从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶A在化学法合成纳米硒形貌控制和稳定性影响中的用途

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从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a在化学法合成纳米硒形貌控制和稳定性影响中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术，特别涉及从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a在纳米硒形貌控制和稳定性影响中的用途。

背景技术：

2.硒是一种有效剂量和毒性试剂量之间差距较小的必需微量元素，稍微超过其必要的营养水平就会导致中毒，因此需要严格控制其使用量。然而，硒却不能在人和动物体内自然合成和储存，必需通过借助外界补充才能达到生物体内硒的动态平衡。长期以来，寻高效低毒的硒形态，成为国际研究的焦点。
3.纳米硒是一种纳米级尺寸的红单质硒，以其易吸收、低毒性等特点，领跑国际前沿。目前，纳米硒的制备方法主要有：物理法、化学法和生物法。迄今为止，人们极大关注的是生物法。据相关文献报道，在微生物合成的过程中存在较多的问题亟待解决，比如：生物源纳米硒的尺寸异质性、合成持续时间较长等。不同微生物合成的纳米硒结合不同生物活性的生物有机分子，其生物功能需要在多种情况下对其覆盖层中的生物大分子进行额外的分析和研究。利用化学法合成的纳米硒周期短，但很难控制纳米硒合成的形貌。因此，本发明针对此系列问题寻一种解决方法。

