会导致或

促使前列腺增生。同时本发明药物对去势动物生殖器官重量、阴茎勃起功能以 及正常动物性功能的影响，均存在着一定的量效关系，随着剂量的加大，效果 亦随之增强。

实验例7 鉴别筛选实验

1、显微鉴别

本发明药物制剂中红参、鹿茸和冬虫夏草等几味贵重药材为直接粉碎入药， 这样不仅减少了药物的损失，还能有效保证药物疗效，所以加入了显微鉴别：

具体鉴别方法：取本发明药物制剂，研细，置显微镜下观察；草酸钙簇晶 直径20-68μm，棱角锐尖。未骨化的骨组织淡灰或近无，边缘及表面均不 整齐，具有不规则的块状突起物，其间隐约可见条状纹理，菌丝细长，无， 不分枝或分枝，密集交叉成团或断裂成节。

其中红参显微特点：草酸钙簇晶直径20～68μm，棱角锐尖。

鹿茸显微特点；未骨化的骨组织淡灰或近无，边缘及表面均不整齐，具有 不规则的块状突起物，其间隐约可见条状纹理。

冬虫夏草显微特点：菌丝细长，无，不分枝或分枝，密集交叉成团或断裂成 节。

我们取本发明药物不同制剂，分别进行显微鉴别，证明该鉴别方法稳定， 适用于本工艺制备方法下的所有制剂的薄层鉴别。

2、人参、黄芪的薄层鉴别方法：

1)供试品溶液的制备

供试品溶液的制备方法，根据所鉴别药物的具体有效成份确定，本发明药 物中对红参、黄芪的鉴别主要是其中人参皂苷Rb、Re、Rg及黄芪甲苷的鉴别。 采用正交试验以确定有效的分离提取方法。

我们以选取的溶剂种类、提取时间、提取次数为水平因素，取本发明药物 制剂，按照因素水平表安排试验，以人参皂苷Rb₁的含量为考察指标，具体结果 如下：

优选因素水平表

表4.因素筛选正交试验数据表

方差分析表

从上表R值分析可以看出，影响因素主次为A＞B＞C，直观分析最佳提取工 艺为A₁B₂C₂，从方差分析表可以看出因素A具有显著性，而因素B、C对结果无 显著性影响，从节约时间考虑，选取所以选取A₁B₂C₁为最佳提取方案。取本发明 药物制剂内容物，约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml， 密塞，称定重量，置水浴上加热回流提取1.5小时，即可。

2)提取完成后，为了使干扰减少到最小，根据各鉴别成份的性质，将甲醇提取 物用氯仿、正丁醇和氨试液进行了进一步的分离萃取，具体方法如下：取甲醇 提取物25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水25ml使溶液解，并移至分液漏斗 中，加氯仿振摇提取2次，每次15ml，弃去氯仿液，水液用水饱和的正丁醇振 摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨试液30ml洗涤，弃去洗涤液，正 丁醇液置于水浴上蒸干，即可。

通过测定最后所得供试品溶液中人参皂苷Rb₁的含量，对该分离方法进行验证， 结果如下：

从上表可以看出，供试品溶液用该方法分离前后人参皂苷Rb₁的含量没有 变化，说明该分离方法用于有效成分分离效果好，适合试验要求。

2)上述鉴别方法(2)中展开剂配比的优选：吸取按上述方法制备的供试品溶液 10μl，人参皂苷Rb、Re、Rg及黄芪甲苷的对照品溶液5μl，分别点于同一硅 胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水配比为(7∶7∶2)、(10∶7∶2)、(13∶7∶2)、 (15∶7∶2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％ 硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检 视。观察各薄层板上供试品展开的效果，结果见下表：

展开剂配比 7∶7∶2 10∶7∶2 13∶7∶2 15∶5∶2

展开效果 较差 差 好 差

从上表可以看出展开剂配比为13∶7∶2时，供试品溶液展开效果最好， 没有出现拖尾、斑点分离不好等现象。

3)上述鉴别方法(2)中样品溶液点样量的优选，取供试品溶液1μl、5 μl、8μl、10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯 仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出， 晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显清晰，分别置日光及紫外光 灯(365nm)下检视。，观察薄层板上供试品主斑点显的效果，结果见下表：

