基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法

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1.本发明涉及一种静电纺丝制备的外科贴剂，特别是涉及一种基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法。

背景技术：

2.蒙医药是中国医药学中宝贵的财富，历史悠久，传承至今。蒙古族先民在长期同疾病的斗争中总结出了一系列的经验教训，积累了丰厚的医疗知识。尤其在骨伤，外伤方面尤为擅长。蒙药消肿九味散是一种常用的消肿、止痛外用药。消肿九味散由京大戟、大黄、翻白草、玉竹、姜黄、水菖蒲、生草乌、天门冬、亚大黄组成。具有退热，消肿，止痛的功效。用于急性腮腺炎，乳腺炎，软组织损伤，疖肿，痈肿，蜂窝组织炎，急性淋巴管炎，淋巴结炎，皮下及深部脓肿，丹毒，无名肿毒，红肿热痛，风湿寒痹，关节疼痛。显著的效果使得其在外伤中应用广泛。但是使用方法较为单一。
3.现有技术cn114306710a文献公开了一种医用敷料及其制备方法。医用敷料由伤科黄水和聚乙烯醇经过静电纺丝得到。伤科黄水是中医院骨伤科的洗剂，原料药有黄连、黄柏、栀子、紫草、薄荷和白矾等。制法是将聚乙烯醇溶解于伤科黄水中，得到纺丝液；将所述纺丝液进行静电纺丝，得到医用敷料。但是，本发明所用蒙药消肿九味散是散剂，该文献所用中药，虽然也是伤科药，却是可以将聚乙烯醇溶解于其中的水剂。而特别是该现有技术的制备方法是将聚乙烯醇溶解于伤科黄水中，得到纺丝液。因为蒙药消肿九味散与该现有技术药相比，剂型不同，药物组份及药性又有显著区别，因此，该现有文献技术不能简单转用在蒙药消肿九味散上，仍然需要本领域技术人员研究适合蒙药消肿九味散的贴剂。

技术实现要素：

4.本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂，本发明还涉及其制备方法。
5.为实现上述目的，本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂，其特别之处在于使用由下列重量份的聚乙烯醇10、消肿九味散1-5、和适量表面活性剂及去离子水配制成纺丝溶液经静电纺丝而成的载药纳米纤维药物储库。经实验证明，上述区别技术取得的载药纳米纤维药物储库依静电纺丝方法能制成消肿止痛蒙药贴剂，并具有消肿九味散样的药效，但只适用于非开放性创口。也就是面对开放性创口时，渗出的组织液会令纤维膜无法保持完整性。
6.作为优化，所述表面活性剂为0.05-0.5重量份的十二烷基硫酸钠。
7.作为优化，去离子水为50-150重量份；贴剂是将静电纺丝得到的载药纳米纤维药物贮库裁成块，粘到背衬层上，使用防粘层覆盖而成。静电纺丝是溶液在注射器尖端形成泰勒锥，由电场力牵引、拉伸，在空气中溶剂蒸发，最后在接收板得到纳米纤维，干燥后即为药物贮库。工作时，导电高分子聚合物溶液在针尖汇聚成液滴，在电场作用下，液滴逐渐变为锥形，即为泰勒锥。随后在电场中由电场力牵引，拉伸，随着溶剂的不断蒸发，成为纤维，落
在接收板。
8.作为优化，纺丝溶液是聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠放入容器中，加入去离子水，室温浸润后90℃下搅拌多个小时；冷却至室温后，加入消肿九味散，室温搅拌均匀而成。作为优化，室温浸润是室温下放置30min，搅拌多个小时是搅拌3h，室温搅拌是室温搅拌12h。
9.作为优化，载药纳米纤维药物储库室温下使用戊二醛蒸汽交联制成防水性载药纳米纤维药物储库。能显著增加防水性能。使用戊二醛进行交联，提升耐水性，以保证在体外汗液，体液的侵蚀下依旧保持完整性和药用性。本发明外敷的长效药物，通过前述戊二醛交联后具有了一定的生物稳定性。
10.本发明所述基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂的制备方法是载药纳米纤维药物储库由下列重量份的聚乙烯醇10、消肿九味散1-5、和适量表面活性剂及去离子水配制成纺丝溶液经静电纺丝而成；纺丝溶液是聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠放入容器中，加入去离子水，室温浸润后90℃下搅拌多个小时；冷却至室温后，加入消肿九味散，室温搅拌均匀而成。
11.作为优化，室温浸润是室温下放置30min，搅拌多个小时是搅拌3h，室温搅拌是室温搅拌12h。静电纺丝是溶液在注射器尖端形成泰勒锥，由电场力牵引、拉伸，在空气中溶剂蒸发，最后在接收板得到纳米纤维，干燥后即为药物贮库。工作时，导电高分子聚合物溶液在针尖汇聚成液滴，在电场作用下，液滴逐渐变为锥形，即为泰勒锥。随后在电场中由电场力牵引，拉伸，随着溶剂的不断蒸发，成为纤维，落在接收板。所述表面活性剂为0.05-0.5重量份的十二烷基硫酸钠。载药纳米纤维药物储库室温下使用戊二醛蒸汽交联成防水性。
