一种木腐真菌的核酸提取方法

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1.本发明涉及真菌核酸提取方法领域，具体涉及一种木腐真菌的核酸提取方法。

背景技术：

2.真菌(学名：fungi)，是一种具真核的、产孢的、无叶绿体的真核生物。包含霉菌、酵母、蕈菌以及其他人类所熟知的菌菇类。已经发现了十二万多种真菌。真菌独立于动物、植物和其他真核生物，自成一界。真菌的细胞有含甲壳素，能通过无性繁殖和有性繁殖的方式产生孢子。其中，木腐真菌属于大型真菌，寄生于木材并能导致木材发生腐朽。它们多属于担子菌纲的多孔菌目和伞菌目，有数百种，其中，发生白腐朽的主要有多孔菌属、云芝属、层孔菌等等，引起木质褐腐朽的有牛舌菌、桦剥管菌等，另外常见的伞菌类木腐菌有侧耳属、香菇属、猴头菌属等等。真菌研究中需要借助多种研究手段，其中，核酸提取是深入研究真菌的基础。核酸提取是分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、pcr、qpcr、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。核酸提取获得的dna的纯度如果太低会影响荧光实时定量pcr能否出结果，或者干扰pcr反应。
3.目前没有木腐真菌专用的核酸提取试剂盒，只能用通用的真菌提取试剂盒提取木腐真菌，但是真菌试剂盒价格在500左右的提取样本数一般是50个左右，能够提提取真菌的一百次的价格在一千元以上，成本相对高，对木腐真菌提取的成功率也不够高。传统的真菌核酸提取需要将真菌菌丝在液氮中研磨，操作不便利，且真菌核酸提取过程用时长，一批样品提取至少需要6小时，甚至一天时间，步骤繁琐，成本高。因此，缩短真菌核酸提取步骤，开发一种针木腐真菌的短时高效低成本的提取方法非常必要。

技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种木腐真菌的核酸提取方法，无需液氮研磨，直接通过刮取木腐真菌提取，简化了操作步骤，本发明中的方法不仅简化了操作步骤，节约了原料，还提高了提取效率。
5.本发明提供了一种真菌的核酸提取方法，无需液氮研磨，直接用刀片刮取木腐真菌子实体干净部分，刮取的样品是粉末状态，然后依次利用裂解液pl、氯仿异戊醇溶液、结合液pq，抑制物去除液ir、溶液wb和洗脱液eb提取真菌核酸；
6.所述裂解液pl、氯仿异戊醇溶液、结合液pq，抑制物去除液ir、溶液wb和洗脱液eb来自于艾德莱生物的ctab植物基因组dna快速提取试剂盒。
7.上述木腐真菌的核酸提取方法，具体包括如下步骤：
8.s1，无需液氮研磨，直接用刀片刮取木腐真菌子实体干净部分1-3g，刮取的样品是粉末状态，将粉末转至离心管，加入400-500μl裂解液pl，混匀后水浴；
9.s2，加入氯仿异戊醇溶液400-450μl，然后离心；
10.s3，取干净离心管，加入450μl结合液pq，然后吸取300-350μl s2得到的上清液加入后混匀，得混合溶液；
11.s4，将上步骤获得的混合溶液移入吸附柱ac中，离心，倒掉废液；
12.s5，加400-500μl抑制物去除液ir，12000rpm离心30s，倒掉废液；
13.s6，加500-600μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液；
14.s7，加500-600μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液，再13000rpm离心2min；
15.s8，取出吸附柱ac，转入干净离心管中，开盖静置使乙醇充分挥发；
16.s9，加入70-100μl洗脱液eb，静置3-5min，离心后获得真菌核酸。
17.进一步地，s1中，水浴温度为60-65℃，水浴时间为20-40min。
18.进一步地，s2中，所述氯仿异戊醇溶液中氯仿和异戊醇按照体积比24:1混合而成。
19.进一步地，s2中，离心条件为12000rpm离心5min。
20.进一步地，s4中，离心条件为12000rpm离心30s。
21.进一步地，s5-s6中，离心条件均为12000rpm离心30s。
22.进一步地，s8中，开盖静置5-10min。
23.进一步地，s9中，离心条件为12000rpm离心20s。
24.进一步地，所述真菌为木腐真菌。
25.进一步地，所述木腐真菌包括但不限于多孔菌、齿菌、革菌。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
27.1、本发明以现有的ctab植物基因组dna快速提取试剂盒(艾德莱生物)为基础进行改造，去掉了液氮研磨步骤，利用ctab植物基因组dna快速提取试剂盒中的裂解液pl、氯仿异戊醇溶液、结合液pq，抑制物去除液ir、溶液wb和洗脱液eb提取木腐真菌的核酸，提取成功率为100％，且提取的dna纯度高，一盒ctab植物基因组dna快速提取试剂盒改造后可以提取的木腐真菌样本200-400个。
