一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽SDH73及其应用

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一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73及其应用。

背景技术：

2.微生物活动是引起水产品腐败变质的主要原因。通过对捕获和贮藏流通过程中鱼类细菌学进行大量研究，逐渐明确了虽然鱼体最初会受到多种微生物的污染，但只有部分细菌参与腐败过程。这些适合生存和繁殖并产生腐败臭味和异味代谢产物的菌，就是该鱼类的特定腐败菌。特定腐败菌在贮藏中生长比其他微生物快，并且腐败活性强。因此控制特定腐败菌的生长，抑制其产生有害物质并防止产品品质下降具有重要的社会和经济价值。
3.硝化杆菌、阿氏芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌被证明是细菌在生长代谢过程中可降解蛋白质、脂肪、核苷酸等营养物质，产生挥发性盐基氮、三甲胺等小分子物质，释放不良气味，最终导致鱼肉腐败变质的腐败菌。
4.抗菌肽作为广泛存在于自然界生物中的一类多肽物质，对细菌具有良好的抑制作用，且安全性高，符合当今绿生产的要求，可作为传统抗生素和饲料添加剂的代替品。鱼类属脊索动物门,，非特异性免疫系统是鱼类抵抗各类病原体的第一道防御屏障，抗菌肽是鱼类非特异性免疫系统的重要组成部分。鱼类栖息在含有各种微生物的水体环境中，当其受到病原微生物侵袭或机体损伤时，能够迅速产生以抗菌肽为主的免疫分子以防御病原微生物的侵入或者杀伤病原微生物。
5.因此，将从发酵大黄鱼中分离出的小分子多肽作为抑制食品特定腐败菌(如硝化杆菌、阿氏芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌)的抗菌药物、水产饲料添加剂、食品防腐剂等具有十分可观的应用前景。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73及其应用，通过一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73对食品腐败菌抑菌活性的研究，为寻新的食品防腐剂、生物医药和水产饲料添加剂提供实验依据，促进我国食品、医药和水产养殖行业的健康、持续发展。
7.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73。其氨基酸序列为krgmlencillslfak，如seqidno：1所示。
8.抗菌肽sdh73的分子量为1836道尔顿，所带电荷为+2，总疏水性比为56％。
9.抗菌肽sdh73是从如下原理对细菌造成破坏：
10.(一)抗菌肽sdh73具有的正电荷可与细菌细胞膜发生作用，增加细菌细胞膜成孔活性；
11.(二)破坏细胞膜的同时改变细菌细胞膜的通透性，使细胞内物质外渗从而导致细
菌死亡；
12.(三)以嵌插方式与dna结合，破坏细菌dna结构，导致细菌死亡。
13.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73在制备抗菌药物中的应用，该抗菌药物用于抑制和/或杀灭食品腐败菌。
14.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供一种抗菌药物，其有效成分包括发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。
15.在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物的有效成分为发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。
16.在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副食品腐败菌。
17.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：提供一种饲料添加剂，其有效成分包括发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。
18.在本发明一较佳实施例中，所述饲料添加剂的有效成分为发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。
19.在本发明一较佳实施例中，所述饲料添加剂用于抑制和/或杀灭食品腐败菌。
20.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是：提供一种食品防腐剂，其有效成分为发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。
21.在本发明一较佳实施例中，所述食品防腐剂用于抑制和/或杀灭食品腐败菌。
22.本发明的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相谱法。
23.实施本发明，具有如下有益效果：
24.本发明以发酵黄鱼为研究对象，通过lcms质谱结果对所的肽段进行生物信息学预测，发现一个全新氨基酸序列的多肽sdh73。以硝化杆菌为例，研究多肽sdh73对其的抑菌活性；实验结果表明，该肽对硝化杆菌具有强烈的抑制作用。它的抑菌机理是首先吸附在细菌表面，然后破坏细菌的细胞膜，并与细菌dna相结合破坏dna的结构，从而达到使细菌失活的作用。