12.采用上述技术方案后，本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法具有能避免在纤维中出现粘连，珠串的结构，纤维形貌良好，不但，适用于非开放性创口，交联后也能适用于开放性创口，提升耐水性，改剂后能辅助药物达到长期作用效果的优点。
附图说明
13.图1是本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法不加消肿九味散的对照例及第一至三种实施方式的载药纳米纤维药物储库实物照片。图2是本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的对照例及第一至三种实施方式的交联载药纳米纤维药物储库实物的扫描电子显微镜及其纤维直径显微照片。图3是聚乙烯醇及本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式的载药纳米纤维药物储库实物和消肿九味散的红外光谱图。图4-9分别是本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的对照例及第三种实施方式的交联0h，24h，48h，72h，96h，120h的载药纳米纤维药物储库实物的扫描电镜及数值分析图。图10是本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联前后的载药纳米纤维药物储库红外光谱图。图11是本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后以及缓冲液浸泡后和浸泡又冷冻干燥后的载药纳米纤维药物实物照片。图12是本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后的载药纳米纤维药物以及不加含药的阴性纳米纤维和姜黄的乙醇溶液的谱分析图。图13是本发明不加含药的阴性纳米纤维的姜黄素标准曲线分析图。图14是本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后的载药纳
米纤维药物以医用胶带作为背衬层以去离子水润湿的贴剂使用中及使用后的手背部照片。图15是本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后的载药纳米纤维药物以水和薄荷醇的润湿，加入了丙二醇，丙三醇提高粘度，在不使用医用胶带的情况下的贴剂使用中及使用后的手背部照片。图16是本发明所用消肿九味散与本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后的载药纳米纤维药物库qc样本正负离子模式的相关分析图。图17是本发明所用消肿九味散与本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后的载药纳米纤维药物库主成份的正负离子模式分析图。图18是本发明所用消肿九味散与本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后的载药纳米纤维药物库排序验证的正负离子模式分析图。图19是本发明所用消肿九味散与本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后的载药纳米纤维药物库正负离子模式的差异代谢物的聚类热图。图20是本发明所用消肿九味散与本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法的第三种实施方式交联后的载药纳米纤维药物库正负离子模式的kegg富集气泡图。
具体实施方式
14.如图1所示，实施例一，本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂使用由下列重量份的聚乙烯醇10克、消肿九味散1克、十二烷基硫酸钠0.05克、去离子水50克配制成纺丝溶液经静电纺丝而成的载药纳米纤维药物储库。
15.纺丝溶液是聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠放入容器中，加入去离子水，室温放置30min后90℃下搅拌3小时；冷却至室温后，加入消肿九味散，室温搅拌12h而成。
16.静电纺丝是溶液在注射器尖端形成泰勒锥，由电场力牵引、拉伸，在空气中溶剂蒸发，最后在接收板得到纳米纤维，干燥后即为药物贮库。
17.贴剂是将静电纺丝得到的载药纳米纤维药物贮库裁成块，粘到背衬层上，使用防粘层覆盖而成。更具体是将静电纺丝得到的药物贮库裁成2cm
×
2cm的方块，粘到医用胶带(4cm
×
4cm)上，使用pet防粘层(4cm
×
4cm)覆盖，既得贴剂。