28.2、本发明提供的木腐真菌的核酸提取方法不仅成本低，成功率高，而且提取一批的时间短，木腐真菌的核酸提取一批只需1小时，用传统的真菌试剂盒(真菌基因组dna提取试剂盒100t(尚宝生物))提取提取一批样本需要6个小时，本技术的提取方法时间是传统的六分之一，显著缩短了提取的时间。
29.3、本发明提供的真菌的核酸提取方法获得的核酸纯度高，基本上不存在蛋白质、酚等污染，对于后续研究和实验奠定了良好的实验基础。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明中a组菌株核酸的pcr胶图；
32.其中，编号1-10表示不同泳道中的不同核酸样本；
33.图2为本发明中b组菌株核酸的pcr胶图；
34.其中，编号1-22表示不同泳道中的不同核酸样本。
具体实施方式
35.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.实施例1
37.本实施例提供一种真菌的核酸提取方法。
38.一、供试菌株
39.1、本发明采自国内不同保护区内的木腐真菌共200余种，任意选择其中10种作为a组，再选择22株为b组，具体信息见表1。
40.表1本发明提供的菌株信息
41.[0042][0043]
2、本发明的提取方法中使用的所有成分都来自于ctab植物基因组dna快速提取试剂盒(艾德莱生物)。
[0044]
二、核酸提取方法
[0045]
(1)无需液氮研磨，直接用刀片刮取木腐真菌干净部分3g，刮取的样品是粉末状态，将粉末状样品转移至1.5ml离心管内，每个样品中加450μl裂解液pl，摇匀，65℃水浴30min；
[0046]
(2)加入体积比为24:1的氯仿异戊醇溶液(氯仿：异戊醇＝24:1)400μl，12000rpm离心5min；
[0047]
(3)另取干净1.5ml离心管，加入450μl结合液pq，然后吸取(2)中获得的300μl上清液加入后混匀，得混合溶液；
[0048]
(4)将上步骤获得的混合溶液移入吸附柱ac中，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0049]
(5)加400μl抑制物去除液ir，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0050]
(6)加500μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0051]
(7)加500μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液，再13000rpm离心2min；
[0052]
(8)取出吸附柱ac，转入干净离心管中，开盖静置10min，使乙醇充分挥发；
[0053]
(9)加入80μl洗脱液eb，静置3-5min，12000rpm离心20s，获得真菌核酸。
[0054]
实施例2
[0055]
实施例2提供一种真菌的核酸提取方法，具体包括如下步骤：
[0056]
(1)无需液氮研磨，直接用刀片刮取木腐真菌干净部分1g，刮取的样品是粉末状态，将粉末状样品转移至离心管内，每个样品中加400μl裂解液pl，摇匀，60℃水浴20min；
[0057]
(2)加入体积比为24:1的氯仿异戊醇溶液(氯仿：异戊醇＝24:1)450μl，12000rpm离心5min；
[0058]
(3)另取干净1.5ml离心管，加入450μl结合液pq，然后吸取(2)中获得的350μl上清液加入后混匀，得混合溶液；
[0059]
(4)将上步骤获得的混合溶液移入吸附柱ac中，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0060]
(5)加450μl抑制物去除液ir，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0061]
(6)加550μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0062]
(7)加550μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液，再13000rpm离心2min；
[0063]
(8)取出吸附柱ac，转入干净离心管中，开盖静置5min，使乙醇充分挥发；
[0064]
(9)加入70μl洗脱液eb，静置3-5min，12000rpm离心20s，获得真菌核酸。
[0065]
实施例3
[0066]
实施例3提供一种真菌的核酸提取方法，具体包括如下步骤：
[0067]
(1)无需液氮研磨，直接用刀片刮取木腐真菌干净部分2g，刮取的样品是粉末状态，将样品粉末状样品转移至离心管内，每个样品中加450μl裂解液pl，摇匀，65℃水浴40min；
[0068]
(2)加入体积比为24:1的氯仿异戊醇溶液(氯仿：异戊醇＝24:1)425μl，12000rpm离心5min；