从上表可以看出供试品点样量在10μl时，在薄层板上显效果好，适 合试验要求。

4)阴性对照试验

取缺红参、黄芪的阴性样品，照上述鉴别方法(2)中供试品溶液制备方法 制备阴性对照溶液，展开后在对照品溶液对应位置上没有出现相应斑点，说 明所选取的鉴别实验专属性强。

3、淫羊藿的薄层鉴别方法：

1)供试品溶液的制备：鉴别方法2中的供试品的制备方法，可以比较有效 的将本发明药物制剂中所含有效成份淫羊藿苷分离出来，进行薄层鉴别，这 里就不再对其进行论述了。

2)展开剂的选择：

分别以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)和醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1) 为展开剂，吸取鉴别2中供试品溶液及淫羊藿苷对照品溶液各5μl，分别点于 同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105□C加热 数分钟，置紫外光灯(365nm)下检视，比较不同展开剂下，供试品展开的效果。 结果见下表：

从上表可以看出，选择醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂， 展开效果好，无杂质干扰，显清晰。

3)上述鉴别方法3中样品溶液点样量的优选，取供试品溶液1μl、2μl、3 μl、5μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯- 丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝 试液，在105□C加热数分钟，置紫外光灯(365nm)下检视，观察薄层板上 供试品主斑点显的效果，结果见下表：

从上表可以看出供试品点样量在5μl时，在薄层板上显效果好，适合 试验要求。

4)阴性对照试验

取缺淫羊藿的阴性样品，照上述鉴别方法2中供试品溶液制备方法制备阴 性对照溶液，展开后在对照品溶液对应位置上没有出现相应斑点，说明所选 取的鉴别实验专属性强。

4、枸杞子的薄层鉴别方法：

1)不同供试品溶液制备方法的选择：

方法一：取本发明药物制剂5g，加甲醇50m；，置水浴上加热回流1小时，取出， 放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶液，用氯仿振摇提取2次，每次15ml， 合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

方法二：取本发明药物制剂1g，加水70ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过， 滤液用醋酸乙酯15ml振摇提取，提取液浓缩至约2ml，作为供试品溶液。

吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿一醋酸 乙酯一甲醇(4∶2∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm) 下检视。比较两种提取方法制备的供试品溶液的显效果，结果见下表：

提取方法 方法一 方法二

显效果 显效果好 显不清晰，有干扰。

从上表可以看出，采用方法一供试品溶液的的显效果好，符合试验要求。

2)上述鉴别方法4中展开剂配比的优选：吸取按上述方法一制备的供试品溶液5 μl，枸杞子的对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿一醋酸 乙酯一甲醇配比为(2∶2∶0.3)(3∶2∶0.3)(4∶2∶0.3)(4∶3∶0.3)为展开 剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。观察各薄层板上供试品展 开的效果，结果见下表：

从上表可以看出展开剂配比为4∶2∶0.3时，供试品溶液展开效果最好， 没有出现拖尾、斑点分离不好等现象。

3)上述鉴别方法4中样品溶液点样量的优选，取供试品溶液1μl、2μl、3 μl、5μl，对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿一醋 酸乙酯一甲醇配比为(2∶2∶0.3)(3∶2∶0.3)(4∶2∶0.3)(4∶3∶0.3) 为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，观察薄层板上 供试品主斑点显的效果，结果见下表：

从上表可以看出供试品点样量在5μl时，在薄层板上显效果好，适合试验要求。

4)阴性对照试验

取缺枸杞子的阴性样品，照上述供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液， 展开后在对照药材溶液对应位置上没有出现相应斑点，说明所选取的鉴别实 验专属性强。