18.如图1所示，实施例二，本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂使用由下列重量份的聚乙烯醇10克、消肿九味散3、十二烷基硫酸钠0.3、去离子水100克配制成纺丝溶液经静电纺丝而成的载药纳米纤维药物储库。
19.纺丝溶液是聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠放入容器中，加入去离子水，室温放置30min后90℃下搅拌3小时；冷却至室温后，加入消肿九味散，室温搅拌12h而成。
20.静电纺丝是溶液在注射器尖端形成泰勒锥，由电场力牵引、拉伸，在空气中溶剂蒸发，最后在接收板得到纳米纤维，干燥后即为药物贮库。
21.贴剂是将静电纺丝得到的载药纳米纤维药物贮库裁成块，粘到背衬层上，使用防粘层覆盖而成。更具体是将静电纺丝得到的药物贮库裁成2cm
×
2cm的方块，粘到医用胶带(4cm
×
4cm)上，使用pet防粘层(4cm
×
4cm)覆盖，既得贴剂。
22.如图1所示，实施例三，本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂使用由下列重量份的聚乙烯醇10克、消肿九味散5克、十二烷基硫酸钠0.5克、去离子水150克配制成纺丝溶液经静电纺丝而成的载药纳米纤维药物储库。
23.纺丝溶液是聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠放入容器中，加入去离子水，室温放置30min后90℃下搅拌3小时；冷却至室温后，加入消肿九味散，室温搅拌12h而成。
24.静电纺丝是溶液在注射器尖端形成泰勒锥，由电场力牵引、拉伸，在空气中溶剂蒸发，最后在接收板得到纳米纤维，干燥后即为药物贮库。
25.贴剂是将静电纺丝得到的载药纳米纤维药物贮库裁成块，粘到背衬层上，使用防粘层覆盖而成。更具体是将静电纺丝得到的药物贮库裁成2cm
×
2cm的方块，粘到医用胶带(4cm
×
4cm)上，使用pet防粘层(4cm
×
4cm)覆盖，既得贴剂。
26.所述制备是：制备纺丝前驱体溶液，首先使用天平精密称取pva(聚乙烯醇)，sds(十二烷基硫酸钠)(少量加入sds易于纺丝)加入到超纯水中混合，放入磁力搅拌水浴锅升温到90℃磁力搅拌3h，制得的pva水溶液。待溶液温度降至室温，按照pva:m＝10:0、10:1、10:3、10:5(质量比)在溶液中分别加入消肿九味散，当加入量超过pva:m＝10:5(质量比)时，溶液中出现沉淀无法溶于纺丝液，常温磁力搅拌12h，以确保散剂完全溶解并与pva混合均匀。将得到的纺丝溶液静置脱泡以用于静电纺丝。载药纳米纤维膜的制备首先将制得的纺丝液注入到5ml医用注射器中，保证注射器中没有气泡，放入推进器内，手动调节注射器所在位置。之后裁剪好一块铝箔，固定在电纺设备的接收端，针头对准铝箔的正中位置摆放。旋转调节微量定量泵的推进速度为0.8mlh-1
，使用20#市售金属不锈钢平头针头，针头与收集版的间距为16cm，施加电压为17kv，纺丝时间约为5h。针尖处的高分子液滴在高压电场作用下牵引拉伸，空气中溶剂蒸发，在收集版上堆积得到纳米纤维。纤维在40℃鼓风干燥箱中2h，装入自封袋内编号。如图1，为制得载药纳米纤维膜实物图。
27.载药纳米纤维膜的形貌表征：(1)扫描电子显微镜(sem)。使用扫描电子显微镜(sem)观察制得的载药纳米纤维膜，电子束加压为20kv，选择所拍照片的放大倍数分别为3000，5000，10000，20000倍。在每张所得照片中不同的位置选择50条纤维，使用image proplus 6.0分析纤维的直径，将得到的数据使用excel计算纤维直径的算数平均值及标准差sd，所得数据使用origin 8.0作纤维频率分布直方图。根据纤维形貌，结合纺丝液及实际纺丝情况得出最适合的抗炎散剂加入量以备接下来交联使用。载药纳米纤维膜扫描电镜(sem)分析：纳米纤维形貌与很多因素有关，如静电纺丝溶液的黏度，电导率，表面张力等，纺丝过程中的参数如电压，温度，接受距离，湿度等都有影响。
28.图2为不同消肿九味散加入量下的电镜照片。pva溶解得到的8wt％溶液中不加入抗炎蒙药散剂时，溶液透明，电镜照片下可以观察到均匀光滑的纳米纤维。前驱体纺丝液中加入消肿九味散后，溶液变黄，随着加入的量逐渐由10:0增加到10:5时，纺丝得到的载药纳米纤维直径也由176
±
31nm逐渐增加到了235
±
50nm。纤维直径增大的原因一方面是加入量增大的同时溶液进给速度不变，溶剂蒸发后所留下的纤维自然会变粗，另一方面是加入了更多的溶质，溶液黏度增大而施加电压不变，这会导致纤维在电场中克服表面张力和被电场力拉伸鞭动变的更加困难，也就导致了纤维变得更粗。
29.(2)红外光谱分析(ft-ir)，将消肿九味散与溴化钾(约80～100mg)在研钵中均匀混合，装入模具内压片法制备消肿九味散样品，纤维样品采用atr法观测。使用傅里叶变换红外光谱仪(ft-ir)对散剂加入前后pva:m＝10:0，pva:m＝10:5两种纤维及消肿九味散做结构表征及对比，波数范围为500cm-1