附图说明
25.图1为抗菌肽sdh73的质谱图。
26.图2为抗菌肽sdh73的结构示意图。
27.图3为抗菌肽sdh73对硝化杆菌最低抑制浓度(mic)测定对照图。其中，
28.a：抗菌肽浓度0μg/ml；
29.b：抗菌肽浓度250μg/ml；
30.c：抗菌肽浓度125μg/ml；
31.d：抗菌肽浓度62.5μg/ml；
32.e：抗菌肽浓度31.25μg/ml；
33.f：抗菌肽浓度15.625μg/ml。
34.图4为抗菌肽sdh73对硝化杆菌时间杀伤(time-kill)曲线分析图。
35.图5为抗菌肽sdh73对硝化杆菌细胞膜通透性影响的测定分析图。
36.图6为抗菌肽sdh73与溴化乙锭(eb)竞争性结合硝化杆菌中的dna的荧光光谱图。
37.图7为抗菌肽sdh73与硝化杆菌中的dna结合的荧光光谱图。
38.图8为菌液中核酸含量的测定结果图。
39.图9为菌液中蛋白质含量的测定结果图。
40.图10为抗菌肽sdh73与硝化杆菌dna结合电泳图。
41.其中，
42.条带l：空白对照；
43.条带a-k：分别是sdh73与dna质量比为100/1，100/2，100/4，100/6，100/8，100/10，100/20，100/40，100/60，100/80，100/100。
具体实施方式
44.为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
45.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
46.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
47.实施例1：发酵大黄鱼的液相谱/质谱联用技术(lcms)
48.称取100～200g发酵大黄鱼样品鱼肉于烧杯中，加入适量超纯水用搅拌机破碎3～5min，然后将破碎的组织于100℃水浴锅煮2～3h。在4℃条件下用11000g离心力离心20min制备样品。再将离心好的上清液过0-3000目筛后于冰箱隔夜冷冻后进行冻干。再将冻干后的样品进行lcms实验。
49.谱条件：进样量：5.0μl
50.谱柱：c18分析谱柱，长度25cm，内径75μm
51.流动相：
52.a：0.1％甲醇水溶液
53.b：乙腈
54.结合搜库软件：maxquantv1.6.5.0、数据库：uniprot大黄鱼蛋白库对所得肽段质谱图进行区分鉴定，得到85种肽段。抗菌肽sdh73质谱结果如图1所示。
55.实施例2：发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73的筛选
56.通过lcms结果所得20种氨基酸序列，利用抗菌肽预测在线服务器apd3、camp对发酵大黄鱼蛋白序列中可能存在的抗菌序列进行预测，并对可能具有抗菌序列的电荷、疏水性进行分析，最终筛选出氨基酸序列krgmlencillslfak化学合成(由北京中科亚光生物科技有限公司合成)，并进行抑菌活性验证。筛选结果如下表所示。
57.表1发酵大黄鱼潜在抗菌肽的预测
[0058][0059]
从表1可以看出，序列krgmlencillslfak具有典型抗菌肽的特征，即氨基酸数量(《50)、总正电荷(+2到+9)和疏水氨基酸百分比(》30％)。合成符合特征的2个肽(krgmlencillslfak、maalqlmqqkank)，分别对硝化杆菌进行抑菌实验，结果显示肽序列krgmlencillslfak的抑菌作用最强。
[0060]
实施例3：抗菌肽sdh73的3d结构预测
[0061]
利用在线结构预测服务器swiss-model，对发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白及其衍生
抗菌肽sdh73的结构进行预测，并利用pymol软件进行编辑和修改，得到抗菌肽sdh73的结构，如图2所示。
[0062]
实施例4：抗菌肽sdh73的最低抑制浓度(mic)测定
[0063]
将硝化杆菌在37℃培养12h至对数生长期，在0.01m ph 7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10
4-5
cfu/ml。将肽溶于磷酸盐缓冲中，37℃等体积与菌混合2h。最低抑菌浓度(mic)是指在37℃孵育过夜后，从微量滴定板上看不到细菌生长的抗菌肽最低浓度。如图3所示，抗菌肽sdh73对硝化杆菌的最低抑菌浓度(mic)为62.5μg/ml。
[0064]
实施例5：抗菌肽sdh73的时间-杀菌曲线(time-kill)测定
[0065]
将硝化杆菌在37℃培养12h至对数生长期，在0.01mph7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10
4-5
cfu/ml。取1
×
mic和2
×
mic浓度肽于37℃等体积与菌混合后分别进行孵育，每隔30分钟取样涂平板，37℃培养过夜后记录菌落总数。由结果可知，抗菌肽sdh73对硝化杆菌在1h开始有明显效果。在抗菌肽sdh73作用下，细菌数量减少的更快。表明抗菌肽sdh73对硝化杆菌随着作用时间增加有明显的抑制效果(如图4所示)。
[0066]
实施例6：抗菌肽sdh73对细胞膜通透性影响的测定
[0067]