技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的是提供从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a在化学法合成纳米硒形貌控制和稳定性影响中的用途。
5.利用提取的蛋白酶a来研究其对化学法合成纳米硒的影响，对比加蛋白前后的纳米硒在酸碱盐、高温低温条件下的稳定性变化。
6.技术方案：从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a在化学法合成纳米硒形貌控制和稳定性影响中的用途。
7.进一步地，从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a的方法为：
8.(1)对酿酒酵母进行活化，制备活化种子液；
9.(2)将活化种子液接种含有亚硒酸钠的无机盐发酵培养基中进行发酵培养，5％亚硒酸钠溶液，收集发酵液；
10.(3)离心收集发酵液中上清，用硫酸铵沉淀法收集发酵液中的蛋白酶a。
11.进一步地，制备活化种子液的方法包括：从-80℃取出的酿酒酵母酵母于ypd固体平板进行划线，挑取单菌落于ypd液体培养基中，培养所得到的发酵液为活化种子液。
12.进一步地，所述的无机盐培养基质量分数配比为：4-8％葡萄糖、0.4-0.6％尿素、0.1-0.3％磷酸二氢钾、0.1-0.4％氯化钾、0.1-0.2％硫酸镁、0.02-0.04％氯化钙，余量为微量元素和维生素。
13.进一步地，所述的含有亚硒酸钠的无机盐发酵培养基中，亚硒酸钠的终浓度为：
100μg/ml。
14.进一步地，所述硫酸铵沉淀法沉淀蛋白过程中，加入硫酸铵，至饱和状态，搅拌，离心收集沉淀。
15.进一步地，化学法合成纳米硒所需的试剂按一定的比例配成溶液，方法为：亚硒酸钠溶液浓度为0.01-0.03mol/l，sds溶液浓度为1％-3％，抗坏血酸的浓度为0.07-0.21mol/l，按照比例混合，室温下反应。
16.进一步地，酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a对纳米硒形貌控制和稳定性影响的方法为：向利用化学法合成纳米硒中添加不同浓度的蛋白酶a，分析添加蛋白酶a前后的纳米硒形貌及在酸碱盐、高温低温条件下的稳定性变化。
17.进一步地，所述蛋白酶a浓度为0.0001-0.1mg/ml。
18.有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：本发明在化学法合成的纳米硒中加入蛋白酶a可以有效控制其形貌。本发明通过添加该蛋白可以有效地提高化学法合成纳米硒的稳定性，同时添加的蛋白获得纳米硒溶液呈鲜红，粒径在65nm左右，具有较高的生物活性及稳定性。
附图说明
19.图1提取蛋白酶a的sds-page蛋白电泳图；
20.图2合成纳米硒溶液稀释100倍后全波长扫描图；
21.图3合成的纳米硒在酸碱盐温度等条件下的全波长扫描图。
具体实施方式
22.实施例1：从酿酒酵母发酵液中提取蛋白酶a，包括如下步骤：
23.(1)配制ypd固体培养基g/l：蛋白胨20，酵母粉12，葡萄糖40，琼脂粉18；ypd液体培养基g/l：胰蛋白胨20，酵母粉12，葡萄糖40；配制发酵培养基g/l：葡萄糖60、尿素4、磷酸二氢钾2.2、氯化钾2、硫酸镁2.5、氯化钙0.3，微量元素及维生素；5g亚硒酸钠定容于100ml去离子水；过膜除菌，115℃高压灭菌15-20min；
24.(2)菌种活化，从-80℃取出酿酒酵母保菌管，进行平板划线，置于30℃恒温培养箱培养1.5-2天。挑取长势较好单菌落于50/250mlypd液体培养基中，28℃，200rpm培养20h，制备活化种子液；
25.(3)在发酵培养基中加入100μg/ml亚硒酸钠，将步骤(2)活化的种子液以8％接种量接种于加亚硒酸钠的发酵培养基中培养，28℃，200rpm培养48h；
26.(4)发酵结束后，收集发酵液。以10000rpm，离心15min收集上清。将上清液进行硫酸铵沉淀蛋白。该步骤全过程在冰上操作，在磁力搅拌器上边搅拌，边徐徐加入硫酸铵56.8g至饱和，继续搅拌2h，于4℃静置过夜，10000rpm，离心30min，收集沉淀，将沉淀悬浮于1.5倍体积的ph 7.0-7.4pbs缓冲液洗涤，离心出去不溶性杂质等，重复上述过程，收集上清即为蛋白溶液。
27.(5)将步骤(4)获得的蛋白，取16μl加4μl(5x loading buffer)，金属浴100℃，5min，14000rpm离心3min，取上清跑胶。如图1所示，与理论分子量一致，平均分子量为4499kda。
28.(6)将步骤(4)获得的蛋白溶液，采取bca试剂盒法进行蛋白浓度检测，通过作标准曲线，将蛋白溶液稀释10倍，测得最终蛋白浓度为5.137mg/ml。
29.实施例2：酿酒酵母发酵液中提取蛋白酶a对化学法合成纳米硒形貌的控制，包括如下步骤：
30.(1)亚硒酸钠溶液浓度为0.002mol/l，sds溶液浓度为0.2％，抗坏血酸的浓度为0.014mol/l。
31.(2)将实验例1所得的蛋白质按一定的浓度梯度加入到化学法合成的纳米硒中，蛋白的浓度梯度为(mg/ml)：0.0001、0.001、0.01、0.1。
32.(3)将步骤(1)配制好溶液，按照1∶1比例加入到10ml ep管中，反应终体积为5ml，在室温(25℃)下反应1h；测全波长扫描；
33.(4)将步骤(1)配制好溶液，按照1∶1比例加入到10ml ep管中，随后加入步骤(2)的蛋白浓度，反应终体积为5ml，在室温(25℃)下反应1h；
34.(5)将步骤(4)所得纳米硒溶液，不加蛋白的纳米硒全波长扫描图如图2。将不加蛋白和加不同浓度蛋白合成的纳米硒溶液，稀释10倍进行纳米粒径检测，结果如表1。通过粒径结果显示，当蛋白浓度为0.01mg/ml时，纳米硒的粒径为65.72nm。因而，可以得出的结论是，蛋白浓度越高，并非其粒径越小，而是需要选择较为适宜的蛋白浓度，才能合成最佳粒径大小的纳米硒。
35.表1：不同蛋白浓度对化学法合成纳米硒大小的影响
[0036][0037]
实施例3：通过从酿酒酵母发酵液中提取蛋白酶a对化学法合成纳米硒酸碱盐稳定性的研究，包括如下步骤：
[0038]
(1)选择实验例2中最佳的条件下，合成蛋白酶a纳米硒复合体进行稳定性研究；
[0039]
(2)配制2m氯化钠溶液、0.2m氯化钙溶液、0.2m氯化镁、2m盐酸、2m氢氧化钠溶液；
[0040]
(3)在步骤(1)中蛋白纳米硒复合体溶液中加入氯化钠溶液(mm)：1、10、100、1000，常温25℃下，反应1h，测全波长扫描。
[0041]
(4)在步骤(1)中蛋白纳米硒复合体溶液中加入氯化钙溶液(mm)：0.1、1、10、100，常温25℃下，反应1h，测全波长扫描；
[0042]
(5)在步骤(1)中蛋白纳米硒复合体溶液中加入氯化镁溶液(mm)：0.1、1、10、100，常温25℃下，反应1h，测全波长扫描；
[0043]
(6)在步骤(1)中蛋白纳米硒复合体溶液中加入盐酸(mm)：1、10、100、1000，常温25℃下，反应1h，测全波长扫描；
[0044]
(7)在步骤(1)中蛋白纳米硒复合体溶液中加入氢氧化钠溶液(mm)：1、10、100、1000，常温25℃下，反应ih，测全波长扫描；
[0045]
由本实施例所述纳米硒酸碱盐的稳定性实验，全波长扫描如图3所示。纳米硒的全
波长扫描下，基于空白样品和处理样品在265nm处的消光比进行量化。消光比＝空白样品/处理样品，当消光比大于1时，表明纳米硒发生氧化或聚集。由图2可以看出，加蛋白的纳米硒可以提高其在0.1m氯化钙、0.1m氯化镁、1m盐酸、1m氢氧化钠下的稳定性。因而，在表面结合蛋白可以降低聚集水平，但不能完全阻止其聚集。
[0046]
实施例4：通过从酿酒酵母发酵液中提取蛋白酶a对化学法合成纳米硒温度稳定性的研究，包括如下步骤：
[0047]
(1)选择实验例2中最佳的条件下，合成蛋白酶a纳米硒复合体进行稳定性研究；
[0048]
(2)在步骤(1)中蛋白纳米硒复合体溶液置于不同的温度(-80、-20、4、25、37、60、100℃)，反应1h，测全波长扫描。
[0049]
由本实施例所述纳米硒温度稳定性实验，其全波长扫描如图3所示(见实验例3分析方法)，结合蛋白的纳米硒比未结合蛋白的纳米硒在-80℃和100℃条件下更稳定。