实验例8 含量测定筛选实验

采用高效液相法测定本发明药物制剂中人参皂苷Rb₁的含量，使本发明药物 质量检测手段更完备。制备供试品溶液仍采用鉴别方法2中供试品溶液的制备 方法制备。

1、流动相的选择：分别以乙腈-水(29∶71)和乙腈-0.05％磷酸溶液(99∶400) 为流动相，进行供试品溶夜的含量测定，通过比较高效液相普图中，各峰的 分离效果，来确定优选的流动相，结果如下：

从上表可以看出，乙腈∶水(29∶71)为流动相各峰分离效果好。

2、流动相配比的优选：

分别以乙腈∶水配比为(14∶80)、(15∶85)、(29∶71)、(16∶85)为流动相，进 行供试品溶夜的含量测定，通过比较高效液相普图中，各峰的分离效果，来 确定优选的流动相，结果如下：

流动相配比 15∶60 29∶71 40∶80 46∶90

谱图中各峰分离效果 有干扰 分离效果好 有干扰 有干扰

从上表可以看出，流动相配比选择29∶71为好。

3、含量测定方法的方法学考察

对本发明药物所采用的含量检测方法，从线性关系、稳定性、精密度、重现 性、回收率等方面进行了相关方法学考察，具体结果如下：

(1)线性关系考察 精密吸取对照品溶液(0.6952mg/ml)0.5、1、2、3、4ml， 分别置5ml量瓶中，各加甲醇稀释至刻度，摇匀分别精密吸取20μl，注入液相 谱仪，测定峰面积，结果见下表，并绘制标准曲线，表明人参皂苷Rb₁在 1.3904ug-11.1232ug间呈线性关系，其回归方程为：

Area＝100044.64*Amt+7466.13(r＝0.9999)

(2)稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μl，分别于配制后0、2、4、8、 24小时，依法测定，结果表明，其在24小时内基本稳定，结果见下表

(3)精密度试验 精密吸取供试品溶液10μl，重复进样5次，求得相对标准 偏差＜2％，结果见下表

(4)重现性试验 取同一样品5份，分别进行测定，求得相对标准偏差＜2％， 结果见下表

(5)回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品1.0g再分别精密加入人参 皂苷Rb₁对照品溶液10ml，精密加入甲醇40ml，，按以上供试品溶液的制备方法 操作，测定其含量，并计算其回收率，测定结果见下表：

从以上试验结果可以看出，本发明药物所采用的含量测定方法其线性关系、 稳定性、精密度、重现性等均良好，能够有效控制本发明药物质量。

下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果

实施例1

除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎成细粉，其余 黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至 相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，减压干燥成干浸膏，粉碎成细粉，与上 述蜂花粉、蜂王浆冻干粉及红参等细粉混匀过筛，装入胶囊，制成1000粒，即 得。

鉴别：

(1)取本品，置显微镜下观察；草酸钙簇晶直径20-68μm，棱角锐尖。未 骨化的骨组织淡灰或近无，边缘及表面均不整齐，具有不规则的块状突起 物，其间隐约可见条状纹理，菌丝细长，无，不分枝或分枝，密集交叉成团 或断裂成节。

(2)取人参皂苷Rb、Re、Rg及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg 的混合溶液，作为对照品溶液。供试品溶液制备：取本品装量差异项下的内容 物，混匀，取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞， 称定重量，置水浴上加热回流提取1.5小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇 补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣 加水25ml使溶液解，并移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取2次，每次15ml，弃 去氯仿液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液， 加氨试液30ml洗涤，弃去洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇量使溶 解。并定量转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm) 滤过，取续滤液，即得。

照薄层谱法试验，吸取供试品溶液10μl、上述对照品溶液5μl，分别点于 同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置的下层溶液为 展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显清晰， 分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品谱中，在与对照品谱相应 的位置上，显示相同颜的斑点或荧光斑点。

(3)取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备，取本品装量差异项下的内容物，混匀，取约1.5g，精密 称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，置水浴上加热 回流提取1.5小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀， 滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水25ml使溶液解，并 移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取2次，每次15ml，弃去氯仿液，水液用水饱 和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨试液30ml洗涤，弃去 洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇量使溶解。并定量转移至5ml量 瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。 照薄层谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照品溶液各5μl，分别点于同一 硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开， 取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105□C加热数分钟，置紫外光灯(365nm) 下检视。供试品谱中，在与对照品谱相应的位置上，显相同颜的荧光斑 点。