～4000cm-1
。
30.图3为载药纳米纤维膜的红外光谱分析，pva中主要由羟基和醋酸乙烯酯官能团，
存在着大量的-oh，在3450cm-1
处的吸收峰归因于o-h的振动，1238cm-1
处的吸收峰则为o-h面内弯曲振动，1107cm-1
处吸收峰为c-o伸缩振动，1715cm-1
处是由c＝o引起的特征吸收峰。载药纳米纤维膜(m+pva)与消肿九味散(m)均在2940cm-1
处出现一处吸收峰，而在pva中并未出现，可能是由于药物的加入引起的甲基或亚甲基吸收峰。
31.载药纳米纤维膜的交联:使用上述方法制备pva:m＝10:5的载药纳米纤维。取10ml25％戊二醛水溶液放入玻璃干燥器下层，将制备的pva:m＝10:5(质量比)的载药纳米纤维膜放置在上层，室温下使用戊二醛蒸汽交联。交联的时间分别设定为24h，48h，72h，96h，120h，将交联的纤维取出放入鼓风干燥箱中40℃干燥2h，随后放入到自封袋内编号。上述五种实例结果的扫描电子显微镜数值分析图，分别参见图4-9。
32.交联载药纳米纤维膜的形貌表征有:扫描电子显微镜(sem)。将得到的交联载药纳米纤维膜喷金后使用扫描电子显微镜(sem)观察，根据纤维形貌情况，得出最适合的交联时间。(2)红外光谱分析(ft-ir)。使用傅里叶变换红外光谱仪(ft-ir)对pva:m＝10:5(质量比)的载药纳米纤维膜及交联后的pva:m＝10:5(质量比)载药纳米纤维膜做结构表征及对比。波数范围500cm-1
～4000cm-1
。(3)吸水率与溶失率测试。将交联96h后的pva:m＝10:5(质量比)载药纳米纤维膜裁成2cm
×
2cm的小块后称重，做三个平行样品，得到结果计算平均值。首先称取初始重量w1。记录后完全浸泡到pbs磷酸盐缓冲溶液中，24h后取出纤维膜，用滤纸吸去表面多余的水分至看不到明显的水渍，称重记为w2。使用冷冻干燥机冷冻干燥12h，称重记为w3。计算吸水率及溶失率。计算方法如下。
[0033][0034]
不同抗炎蒙药散剂加入量的纤维直径分析表如下
[0035][0036]
交联载药纳米纤维膜扫描电镜(sem)分析：纺丝参数为溶液进给速率0.8mlh-1
，纺丝电压17kv，接受距离为16cm，在此情况下得到的纤维均匀光滑，纺丝效果较好。不同的交联时间的电镜照片及纤维直径分布直方图如图4-9所示，分别使用戊二醛蒸汽交联0h，24h，48h，72h，96h，120h。纤维出现了溶胀的现象，随着交联时间的增加，载药纳米纤维的溶胀度也在逐渐增大，但是增大的速度逐渐变小，表现在直径的变化235
±
50nm，291
±
35nm，298
±
56nm，333
±
35nm，345
±
46nm，353
±
60nm逐渐增大，增速变缓，如表2-4。
[0037]
不同交联时间的纤维直径分析表
[0038][0039]
交联载药纳米纤维膜的红外光谱分析：pva中存在着大量的羟基，在交联过程中，
戊二醛中的醛基与羟基发生缩醛反应，产生新的醚键
[77]
。为了确定戊二醛蒸汽交联的进行，对交联前后的纤维使用了红外光谱分析法进行表征，结果如图10所示，pva+m为pva:m＝10:5(质量比)纤维的红外图谱，pva+m交联为pva:m＝10:5(质量比)纤维交联后的红外图谱，图内出现在3439cm-1
处的吸收峰为o-h的振动，1246cm-1
处的吸收峰为o-h面内弯曲振动，1096cm-1
处吸收峰为c-o伸缩振动，1728cm-1
处则是由c＝o引起的特征吸收峰
[75
,
76]
。在3439cm-1
处，可以明显的观察到交联后羟基的吸收峰变得平滑且有所下降，这是由于戊二醛中的醛基与pva中的羟基发生了缩醛反应消耗了羟基。而c-o-c的伸缩振动使得1069cm-1
处出现了新的吸收峰，即为产生的醛键，证明了交联的成功。
[0040]
吸水率及溶失率：开放性创会口渗出组织液，需要药物具有较好的吸水性。交联后的电纺纤维具有较高的吸水性可以解决这个问题。未交联的纤维膜会在pbs中迅速溶解消失，交联96h含有消肿九味散pva:m＝10:5(质量比)的纳米纤维载药膜在pbs缓冲溶液中浸泡24h并冷冻干燥后，得到溶胀及干燥后的实物照片如图11。交联处理后，纤维膜上的亲水基团减少，纤维膜也因此变得更加致密，耐水性大大增强。在24h后依然可以保持膜状。三个平行样品测得的结果表明在交联96h后，载药纳米纤维膜的吸水率可以达到550％，溶失率为41.4％，结果下表。
[0041]
吸水率溶失率分析表
[0042][0043]
总之是制备了载药纳米纤维膜，并使用戊二醛蒸汽交联法使其具有一定耐水性。
[0044]
