一种蚓激酶高效提取全资源化方法

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1.本发明涉及生物提取技术领域，尤其涉及一种蚓激酶高效提取全资源化方法。

背景技术：

2.蚯蚓是土壤动物最大的常见类之一，在生态系统中扮演着多种角，既是“消费”者、也是“创造”者。它通过取食、消化、排泄(蚯蚓粪)、分泌(粘液)和掘穴等活动对土壤过程的物质循环和能量传递作贡献，可以对多个决定土壤肥力的过程产生重要影响。蚯蚓作为高蛋白饲料，蚯蚓粪是有机肥原料，具有良好经济价值。蚯蚓也是中药材，具有巨大的药用价值，蚯蚓体内的蚓激酶具有抗血栓作用，能够跟踪溶栓，有效溶解微栓，改善微循环，加强心、脑血管侧支循环，开放性修复血管受损内皮细胞，增加血管弹性，改善血管供氧功能，降低血液粘度，降低血小板聚集率，抑制血栓再次形成。修复血栓发生后周边坏死脑细胞，挽救半暗区。
3.目前，现有的蚓激酶提取方法包括：nh4ac-hac缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液匀浆，硫酸铵盐析，离子交换谱或透析的方式获得粗酶液。然而，该技术采用的缓冲液、盐析溶液无法回收或再利用，为环境带来风险的同时也提高了蚓激酶提取成本。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种蚓激酶高效提取全资源化方法，能够实现蚓激酶的高效提取分离和全资源化回收利用，且成本低。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种蚓激酶高效提取全资源化方法，包括以下步骤：
7.将蚯蚓浸泡于第一缓冲溶液后，进行匀浆，将所得匀浆物料进行膜过滤，得到蛋白溶液；
8.将所述蛋白溶液与乙醇混合，进行盐析，得到上清液和盐析物；
9.将所述盐析物与第二缓冲溶液混合，将所得混合液进行蛋白纯化后，冷冻干燥，得到蚓激酶；
10.将所述上清液进行减压蒸馏后，将所得残液与匀浆所得蚯蚓残渣混合后，进行发酵，得到生态肥料；
11.所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液均为碳酸氢钾-醋酸铵混合溶液；
12.所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液的ph值独立为7.5～8.0。
13.优选的，所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液的ph值独立为7.8。
14.优选的，所述浸泡的时间为30～60min。
15.优选的，所述匀浆的转速为20000～25000rpm，时间为3～5min。
16.优选的，所述膜过滤所用膜的截留分子量为50kd，所述蛋白溶液中蛋白分子量≤50kd。
17.优选的，所述乙醇与蛋白溶液的体积比为(0.5～3):1。
18.优选的，所述第二缓冲溶液与盐析物的质量比为(10～100):1。
19.优选的，所述减压蒸馏的温度为50～60℃。
20.优选的，所述发酵的温度为30～35℃，时间为10～15天。
21.优选的，所述发酵在无氧密闭条件下进行。
22.本发明提供了一种蚓激酶高效提取全资源化方法，包括以下步骤：将蚯蚓浸泡于第一缓冲溶液后，进行匀浆，将所得匀浆物料进行膜过滤，得到蛋白溶液；将所述蛋白溶液与乙醇混合，进行盐析，得到上清液和盐析物；将所述盐析物与第二缓冲溶液混合，将所得混合液进行蛋白纯化后，冷冻干燥，得到蚓激酶；将所述上清液进行减压蒸馏后，将所得残液与匀浆所得蚯蚓残渣混合后，进行发酵，得到生态肥料；所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液均为碳酸氢钾-醋酸铵混合溶液，所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液的ph值独立为7.5～8.0。本发明采用碳酸氢钾-醋酸铵结合乙醇盐析方法提取蚓激酶蛋白，碳酸氢钾与醋酸铵缓冲溶液提供的ph＝7.5～8.0的条件能够维持蚓激酶蛋白的高活性，提高提取率；乙醇能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低，乙醇与水的作用能破坏蛋白质的水化膜，蛋白质在乙醇中由于溶解度存在差异而分离析出，实现蚓激酶的高效提取分离；此外，本发明将蚓激酶提取后所得废液转化为液体肥，综合利用残余物质，解决了废液资源化利用难题，实现蚯蚓提取过程的绿环保和全资源化回收利用。