[0069]
(3)另取干净1.5ml离心管，加入450μl结合液pq，然后吸取325μl上清液加入后混匀，得混合溶液；
[0070]
(4)将上步骤获得的混合溶液移入吸附柱ac中，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0071]
(5)加500μl抑制物去除液ir，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0072]
(6)加600μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0073]
(7)加600μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液，再13000rpm离心2min；
[0074]
(8)取出吸附柱ac，转入干净离心管中，开盖静置7min，使乙醇充分挥发；
[0075]
(9)加入100μl洗脱液eb，静置3-5min，12000rpm离心20s，获得真菌核酸。
[0076]
上述实施例1的方法提取真菌核酸一批只需要60min。
[0077]
上述实施例1-3为本发明的具体实施例，以实施例1为例，以表1中的真菌为样品进行核酸提取，提取获得的核酸利用软件nanodrop 2000进行dna纯度检测，检测及计算结果记录在表2和表3中。
[0078]
对比例1
[0079]
以a组的木腐真菌为样本，采用现有的真菌基因组dna提取试剂盒100t(尚宝生物)按照试剂盒说明书中的步骤进行dna提取，计算成功率，检测dna纯度，结果记录在表4。
[0080]
对比例2
[0081]
以a组的木腐真菌为样本，直接采用改造前的ctab植物基因组dna快速提取试剂盒(艾德莱生物)提取a组木腐真菌的dna，提取方法按照试剂盒说明书进行，计算成功率，检测dna纯度，记录在表5。
[0082]
具体dna纯度检测方法如下：
[0083]
准备：dna原液、(2.5μl的移液)、一盒白头、一管去离子水(2ml离心管)、一卷纸、垃圾罐。
[0084]
(1)打开电脑后进入相应软件程序，nanodrop 2000进入nucleic acid；
[0085]
(2)先用移液吸取2.5μl灭过菌的去离子水于检测孔上，盖子盖上轻轻按压再放入纸巾按压吸干水(注意纸巾不可重复使用)，洗三次；
[0086]
(3)校准：先用去离子水测量校准(blank键)；
[0087]
(4)测样：用移液吹打dna原液后，相同方式吸取原液于检测孔上测量，记录数据(measure键)；
[0088]
(5)全部测完后要再次用去离子水清洗一次，放上干净的纸在上面。
[0089]
需要注意的是：每个样测完后都要用纸巾通过检测仪盖按压擦干，每次用过的纸巾都要扔掉；
[0090]
sample id输入顺序数字；数据记录nucleic acid conc(浓度)和260/280(比例)和有无峰；
[0091]
260/280比值是指260nm和280nm下吸光度比值，260nm代表核酸的吸光度，280nm代表蛋白质的吸光度。
[0092]
将提取到的核酸利用真菌通用引物pcr后进行凝胶电泳，结果如图1和图2所示。
[0093]
表2实施例1中提取的a组真菌的dna质检结果
[0094][0095]
表3实施例1中提取的b组真菌的dna质检结果
[0096][0097][0098]
表4对比例1中提取的a组真菌的dna质检结果
[0099][0100]
注：—表示未提取成功。
[0101]
表5对比例2中提取的a组真菌的dna质检结果
[0102][0103][0104]
注：—表示未提取成功。
[0105]
从表1和表2可知，按照实施例1的方法提取表1中的a组和b组共32种木腐真菌的dna，发现提取成功率为100％，也就是全部提出，且一批只需要60min，一盒ctab植物基因组dna快速提取试剂盒改造后可以提取的木腐真菌样本200-400个，本发明的提取方法效率高，耗时少，成本低；
[0106]
从表2中也可以看到，a组真菌中1、2、4、6、7、9和10号的dna的260/280的值在1.8-2.0，说明dna纯度很高，a组真菌中3、5和8号的dna的260/280的值在1.7-1.8，说明a组真菌中提取的核酸dna纯度是较高的；从表3可知，b组真菌中1，2，3，4，5，6号和8，9，10，12，13，14，15，16，17，19，20，21，22号的dna的260/280的值在1.8-2.0，7，11，18号的dna的260/280的值在1.7-1.8，说明b组真菌中提取的核酸dna纯度是较高的；
[0107]