(1)首先制备了不同含量蒙药抗炎散剂的载药纳米纤维膜，随着散剂加入量的逐渐增多，宏观表现为从不加入时的颜为白，逐渐加深到浅黄最终变为黄，多于pva:m＝10:5(质量比)时，溶液中出现不溶物，不适合纺丝。扫描电子显微镜(sem)的结果表明，散剂的加入使pva纤维直径变粗，从不加入时的176
±
31nm逐渐增粗到235
±
50nm，在加入量为pva:m＝10:5(质量比)时，纤维依然保持着均匀光滑。傅里叶红外光谱分析(ft-ir)的结果表明药物存在于载药纤维膜中。为了得到散剂载入量尽可能大的纳米纤维膜，最终确定散剂加入量为pva:m＝10:5(质量比)。
[0045]
(2)使用25％戊二醛水溶液蒸汽交联载药纳米纤维，纤维的耐水性大大增强，探究了纤维膜交联后的结构变化。扫描电子显微镜(sem)的结果显示交联的时间越长，纤维直径越粗，但是增速变缓，在96h后达到345
±
46nm，与交联120h相比差别很小。因此交联时间选择96h。傅里叶红外光谱分析(ft-ir)的结果表明了交联反应的进行，pva中大量的羟基与戊二醛溶液中的醛基发生缩醛反应，生成了醚键，减少了亲水性的羟基，同时纤维膜更加致密，这也解释了耐水性的增强的原因。使用与人体体液环境类似的pbs溶液浸泡载药纳米纤维膜，模拟出了人体伤口组织液对纤维膜的侵蚀行为，在24h后纤维膜有溶失，但依然保持着膜状。纳米纤维有着极高的孔隙率和比表面积，经测试得出吸水率为550％，溶失率为41.4％。制得载药纳米纤维膜为后续的药物含量测定和制备完整的贴剂打下了基础。
[0046]
本发明药中姜黄素的含量测定。(1)柱温的确定。在柱温为25℃，30℃，40℃时得到的理论板数，分离度及峰面积积分值如下表所示。
[0047]
姜黄素随柱温变化结果表
[0048][0049]
从上表可知，在不同的柱温下，保留时间略有差异，但是分离度几乎不变，理论板数随时间增长有降低趋势，总体变化不大，故本实验研究选择柱温为25℃。
[0050]
(2)提取效率考察。不同时间超声处理提取的供试品溶液峰面积积分值及姜黄素含量结果如下表所示(超声处理50min后溶液出现浑浊，取上清液测试)。
[0051]
不同超声时间的考察结果表
[0052][0053]
从表中数据可见，对比超声处理20min、30min、40min及50min，超声处理40min后，姜黄素的含量最高，故确定超声时间设定为40min。
[0054]
(3)专属性考察。姜黄素对照品，供试品及阴性对照的结果如图12所示。供试品即为包含有姜黄的交联载药纤维膜，阴性对照为不含有姜黄的交联载药纤维膜，对照品为姜黄素的乙醇溶液。从图中可见，含有姜黄药材的供试品在对照品谱保留时间相同位置上有谱峰出现，分离效果好，阴性对照品在与姜黄素对照品谱保留时间相同的位置上无谱峰出现，表明该测定方法专属性好。(4)线性考察。以姜黄素进样量为横坐标，姜黄素峰面积积分值为纵坐标进行回归分析，绘制姜黄素标准曲线，如图13。姜黄素在20ng-300ng范围内复合线性关系式：y＝0.1448 x-0.1717，相关系数为r2＝1，具有良好的线性关系，因此可以用于姜黄素的含量测定。(5)精密度考察。根据姜黄素峰面积积分值计算出姜黄素含量，并计算6份样品平均含量及相对标准偏差(rsd)如下表。
[0055]
姜黄素重复性试验结果表
[0056][0057]
从上表可以看出，测定6次，姜黄素的平均含量为0.1023mgg-1
，rsd为2.89％，符合药典要求，说明精密度良好。(6)准确度考察。根据姜黄素峰面积积分值计算出姜黄素含量，并计算6份样品回收率及平均回收率及相对标准偏差，结果如下表所示。
[0058]
姜黄素加样回收试验表
[0059][0060]
如上表所示，测得姜黄素平均回收率101.1％，rsd为8.5％，准确度好。(7)范围考察。根据姜黄素峰面积积分值分别计算出高、低浓度点6份样品的回收率，平均回收率及rsd，如下两表所示。
[0061]
范围考察结果表(高浓度)
[0062][0063]
范围考察结果表(低浓度)
[0064][0065]
由以上两表可知，低浓度(含量限度的70％)时，6份样品的平均回收率为90.18％，rsd为8.4％。由表3-8可知，高浓度(含量限度的150％)时，6份样品的平均回收率为104.7％，rsd为4.2％，测定范围在含量限度的70％-150％之间符合药典规范。
[0066]
(8)耐用性试验。分别使用thermo hypersil gold c18 250
×
4.6mm 5μm反向柱、shimadzu c18 250
×
4.6mm 5μm反向柱，分离度，含量及相对偏差如下表。
[0067]
不同谱柱的耐用实验表
[0068][0069]
两个样品分别使用不同厂家，不同牌号的谱柱得出的数据如上表所示，分离度及根据峰面积计算出的姜黄素含量差别不大，相对偏差分别为6.86％，6.42％。结果表明，建立的方法适用范围广，且结果差异不大。
[0070]
(9)稳定性试验。同一供试品溶液在制备后不同时间下的峰面积积分值如下表所示。
[0071]