23.本发明采用缓冲溶液溶解、膜过滤、盐析和蛋白纯化步骤实现高品质蚓激酶的提取；提取过程产生的废渣与废弃溶液经深度处理可加工为生态肥料，从而实现蚯蚓提取全过程“零”排放，为蚓激酶的生产提供一条绿新路径。与现有技术相比，本发明的方法能够实现提取废液的回收及资源化利用，具有方法简单、易于操作、成本低等优点，具有显著的经济和环境效益。
具体实施方式
24.本发明提供了一种蚓激酶高效提取全资源化方法，包括以下步骤：
25.将蚯蚓浸泡于第一缓冲溶液后，进行匀浆，将所得匀浆物料进行膜过滤，得到蛋白溶液；
26.将所述蛋白溶液与乙醇混合，进行盐析，得到上清液和盐析物；
27.将所述盐析物与第二缓冲溶液混合，将所得混合液进行蛋白纯化后，冷冻干燥，得到蚓激酶；
28.将所述上清液进行减压蒸馏后，将所得残液与匀浆所得蚯蚓残渣混合后，进行发酵，得到生态肥料；
29.所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液均为碳酸氢钾-醋酸铵混合溶液；
30.所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液的ph值独立为7.5～8.0。
31.在本发明中，若无特殊说明，所需材料或试剂均为本领域技术人员熟知的市售商品。
32.本发明将蚯蚓浸泡于第一缓冲溶液后，进行匀浆，将所得匀浆物料进行膜过滤，得到蛋白溶液。
33.本发明对所述蚯蚓的来源没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式获取即可。
34.在本发明中，所述第一缓冲溶液为碳酸氢钾-醋酸铵混合溶液，所述第一缓冲溶液
的ph值为7.5～8.0，优选为7.8。本发明对所述第一缓冲溶液的用量没有特殊的限定，能够将对应的蚯蚓完全浸泡即可。
35.在本发明中，所述浸泡的时间优选为30～60min，更优选为40～50min。
36.完成所述浸泡后，本发明将所得蚯蚓用匀浆机进行匀浆；所述匀浆的转速优选为20000～25000rpm，更优选为23000rpm；时间优选为3～5min，更优选为4min。本发明对所述匀浆机没有特殊的限定，本领域熟知的相应设备均可。
37.完成所述匀浆后，本发明优选将所得物料进行离心，取上清液转移至抽滤瓶中抽滤，所得蚯蚓残渣(离心分离产生的不溶蚯蚓残体)留存；将抽滤后所得溶液(均匀浆料)进行膜过滤。在本发明中，所述膜过滤所用膜的截留分子量优选为50kd，所述蛋白溶液中蛋白分子量优选≤50kd。所述膜过滤膜所用膜优选为平板膜，所述膜过滤所用蛋白分离设备来源于青岛富勒姆公司；本发明通过膜过滤将蛋白分子量在50kd以上的截留，50kd以下的流出，分离形成蛋白溶液。本发明对所述平板膜没有特殊的限定，能够达到上述截留效果即可。
38.得到蛋白溶液后，本发明将所述蛋白溶液与乙醇混合，进行盐析，得到上清液和盐析物。
39.在本发明中，所述乙醇优选为无水乙醇；所述乙醇与蛋白溶液的体积比优选为(0.5～3):1，更优选为(1.5～2):1。本发明通过盐析将蛋白溶液中蛋白质析出，所得盐析物中包括蚓激酶和其他蛋白质，通过后续的蛋白纯化将蚓激酶提取出来。
40.得到盐析物后，本发明将所述盐析物与第二缓冲溶液混合，将所得混合液进行蛋白纯化后，冷冻干燥，得到蚓激酶。
41.在本发明中，所述第二缓冲溶液为碳酸氢钾-醋酸铵混合溶液，第二缓冲溶液的ph值为7.5～8.0，优选为7.8；所述第二缓冲溶液与盐析物的质量比优选为(10～100):1，更优选为(10～50):1。
42.在本发明中，所述蛋白纯化优选在蛋白纯化装置进行，本发明对所述蛋白纯化装置没有特殊的限定，本领域熟知的相应设备均可；在本发明的实施例中，所用蛋白纯化装置为上海闪谱制造的蛋白纯化装置。本发明通过蛋白纯化装置分离出分子量大于20kd的蛋白质，蚓激酶为复合蛋白产品，分子量范围为20～45kd，本发明从蚯蚓体内提取分子量大于20kd的蛋白质即为蚓激酶。本发明对所述蛋白纯化的具体条件没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。本发明优选采用分离柱得到所需分子量的蛋白质，所述分离柱优选为sephadexg-100或sephadexg-50。