从表4可以看到，利用对比例1中的现有的真菌基因组dna提取试剂盒100t(尚宝生物)提取a组木腐真菌的dna，发现10号木腐真菌——毛栓孔菌(trametes hirsuta)的dna没有提取出来，提取成功率为90％，且发现1，2，4，7，9的dna纯度高，260/280的值在1.8-2.0，有4种木腐真菌的dna纯度不够，说明利用普通的真菌基因组dna提取试剂盒100t(尚宝生物)提取木腐真菌的dna的纯度不够。表5中是利用改造前的ctab植物基因组dna快速提取试剂盒(艾德莱生物)直接提取a组的10种木腐真菌，发现有一半的菌株dna没有提取成功，提取出来的五种木腐真菌中2，7，8的dna纯度高，260/280的值在1.8-2.0，剩余的4和9号木腐真菌的dna检测的260/280的值在1.75-1.8。
[0108]
综上所述，本发明通过改造ctab植物基因组dna快速提取试剂盒获得提取木腐真菌的方法，效率高、耗时短、成本低，提取成功率为100％，提取的木腐真菌dna的纯度高，能够专门用于木腐真菌等大型真菌的dna提取。
[0109]
通过本发明的核酸提取方法提取到的真菌核酸的纯度高完全符合后续实验的标准，不管是简单的pcr还是荧光定量pcr都是满足的，为真菌的深入研究奠定了良好的实验基础。
[0110]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0111]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，无需液氮研磨，直接刮取木腐真菌子实体干净部分，刮取的样品是粉末状态，然后依次利用裂解液pl、氯仿异戊醇溶液、结合液pq，抑制物去除液ir、溶液wb和洗脱液eb提取真菌核酸；所述裂解液pl、氯仿异戊醇溶液、结合液pq，抑制物去除液ir、溶液wb和洗脱液eb来自于艾德莱生物的ctab植物基因组dna快速提取试剂盒。2.根据权利要求1所述的一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：s1，无需液氮研磨，直接刮取木腐真菌子实体干净部分1-3g，刮取的样品是粉末状态，将粉末转至离心管，加入400-500μl裂解液pl，混匀后水浴；s2，加入氯仿异戊醇溶液400-450μl，然后离心；s3，取干净离心管，加入450μl结合液pq，然后吸取300-350μl s2得到的上清液加入后混匀，得混合溶液；s4，将上步骤获得的混合溶液移入吸附柱ac中，离心，倒掉废液；s5，加400-500μl抑制物去除液ir，12000rpm离心30s，倒掉废液；s6，加500-600μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液；s7，加500-600μl溶液wb，12000rpm离心30s，倒掉废液，再13000rpm离心2min；s8，取出吸附柱ac，转入干净离心管中，开盖静置使乙醇充分挥发；s9，加入70-100μl洗脱液eb，静置3-5min，离心后获得真菌核酸。3.根据权利要求2所述的一种真菌的核酸提取方法，其特征在于，s1中，水浴温度为60-65℃，水浴时间为20-40min。4.根据权利要求3所述的一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，s2中，所述氯仿异戊醇溶液中氯仿和异戊醇按照体积比24:1混合而成。5.根据权利要求4所述的一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，s2中，离心条件为12000rpm离心5min。6.根据权利要求5所述的一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，s4中，离心条件为12000rpm离心30s。7.根据权利要求6所述的一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，s5-s6中，离心条件均为12000rpm离心30s。8.根据权利要求7所述的一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，s8中，开盖静置5-10min。9.根据权利要求8所述的一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，s9中，离心条件为12000rpm离心20s。10.根据权利要求9所述的一种木腐真菌的核酸提取方法，其特征在于，所述真菌包括但不限于多孔菌、齿菌、革菌。

技术总结

本发明涉及真菌核酸提取方法领域，具体公开了一种木腐真菌的核酸提取方法，本发明在提取木腐真菌核酸时去掉了繁琐的液氮加入和研磨步骤，提取步骤简化，利用来自CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒中的裂解液PL、氯仿异戊醇溶液、结合液PQ，抑制物去除液IR、溶液WB和洗脱液EB提取木腐真菌的核酸。本发明中的方法步骤简单，比传统的真菌试剂盒成本低，提取成功率更高，是一种针对木腐真菌的核酸提取方法，提取获得的木腐真菌的DNA纯度高。提取获得的木腐真菌的DNA纯度高。提取获得的木腐真菌的DNA纯度高。