(4)取本品内容物5g，加甲醇50m；，置水浴上加热回流1小时，取出，放冷， 滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶液，用氯仿振摇提取2次，每次15ml，合 并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取枸杞子对照 药材1g，加水煎煮15分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液，照薄层谱法试 验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿一醋酸乙 酯一甲醇(4∶2∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm) 下检视。供试品谱中，在与对照药材谱相应的位置上，显相同颜的荧光 斑点。

含量测定：

照高效液相谱法测定，谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合 硅胶为填充剂；乙腈-水(29∶71)为流动相；检测波长为203nm；柱温40□C。 理论板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于2500。

对照品溶液的制备，精密称取人参皂苷Rb₁对照品7.5mg，置25ml量瓶中， 加甲醇使溶液，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含人参皂苷Rb₁0.3mg)。

供试品溶液的制备，取本品装量差异项下的内容物，混匀，取约1.5g，精密 称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，置水浴上加热 回流提取1.5小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀， 滤过，精密量取滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水25ml使溶液解，并 移至分液漏斗中，加氯仿振摇提取2次，每次15ml，弃去氯仿液，水液用水饱 和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨试液30ml洗涤，弃去 洗涤液，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇量使溶解。并定量转移至5ml量 瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱议， 测定，即得。本品每粒含人参皂苷Rb₁(C₅₄H₉₂O₂₃)，不得少于0.40mg。

功能主治：益气填精，补肾助阳。适用于气虚精亏，肾阳不足引起的神疲乏力， 失眠头晕，，腰膝酸软，畏寒肢冷，食欲不振，心悸气短等症。

用法用量：口服，一次4粒，一日3次。

注意：阴虚、发烧、肾阳虚期间不宜服用。

规格：每粒装0.3g

实施例2 胶囊剂

以上十二味，除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎 成细粉，其余黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤 过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，减压干燥成干浸膏，粉 碎成细粉，与上述蜂花粉、蜂王浆冻干粉及红参等细粉混匀过筛，装入胶囊， 即得。

实施例3 片剂

以上十二味，除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎成 细粉，其余黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过， 滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，或加适量辅料，与上述蜂花 粉、蜂王浆冻干粉及红参等细粉混匀，干燥，制成颗粒，压片，或包糖衣或薄 膜衣，即得。

实施例4 滴丸剂

以上十二味，除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎 成细粉，其余黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤 过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25的稠膏，与蜂花粉、蜂王浆冻干粉及红 参等细粉拌匀后，加入熔融的聚乙二醇基质中，滴入冷凝液中，沥尽，即得。

实施例5 颗粒剂

以上十二味，除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎 成细粉，其余黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤 过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，加入适量蔗糖及糊精，干 燥，制粒，即得。

实施例6 泡腾片

以上十二味，除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎 成细粉，其余黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤 过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，减压干燥成干浸膏，粉 碎成细粉，与上述蜂花粉、蜂王浆冻干粉及红参等细粉混匀，将聚乙二醇熔融后， 加入碳酸氢钠.搅拌均匀.冷却粉碎，过80目筛。另将柠檬酸、甜味素过80 目筛，与药粉、聚乙二醇包裹物细粉混匀，制粒，干燥，，压制片，即得。

实施例7 颗粒剂

以上十二味，除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎 成细粉，其余黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤 过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，加入适量甜菊素及糊精 等无糖型辅料，干燥，制粒，即得。

实施例8 胶囊剂

以上十二味，除蜂花粉、蜂王浆冻干粉外，将红参、鹿茸、冬虫夏草粉碎 成细粉，其余黄芪等七味，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤 过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，减压干燥成干浸膏，粉 碎成细粉，与上述蜂花粉、蜂王浆冻干粉及红参等细粉混匀过筛，装入胶囊， 即得。