不同时间测定姜黄素的峰面积积分值表
[0072][0073]
从上表数据可见，两次实验在24小时内姜黄素面积积分值基本稳定不变，经过24h后峰面积积分值rsd分别为0.68％和0.6％，稳定性较好。
[0074]
(10)供试品含量测定结果。通过测定峰面积计算平均含量，姜黄转移率，结果如下两表所示。
[0075]
样品中姜黄素含量测定结果表1
[0076][0077]
姜黄药材含量及成药转移率表2
[0078][0079]
从上表1中多批样品测定的数据可见，姜黄素含量均在0.03mgg-1
以上。上表2不同批次之间，新型蒙药消炎制剂制备过程中姜黄素的转移率分别为44.2％和42.4％，差异变化不大。使用的姜黄药材按《中国药典》2015版第一部“姜黄”项下测定姜黄药材中姜黄素量为0.24％，按平均转移率43.3％计算，本品中姜黄素含量低限应为0.0123mgg-1
。
[0080]
制剂。将制备好的贴剂贴在手背，评价了贴剂的使用情况，选出功能最完备同时使用体验最好的方案。
[0081]
方案一、如图14，不使用传统的压敏胶作为药物贮库，使用去离子水润湿。以医用胶带作为背衬层，粘贴效果较为牢固，但同时透气效果差，并且在清理时有痛感，出现红肿。
[0082]
方案二、如图15，引入了含有水，薄荷醇的润湿液，润湿24h后，纤维表面依然湿润，加入了丙二醇，丙三醇提高粘度，在不使用医用胶带的情况下，贴剂也可以粘在皮肤上保持3h以上。
[0083]
总上，建立了新型蒙药消炎制剂中姜黄素的高效液相谱测定法。谱条件为：thermo hypersil gold c18反相柱(250
×
4.6mm 5μm)，乙腈：水(含4％冰醋酸)＝48:52为流动相，流速设定1mlmin-1
，进样量为10μl，检测波长434nm，uv紫外灯。在此条件下，进行了方法学验证，并完成了含量测定，制备了消炎制剂的模型。
[0084]
(1)分别对不同柱温，不同超声处理时间的情况做出对比，得出最佳的柱温为25℃，最佳的超声时间为40min。在此基础上，绘制药物的标准曲线，对精密度，准确度，耐用性，稳定性做出了评价，均符合药典规范。经测试，姜黄素含量均在0.03mgg-1
以上。不同批次药物制剂姜黄素转移率差别较小，姜黄素含量为0.24％，含量低限应为0.0123mgg-1
。
[0085]
(2)方案一中医用胶带缺点较为明显，过大的粘性使得换药清理时会损伤皮肤，痛感明显，如果用于开创性伤口，将会造成二次伤害。因为使用水为润湿液，水的蒸发较快，不能起到长时间起到润湿皮肤，并释放药物的作用。方案二使用的润湿液有清凉止痛，促透的作用，同时具有一定粘性，实际使用中可以粘住皮肤长达3h以上，不易脱落，操作简单。在换药清理时，不会损伤皮肤，相较于方案一更适合临床应用。
[0086]
制备出完整的抗炎贴剂并得出药物的成药转移率和含量低限后，根据非靶向代谢组学分析差异代谢物主要富集路径，为抗炎贴剂提供理论依据。
[0087]
非靶向药物代谢组分析。依据液质联用(lc-ms)法可以对生物体内所有的代谢物进行定量分析，本章实验根据lc-ms技术得出的数据结果进行分析，得出在制备的新型抗炎制剂中具有抗炎活性的重要代谢物所参与的关键生物学途径。
[0088]
实验方法。为进一步探究抗炎散剂与抗炎贴剂功效差异的重要代谢物与生物学过程之间的相关性，实验选用一组6份抗炎散剂，每份300mg，一组6份抗炎贴剂，每份300mg，共两组12份样本，在干冰包裹下运输到北京诺禾致源科技股份有限公司，样本收到后，立即保存在-80℃低温冰箱中，直至实验检测。
[0089]
谱柱选用hyperil gold column(c18)，柱温40℃，流动相的流速设定为0.2mlmin-1
，在正离子模式下，流动相a为0.1％甲酸，流动相b为甲醇；负离子模式下，流动相a为5mm醋酸铵，流动相b为甲醇，梯度洗脱。扫描范围选择m/z70-1050；esi源的设置如下：喷雾电压3.2kv；ms/ms二级扫描为数据依赖扫描方式。
[0090]
取100mg液氮研磨的组织样本，置于ep管中，加入500μl含0.1％甲酸的80％甲醇水溶液，涡旋震荡，冰浴静置5min，15000rpm、4℃离心10min，取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为60％，并置于带有0.22μm滤膜的离心管中15000g、4℃离心10min，收集滤液，进样lc-ms进行分析。从每个实验样本中取等体积的样本混匀作为qc样本。空白样本为含0.1％甲酸的60％甲醇水溶液代替实验样本，前处理过程与实验样本相同。
[0091]