43.完成所述蛋白纯化后，本发明将所得蚓激酶溶液进行冷冻干燥，得到蚓激酶；本发明对所述冷冻干燥没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。
44.得到上清液后，本发明将所述上清液进行减压蒸馏后，将所得残液与匀浆所得蚯蚓残渣混合后，进行发酵，得到生态肥料。在本发明中，所述上清液包括水、乙醇和无法盐析的蛋白质。
45.在本发明中，所述减压蒸馏的温度优选为50～60℃，更优选为55～57℃。本发明进行减压蒸馏的同时回收无水乙醇。
46.完成所述减压蒸馏后，本发明将所得残液(膜过滤截留的分子量大于50kd的蛋白溶液)与匀浆所得蚯蚓残渣混合，送入封闭容器中密闭；维持密闭容器常压状态，通过减压
阀泄压，进行发酵，得到生态肥料。
47.在本发明中，所述密闭容器优选为发酵罐；所述发酵的温度优选为30～35℃，更优选为33℃；时间优选为10～15天，更优选为12天；所述发酵优选在无氧密闭条件下进行。
48.在所述发酵过程中，在缺氧条件下，蚯蚓残渣与残液中蛋白溶液发酵形成酵素。
49.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
50.以下实施例中，膜过滤所用平板膜的截留分子量为50kd，所用蛋白分离设备来源于青岛富勒姆公司；
51.所用蛋白纯化装置为上海闪谱制造的蛋白纯化装置，分离柱为sephadexg-50。
52.实施例1
53.采用ph＝7.8的碳酸氢钾-醋酸铵缓冲溶液浸泡蚯蚓40min后，用匀浆机在25000rpm匀浆4min；
54.将匀浆后溶液进行离心，取上清液转移至抽滤瓶中抽滤，所得蚯蚓残渣留存；
55.将抽滤后的溶液进行膜过滤，得到蛋白质分子量为50kd以下的蛋白溶液；
56.将所述蛋白溶液与无水乙醇按照体积比1:2混合，进行盐析，得到盐析物和上清液；
57.将所得盐析物与ph＝7.8的碳酸氢钾-醋酸铵缓冲溶液按照质量比1:10进行溶解；将溶解后的溶液通过蛋白纯化装置分离出大于20kd分子量的蛋白质，将所得蚓激酶溶液冷冻干燥，得到蚓激酶粉末；
58.将盐析后所得上清液在55℃减压蒸馏，回收无水乙醇，将所得残液与上述抽滤后的蚯蚓残渣混合，送入发酵罐中无氧密闭发酵；维持发酵罐常压状态，通过减压阀泄压，在35℃发酵10天，得到生态肥料。
59.实施例2
60.采用ph＝7.8的碳酸氢钾-醋酸铵缓冲溶液浸泡蚯蚓50min后，用匀浆机在20000rpm匀浆5min；
61.将匀浆后溶液进行离心，取上清液转移至抽滤瓶中抽滤，所得蚯蚓残渣留存；
62.将抽滤后的溶液进行膜过滤，得到蛋白质分子量为50kd以下的蛋白溶液；
63.将所述蛋白溶液与无水乙醇按照体积比1:1.5混合，进行盐析，得到盐析物和上清液；
64.将所得盐析物与ph＝7.7的碳酸氢钾-醋酸铵缓冲溶液按照质量比1:100进行溶解；将溶解后的溶液通过蛋白纯化装置分离出大于20kd分子量的蛋白质，将所得蚓激酶溶液冷冻干燥，得到蚓激酶粉末；
65.将盐析后所得上清液在60℃减压蒸馏，回收无水乙醇，将所得残液与上述抽滤后的蚯蚓残渣混合，送入发酵罐中无氧密闭发酵；维持发酵罐常压状态，通过减压阀泄压，在30℃发酵15天，得到生态肥料。
66.实施例3
67.采用ph＝7.8的碳酸氢钾-醋酸铵缓冲溶液浸泡蚯蚓30min后，用匀浆机在
23000rpm匀浆3min；
68.将匀浆后溶液进行离心，取上清液转移至抽滤瓶中抽滤，所得蚯蚓残渣留存；
69.将抽滤后的溶液进行膜过滤，得到蛋白质分子量为50kd以下的蛋白溶液；
70.将所述蛋白溶液与无水乙醇按照体积比1:3混合，进行盐析，得到盐析物和上清液；
71.将所得盐析物与ph＝7.9的碳酸氢钾-醋酸铵缓冲溶液按照质量比1:50进行溶解；将溶解后的溶液通过蛋白纯化装置分离出大于20kd分子量的蛋白质，将所得蚓激酶溶液冷冻干燥，得到蚓激酶粉末；