技术特征：

1.一种从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a在化学法合成纳米硒形貌控制和稳定性影响中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a的方法为：(1)对酿酒酵母进行活化，制备活化种子液；(2)将活化种子液接种含有亚硒酸钠的无机盐发酵培养基中进行发酵培养，5％亚硒酸钠溶液，收集发酵液；(3)离心收集发酵液中上清，用硫酸铵沉淀法收集发酵液中的蛋白酶a。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：制备活化种子液的方法包括：从-80℃取出的酿酒酵母于ypd固体平板进行划线，挑取单菌落于ypd液体培养基中，培养所得到的发酵液为活化种子液。4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的无机盐培养基质量分数配比为：4-8％葡萄糖、0.4-0.6％尿素、0.1-0.3％磷酸二氢钾、0.1-0.4％氯化钾、0.1-0.2％硫酸镁、0.02-0.04％氯化钙，余量为微量元素和维生素。5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的含有亚硒酸钠的无机盐发酵培养基中，亚硒酸钠的终浓度为：100μg/ml。6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述硫酸铵沉淀法沉淀蛋白过程中，加入硫酸铵，至饱和状态，搅拌，离心收集沉淀。7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：化学法合成纳米硒所需的试剂按一定的比例配成溶液，方法为：亚硒酸钠溶液浓度为0.01-0.03mol/l，sds溶液浓度为1％-3％，抗坏血酸的浓度为0.07-0.21mol/l，按照比例混合，室温下反应。8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶a对纳米硒形貌控制和稳定性影响的方法为：向利用化学法合成纳米硒中添加不同浓度的蛋白酶a，分析添加蛋白酶a前后的纳米硒形貌及在酸碱盐、高温低温条件下的稳定性变化。9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述蛋白酶a浓度为0.0001-0.1mg/ml。

技术总结

本发明公开了从酿酒酵母发酵液中提取的蛋白酶A在化学法合成纳米硒形貌控制和稳定性影响中的用途，活化种子液接种到无机盐发酵培养基中进行发酵，添加亚硒酸钠等溶液胁迫，促使蛋白酶A大量分泌到胞外，用硫酸铵沉淀法收集蛋白；在利用化学法(亚硒酸钠、抗坏血酸和十二烷基硫酸钠)合成纳米硒中添加不同浓度的蛋白酶A，研究蛋白对纳米硒形貌的影响，同时对比加蛋白前后的纳米硒在酸碱盐、高温低温条件下的稳定性变化。本发明通过添加该蛋白可以有效地提高化学法合成纳米硒的稳定性，同时添加蛋白酶A获得纳米硒溶液呈鲜红，粒径在65nm左右，具有较高的生物活性及稳定性。具有较高的生物活性及稳定性。具有较高的生物活性及稳定性。