将下机数据(.raw)文件导入cd搜库软件中，进行保留时间、质荷比等参数的筛选，然后对抗炎散剂与抗炎贴剂两种样品分别根据保留时间偏差0.2min和质量偏差5ppm进行峰对齐，使鉴定更加准确，随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息进行峰提取，与此同时，对峰面积进行定量，并整合目标离子，通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测，并与mzcloud和chemspider数据库进行比对，用空白样本去除背景离子，对定量结果进行归一化，最后得到数据的鉴定和定量结果。
[0092]
(1)qc样本质控。使用峰面积积分值来计算qc样本之间的相关系数，可以反映出检测过程的稳定性，相关性越高(r2越接近于1)说明整个检测过程稳定性越好，数据质量越高，越可靠。
[0093]
(2)主成分分析(pca)。pca目的是为观察样本总体的分布趋势，可以根据得分来判断抗炎散剂与抗炎贴剂之间的差异情况。将得到的数据通过线性组合进行降维处理，产生新的特征变量，即为主成分。
[0094]
(3)偏最小二乘法判别分析(pls-da)。pls-da是一种判别分析统计方法。运用偏最小二乘回归法建立代谢物量与样品类别之间关系的模型，从而预测样品的类别。各组样品的pls-da模型经7次循环交互验证得到参数r2、q2，r2为拟合能力，q2为预测能力。重新将每个样本的分组随机打乱并进行建模和预测，每次重新建模都会对应一组新的r2和q2的值，根据200次打乱并建模后的q2和r2值可以得到它们的回归线，当r2数据大于q2数据且q2回归线与y轴截距小于0时，就可以表明模型未“过拟合”。通过判断是否“过拟合”，来验证模型的可靠性。
[0095]
(4)kegg富集分析。从kegg pathway中可以到抗炎散剂与贴剂中小分子所有可能的代谢途径，从而出在差异代谢物中显著富集的代谢通路，做到将基因信息与功能信息有机结合。
[0096]
结果与讨论。通过非靶向药物代谢组分析，探讨了抗炎散剂与抗炎贴剂功效差异的生物学途径，分析了制备的新型蒙药贴剂的抗炎活性分子。(1)qc样本质控：
[0097]
如图16所示，正离子模式与负离子模式下的qc样本相关性都非常接近1，说明这种检测方法的稳定性好，所得的数据质量高。
[0098]
(2)主成分分析。对抗炎散剂与抗炎贴剂进行了pca分析，如图17所示，横坐标是样本的pc1得分情况，纵坐标是样本在pc2的得分情况，在负离子模式下，pc1得分为85.58％，正离子得分3.63％，在正离子模式下pc1得分82.03％，pc2得分4.1％。由此可见抗炎散剂与抗炎贴剂的代谢物具有分离趋势。
[0099]
(3)偏最小二乘法判别分析。如图18所示，横坐标代表了原始分组与之后的随机分组的相关性，纵坐标代表r2和q2的得分。图中正离子模式与负离子模式下r2数据均大于q2数据且q2回归线与y轴截距均小于0，由此说明模型没有出现“过拟合”，且稳定可靠，为后续分析提供保障。
[0100]
(4)kegg富集分析。经鉴定的抗炎散剂与抗炎贴剂代谢物正离子模式下有1504种，负离子模式下有1034种，第一主成分变量投影的重要度，即不同分组中代谢物差异的贡献率(variable importance in the projection，vip)；差异倍数(fold change，fc)为每个代谢物在比较组中所有生物重复定量值的均值的比值；设置阈值为vip》1.0，差异倍数fc》2.0或fc《0.5且p-value《0.05，筛选出的差异代谢物如下表所示。
[0101]
代谢物差异分析结果表
[0102][0103]
由上表所示，在正离子模式下鉴定出1504种代谢物，有差异的代谢物有350种，其中216种增加，134种下降，在负离子模式下鉴定出的代谢物有1034种，有差异的代谢物有303种，其中68种增加，235种下降。差异代谢物聚类热图19所示。
[0104]
负离子模式的差异代谢物富集到33条通路，包含显著富集的路径有3个，黄酮类化合物生物合成3个，单萜生物合成2个，四环素生物合成1个，万古霉素生物合成1个，二苯乙烯生物合成1个，嘌呤代谢1个，大环内酯类化合物的生物合成1个。正离子模式的差异代谢物富集到46条通路，包含显著富集的路径2个，黄酮类化合物生物合成3个，二苯乙烯生物合成1个，嘌呤代谢1个，花生四希酸生物合成1个，α-亚麻酸代谢1个，类胡萝卜素生物合成1个，次生代谢产物的生物合成1个，炎症介质对trp通道的调节1个。在众多的代谢路径中，黄酮类化合物生物合成与嘌呤代谢是正、负离子模式下的差异代谢物共同参与的。
[0105]
经hmdb数据库注释分析，在正离子模式下有308种化合物，在负离子模式下注释到220种化合物。其中，在正离子模式下，脂类和类脂分子有67种，苯类化合物有44种，有机酸及其衍生物有46种，苯丙酸和聚酮类有64种，生物碱及其衍生物有4种等，在负离子模式下，脂类和脂类分子84种，多酮类化合物42种，有机酸及其衍生物20种，有机氧化合物19种，木脂素4种等。根据富集结果，绘制出富集的kegg通路气泡图，如图20所示。横坐标表示富集程度，值越大，富集程度越高；点的颜代表超几何检验的p-value值，值越小说明检验的可靠