72.将盐析后所得上清液在57℃减压蒸馏，回收无水乙醇，将所得残液与上述抽滤后的蚯蚓残渣混合，送入发酵罐中无氧密闭发酵；维持发酵罐常压状态，通过减压阀泄压，在33℃发酵12天，得到生态肥料。
73.蚓激酶活性测试
74.分别将1ml实施例1～3所得蚓激酶溶液加入干净的玻璃平皿中，再将保温于40℃的纤维蛋白原溶液与融化的琼脂糖溶液混合均匀，快速倒入添加蚓激酶的平皿中晃动混匀，室温放置1h即成，按照常规方法设置不同浓度的蚓激酶标准品溶液及样品溶液各10μl，分别点在同一个平皿中，加盖，置于37℃恒温箱中保温18h。取出后用游标卡尺测量溶圈相互垂直的两直径，以蚓激酶标准品单位数为横坐标，垂直两直径的乘积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。将样品蚓激酶溶液的垂直两直径之积代入回归方程，计算样品效价单位数。
75.结果表明，实施例1所获得的蚓激酶活性为30000iu/mg，实施例2所获得的蚓激酶活性为24000iu/mg，实施例3所获得的蚓激酶活性为27000iu/mg。
76.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，包括以下步骤：将蚯蚓浸泡于第一缓冲溶液后，进行匀浆，将所得匀浆物料进行膜过滤，得到蛋白溶液；将所述蛋白溶液与乙醇混合，进行盐析，得到上清液和盐析物；将所述盐析物与第二缓冲溶液混合，将所得混合液进行蛋白纯化后，冷冻干燥，得到蚓激酶；将所述上清液进行减压蒸馏后，将所得残液与匀浆所得蚯蚓残渣混合后，进行发酵，得到生态肥料；所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液均为碳酸氢钾-醋酸铵混合溶液；所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液的ph值独立为7.5～8.0。2.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液的ph值为7.8。3.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述浸泡的时间为30～60min。4.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述匀浆的转速为20000～25000rpm，时间为3～5min。5.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述膜过滤所用膜的截留分子量为50kd，所述蛋白溶液中蛋白分子量≤50kd。6.根据权利要求1或5所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述乙醇与蛋白溶液的体积比为(0.5～3):1。7.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述第二缓冲溶液与盐析物的质量比为(10～100):1。8.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述减压蒸馏的温度为50～60℃。9.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述发酵的温度为30～35℃，时间为10～15天。10.根据权利要求9所述的蚓激酶高效提取全资源化方法，其特征在于，所述发酵在无氧密闭条件下进行。

技术总结

本发明提供了一种蚓激酶高效提取全资源化方法，属于生物提取技术领域。本发明采用碳酸氢钾-醋酸铵结合乙醇盐析方法提取蚓激酶蛋白，碳酸氢钾与醋酸铵缓冲溶液提供的pH＝7.5～8.0的条件能够维持蚓激酶蛋白的高活性，提高提取率；乙醇能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低，乙醇与水的作用能破坏蛋白质的水化膜，蛋白质在乙醇中由于溶解度存在差异而分离析出，实现蚓激酶的高效提取分离；此外，本发明将蚓激酶提取后所得废液转化为液体肥，综合利用残余物质，解决了废液资源化利用难题，实现蚯蚓提取过程的绿环保和全资源化回收利用。蚓提取过程的绿环保和全资源化回收利用。