将硝化杆菌在37℃培养12h至对数生长期，于10000r/min离心1min，菌体用pbs洗涤3次，用10ml无菌m9乳糖诱导培养基重悬，37℃、130r/min诱导培养2h后，每组中加入1.5mmol/ml的onpg溶液100μl，37℃孵育，每隔1h于酶标仪420nm处测定吸光度。细菌在以乳糖为唯一碳源时可诱导生成β-半乳糖苷酶，细胞膜受损后，胞外onpg可渗透入胞内并被水解为半乳糖和邻-硝基苯酚(o-nitrophenol，onp)；onp在420nm处有特征性紫外吸收。一定浓度范围时，onp吸光值与细胞膜通透性成正比，可作为细胞膜通透性评价的重要指标。如图5所示，随着抗菌肽sdh73浓度的增加，细胞膜通透性随时间的延长逐渐增大。
[0068]
实施例7：抗菌肽sdh73与eb竞争性结合dna的荧光光谱实验
[0069]
抗菌肽sdh73与溴化乙锭(eb)竞争性结合dna的荧光光谱实验分析抗菌肽sdh73与硝化杆菌基因组dna的作用方式：用te缓冲液将硝化杆菌基因组dna稀释为50μg/ml。反应在96孔板进行，首先每个孔加入50μl的dna溶液和0.75μl浓度为100μg/ml的eb溶液，混匀后置于生化培养箱中37℃避光孵育10min。接着加入50μl不同浓度的肽溶液，空白对照组用50μl的蒸馏水代替，混匀之后置于生化培养箱中37℃避光孵育30min。孵育结束后，用多功能酶标仪测定样品在激发波长535nm及发射波长570～710nm范围内的荧光光谱。在水溶液中，eb的荧光很弱，但是当它通过以较高的亲合力、嵌入的方式与双链dna结合时，其荧光强度大幅度增强。若eb-dna复合物体系中存在能与dna发生类似作用的物质将结合在dna上的eb竞争下来时，体系的荧光强度就会降低，说明竞争物与eb一样的嵌插作用模式与dna结合。因此，通过测定dna-eb复合物体系与竞争物作用的荧光光谱的变化，来判定竞争物是否也同eb一样通过嵌插方式与dna结合。由图6可知，随着抗菌肽sdh73浓度的增加eb-dna复合物的荧光强度也显著降低，说明抗菌肽sdh73与硝化杆菌dna发生了嵌插结合，把之前结合在dna碱基对的eb竞争下来，代替eb以嵌插方式与dna结合，使整个体系的荧光强度降低。
[0070]
实施例8：抗菌肽sdh73与硝化杆菌中的dna结合的荧光光谱
[0071]
将硝化杆菌接种于lb肉汤，37℃、200r/min培养12h，使其生长到对数期。取对数期的菌液1ml离心弃上清，用0.1m pbs将收集到的菌体清洗三次后并调节其菌液浓度为107cfu/ml。菌液中加入抗菌肽sdh73，使其终浓度为1/4
×
mic、1/2
×
mic、1
×
mic、2
×
mic，
不加抗菌肽sdh73作为空白对照。样品在37℃、120r/min培养3h，取出100μl加入100μl pi(碘化丙啶)染料，25℃涡旋混匀，避光孵育15min。在酶标仪上测定其荧光强度。设定激发波长为535nm,在570nm-830nm范围内测定发射波长。pi(propidium lodide)是一种核酸染料，其激发波长为535nm，发射波长为615nm下有最强的荧光吸收。它不能穿过正常的细胞膜，但是当细胞膜受损或者破裂时，pi可以进入细胞膜与dna结合显示红发荧光。可根据荧光强度的大小来确定细胞受损程度。pi与不同浓度抗菌肽处理的硝化杆菌的dna结合的情况如图7所示，不同浓度的抗菌肽sdh73处理的硝化杆菌的荧光强度都显著高于空白对照组，说明抗菌肽处理损伤了细菌的细胞膜增加了细胞膜的通透性，并且高剂量的抗菌肽使细菌的细胞膜的通透性大大增加导致更多的pi进入到细胞内结合dna。
[0072]
实施例9：菌液中核酸、蛋白质含量的测定
[0073]
将硝化杆菌接种于lb肉汤，37℃、200r/min培养12h，使其生长到对数期。用无菌生理盐水洗涤3次，并将菌悬液浓度调至103cfu/ml。同样，用灭菌生理盐水稀释抗菌肽sdh73，使其终浓度分别为1
×
mic、2
×
mic、4
×
mic。将菌悬液和抗菌肽溶液以体积比1:1混合，同时将未添加抗菌肽的灭菌生理盐水与菌悬液等量混合，作为对照组。37℃恒温振荡培养，每隔10min利用紫外-可见分光光度计分别在260nm、280nm下测定菌液中核酸、蛋白质的含量。细胞内物质的泄漏是细胞膜通透性改变或破损的重要指标之一，因此，可以通过检测胞内的核酸、蛋白质等大分子物质泄漏情况，间接地反映细胞膜的损伤程度。硝化杆菌经抗菌肽处理后胞内核酸、蛋白质的泄漏情况如图8、9所示。随着时间的延长，处理组核酸、蛋白质释放量都高于对照组，表明该抗菌肽能通过改变细菌细胞膜的通透性，引起膜内物质泄漏到胞外，进而达到诱使菌体死亡的目的。
[0074]
实施例10：抗菌肽sdh73与硝化杆菌dna的相互作用
[0075]
采用dna凝胶阻滞法研究了抗菌肽sdh73与硝化杆菌dna的相互作用。将硝化杆菌在37℃的50ml营养肉汤培养基(nb)中培养12h，用细菌基因组dna提取试剂盒提取细菌基因组dna。在260和280nm的光密度比(od260/od280≥1.90)评价提取的基因组dna的纯度。接下来将dna(168ng/μl)与肽sdh73按不同质量比在37℃下混合60min，将混合物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用geldoc xr凝胶成像系统(bio-rad，美国)在紫外线照射下观察凝胶阻滞，如图10所示。
[0076]
综上，本发明提供了一种全新的抗菌肽sdh73对硝化杆菌的最低抑菌浓度mic为62.5μg/ml，能够抑制硝化杆菌生长。本发明抗菌肽sdh73首先首先吸附在细菌表面，然后破坏细菌的细胞膜，并与细菌dna相结合破坏dna的结构，从而达到使细菌失活的作用。
[0077]
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