性越大、越具有统计学意义；点的大小代表相应通路中差异代谢物的数目，越大，就表示该通路内差异代谢物就越多。
[0106]
综上，非靶向药物代谢的富集代谢通路结果显示：正、负离子模式下的差异代谢物均显著富集到黄酮类化合物生物合成与嘌呤代谢中，黄酮类化合物具有抗自由基抗氧化，抗菌抗病毒以及抗炎镇痛活性，此外，单萜生物合成，大环内酯类化合物，α-亚麻酸，类胡萝卜素都具有抗炎活性，由此可见，抗炎贴剂中的有关抗炎活性的代谢途径主要有黄酮类化合物合成路径，单萜生物合成路径，大环内酯类化合物合成路径等。
[0107]
总之，本发明基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法具有能避免在纤维中出现粘连，珠串的结构，纤维形貌良好，不但，适用于非开放性创口，交联后也能适用于开放性创口，提升耐水性，改剂后能辅助药物达到长期作用效果的优点。

技术特征：

1.一种基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂，其特征在于使用由下列重量份的聚乙烯醇10、消肿九味散1-5、和适量表面活性剂及去离子水配制成纺丝溶液经静电纺丝而成的载药纳米纤维药物储库。2.根据权利要求1所述基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂，其特征在于所述表面活性剂为0.05-0.5重量份的十二烷基硫酸钠。3.根据权利要求1所述基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂，其特征在于去离子水为50-150重量份；贴剂是将静电纺丝得到的载药纳米纤维药物贮库裁成块，粘到背衬层上，使用防粘层覆盖而成。4.根据权利要求1所述基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂，其特征在于纺丝溶液是聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠放入容器中，加入去离子水，室温浸润后90℃下搅拌多个小时；冷却至室温后，加入消肿九味散，室温搅拌均匀而成。5.根据权利要求4所述基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂，其特征在于室温浸润是室温下放置30min，搅拌多个小时是搅拌3 h，室温搅拌是室温搅拌12h。6.根据权利要求1所述基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂，其特征在于载药纳米纤维药物储库室温下使用戊二醛蒸汽交联制成防水性载药纳米纤维药物储库。7.权利要求1所述基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂的制备方法，其特征在于载药纳米纤维药物储库由下列重量份的聚乙烯醇10、消肿九味散1-5、和适量表面活性剂及去离子水配制成纺丝溶液经静电纺丝而成；纺丝溶液是聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠放入容器中，加入去离子水，室温浸润后90℃下搅拌多个小时；冷却至室温后，加入消肿九味散，室温搅拌均匀而成。8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于室温浸润是室温下放置30min，搅拌多个小时是搅拌3 h，室温搅拌是室温搅拌12h。9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于所述表面活性剂为0.05-0.5重量份的十二烷基硫酸钠。10.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于载药纳米纤维药物储库室温下使用戊二醛蒸汽交联成防水性。

技术总结

本发明涉及一种基于静电纺丝制备的消肿止痛蒙药贴剂及其制备方法，为提供消肿九味散的贴剂。载药纳米纤维药物储库由下列重量份的聚乙烯醇10、消肿九味散1-5、和适量表面活性剂及去离子水配制成纺丝溶液经静电纺丝而成；纺丝溶液是聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠放入容器中，加入去离子水，室温浸润后90℃下搅拌多个小时；冷却至室温后，加入消肿九味散，室温搅拌均匀而成。所述表面活性剂为0.05-0.5重量份的十二烷基硫酸钠。载药纳米纤维药物储库室温下使用戊二醛蒸汽交联成防水性。具有能避免在纤维中出现粘连，珠串的结构，纤维形貌良好，不但，适用于非开放性创口，交联后也能适用于开放性创口，提升耐水性，改剂后能辅助药物达到长期作用效果的优点。长期作用效果的优点。长期作用效果的优点。