技术特征：

1.一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，其氨基酸序列如seq id no：1所示。2.如权利要求1所述的发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73在制备抗菌药物中的应用,其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭食品腐败菌。3.一种抗菌药物，其特征在于：其有效成分包括发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。4.如权利要求3所述的抗菌药物，其特征在于：其有效成分为发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。5.如权利要求3或4任一项所述的一种抗菌药物，其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭食品腐败菌。6.一种饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。7.如权利要求6所述的饲料添加剂，其特征在于：其有效成分为发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。8.如权利要求6或7任一项所述的一种饲料添加剂，其特征在于：所述饲料添加剂用于抑制和/或杀灭食品腐败菌。9.一种食品防腐剂，其特征在于：其有效成分为发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽sdh73，所述抗菌肽sdh73的氨基酸序列为seq id no：1。10.如权利要求9所述的食品防腐剂，其特征在于：所述饲料添加剂用于抑制和/或杀灭食品腐败菌。

技术总结

本发明公开了一种发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白抗菌肽SDH73，其氨基酸序列为KRGMLENCILLSLFAK，抗菌肽SDH73的分子量为1836道尔顿。实验证明，本发明抗菌肽SDH73能够有效抑制如硝化杆菌、阿氏芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌等食品腐败菌。本发明为后续进一步研究发酵大黄鱼琥珀酸脱氢蛋白用于食品防腐剂、生物医药和饲料添加剂奠定了基础。物医药和饲料添加剂奠定了基础。物医药和饲料添加剂奠定了基础。